共聚物納米顆粒遞送LNA反基因鎖核酸對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠HBV的抑制研究

【摘要】目的探索納米載體介導(dǎo)的LNA反基因鎖核酸（LNA antigene）在乙型肝炎病毒（HBV）轉(zhuǎn)基因小鼠模型中對(duì)HBV的抑制效果。方法將LNA antigene與聚乳酸-羥基乙酸共聚物結(jié)合，制備LNA antigene納米顆粒（NP），并通過(guò)納米顆粒跟蹤分析（NTA）和Zeta電位測(cè)定其粒徑和表面電位。評(píng)估其包封率、載藥量及在HepG2肝癌細(xì)胞中的攝取效率。隨后，分析LNA antigene-NP的體外釋放特性及其對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠HBV DNA、HBsAg和HBeAg表達(dá)的抑制效果。結(jié)果成功制備LNA antigene-NP納米顆粒，其粒徑集中在125～225 nm之間，表面電位較未修飾的NP有所降低。LNA antigene-NP的包封率為32%，載藥量為8.448 mg。在HepG2肝癌細(xì)胞中，LNA antigene-NP顯示出顯著的細(xì)胞攝取效率。體外釋放實(shí)驗(yàn)顯示，LNA antigene-NP在24天內(nèi)表現(xiàn)出持續(xù)釋放的特點(diǎn)，最終釋放率接近90%。在轉(zhuǎn)基因小鼠中，LNA antigene-NP對(duì)HBV DNA、HBsAg和HBeAg的抑制效果呈劑量依賴性，5 kg/mg劑量組在第7天的抑制率分別達(dá)到約40%、60%和60%。結(jié)論LNA antigene-NP納米顆粒能夠有效抑制HBV的復(fù)制和抗原表達(dá)，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)基于LNA的抗HBV治療提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】共聚物納米顆粒；LNA反基因鎖核酸；乙型肝炎病毒；轉(zhuǎn)基因小鼠；抗病毒治療

中圖分類號(hào)：R512.6+2文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2025.01.002

Study on the inhibition of HBV in transgenic mice by the delivery of

LNA antigene through copolymer nanoparticles

WEI Wujun DENG Yibin LUO Yanhong XIAO Shurong XU Guidan

HU Rentong1abc， PENG Bin4， NONG Shunqiang5， CHEN Xiaohao1abc

（1a. Center for Medical Laboratory， 1b. Key Laboratory of Research on Clinical Molecular Diagnosis for Western Guangxi

High Incidence Diseases of Guangxi Universities， 1c. Baise Key Laboratory for Research and Development on Clinical

Molecular Diagnosis for High Incidence Diseases， 1. Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities，

Baise 533000， Guangxi， China; 2. Teaching and Research Office of Clinical Biochemistry and Molecular Biology Laboratory，

Youjiang Medical University for Nationalities， Baise 533000， Guangxi， China; 3. Department of Clinical Laboratory， the

First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning 530000， Guangxi， China; 4. Department

of Clinical Laboratory， Affiliated Hospital of Guilin Medical University， Guilin 541000， Guangxi， China;

5. Department of Clinical Laboratory， Baise People's Hospital， Baise 533000， Guangxi， China）

【Abstract】ObjectiveTo investigate the inhibitory effects of nanoparticle-mediated locked nucleic acid antigene （LNA antigene） on hepatitis B virus （HBV） in transgenic mouse model. MethodsLNA antigene was conjugated with polylactic acid-glycolic acid （PLGA） to prepare LNA antigene nanoparticles （NPs）， and particle size and surface charge were determined by nanoparticle tracking analysis （NTA） and Zeta potential measurement. Encapsulation efficiency， drug loading capacity， and uptake efficiency in HepG2 hepatocellular carcinoma cells were evaluated. Subsequently， the in vitro release characteristics of LNA anti gene NP and its inhibitory effects on the expressions of HBV DNA， HBsAg， and HBeAg in transgenic mice were analyzed. ResultsLNA antigene-NP was successfully prepared with a particle size ranging from 125 nm to 225 nm， and a lower surface charge compared to unmodified NPs. The encapsulation efficiency of LNA antigene-NP was 32%， and drug loading capacity was 8.448 mg. LNA antigene-NP exhibited significant cellular uptake efficiency in HepG2 hepatocellular carcinoma cells. The in vitro release studies demonstrated a sustained release over 24 days， with a final release rate approaching 90%. In the transgenic mouse model， LNA antigene-NP exhibited dose-dependent inhibition of HBV DNA， HBsAg， and HBeAg， with 5 kg/mg dose group achieving inhibition rates of about 40%， 60%， and 60% on day 7， respectively. ConclusionLNA antigene-NP can effectively inhibit HBV replication and antigen expression， which provides an experimental basis for further development of LNA-based anti-HBV therapies.

【Keywords】copolymer nanoparticles; locked nucleic acid antigene （LNA antigene）; hepatitis B virus （HBV）; transgenic mice; antiviral therapy

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus， HBV）是一種對(duì)全球健康構(gòu)成重大威脅的病毒，每年有近100萬(wàn)人因HBV相關(guān)疾病死亡［1］。盡管已有強(qiáng)效疫苗，但HBV的傳播和防治仍然面臨巨大挑戰(zhàn)［2］。HBV基因組為一個(gè)3.2 kb的部分雙鏈環(huán)狀DNA，包含四個(gè)開(kāi)放閱讀框（分別為S、C、P和X），其中的C基因與病毒復(fù)制和免疫逃逸密切相關(guān)［3］。HBV的生物學(xué)復(fù)雜性體現(xiàn)在其共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）在肝細(xì)胞核內(nèi)的持久存在，導(dǎo)致現(xiàn)有抗病毒藥物難以清除病毒［4-5］。鎖核酸（locked nucleic acid， LNA）是一種新型核酸類似物，因其在反義寡核苷酸和小干擾RNA中的應(yīng)用，廣泛用于癌癥和病毒感染的治療［6］。LNA反基因鎖核酸（locked nucleic acid antigene， LNA antigene）能夠特異性地靶向基因組DNA，抑制基因轉(zhuǎn)錄和病毒復(fù)制，近年來(lái)其在HBV的研究中引起了廣泛關(guān)注［8］。先前的研究顯示，靶向HBV S基因的LNA antigene能夠有效抑制HBV轉(zhuǎn)基因小鼠中HBV DNA的復(fù)制及抗原表達(dá)［8］，這為進(jìn)一步探索針對(duì)其他關(guān)鍵基因（如C基因）的治療提供了依據(jù)。然而，LNA的靶標(biāo)選擇、遞送效率及長(zhǎng)期安全性仍面臨諸多挑戰(zhàn)，這需要通過(guò)進(jìn)一步研究加以優(yōu)化［9-10］，以確保其在臨床應(yīng)用中的有效性和安全性。

近年來(lái)，納米材料憑借其獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)，如高表面體積比、可調(diào)表面電荷和化學(xué)基團(tuán)，成為新型抗病毒療法的重要研究方向［11］?？共《炯{米材料能夠直接干擾病毒的生命周期，分解病毒核酸或抗生素耐藥基因，從而抑制病毒傳播［12］。其中，基于聚乳酸-羥基乙酸（PLGA）的共聚物納米顆粒（nanoparticle， NP）在抗病毒治療中得到了廣泛應(yīng)用［13］。研究表明，PLGA納米顆粒在乙型肝炎疫苗遞送中能夠通過(guò)緩慢釋放抗原，顯著增強(qiáng)體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)［14］。此外，PLGA納米顆粒還能夠減少傳統(tǒng)疫苗的副作用，并為非侵入性遞送方式提供了可能［15］?；贖BV感染的現(xiàn)有治療手段存在局限性，本研究結(jié)合PLGA納米顆粒技術(shù)，制備靶向HBV C基因的LNA antigene納米顆粒，旨在評(píng)估其在轉(zhuǎn)基因小鼠模型中對(duì)HBV的抑制效果，為未來(lái)的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法1.1材料HepG2肝癌細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保存委員會(huì)（GNHu39）。HBV轉(zhuǎn)基因小鼠模型（C57BL/6）購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司［許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0011］。LNA antigene由上海生工生物工程股份有限公司合成。無(wú)菌雙蒸水（ddH2O）購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司（DG104730）。10%葡萄糖溶液購(gòu)自石家莊四藥有限公司（50-99-7）。PLGA（分子量：30 000 Da，乳酸：羥基乙酸比例=50∶50，P2191）購(gòu)自Sigma-Aldrich。胎牛血清（FBS）（10270-106）、青霉素-鏈霉素（15140-122）和高糖DMEM培養(yǎng)基（11965-092）購(gòu)自Gibco。5-熒光素基醋酸酯（FAM）購(gòu)自Sigma-Aldrich（F1321）。多聚甲醛溶液（P1110）和DAPI染料（C0065）購(gòu)自Beijing Solarbio Science amp; Technology Co.， Ltd.。吐溫80購(gòu)自Sigma-Aldrich（P4780）。恩替卡韋（ETV）購(gòu)自Sigma-Aldrich（SML1229）。4% EDTA溶液購(gòu)自Sigma-Aldrich（E5134）。HBV DNA定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自湖南圣湘生物科技股份有限公司（SP2910）。HBsAg（AU3-2100）和HBeAg定量檢測(cè)試劑盒（AU3-2400）購(gòu)自鄭州安圖生物工程股份有限公司。熒光顯微鏡使用Nikon Eclipse Ti型號(hào)。納米粒度和Zeta電位分析儀使用Malvern Zetasizer Nano ZS型號(hào)。紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)使用Thermo Scientific NanoDrop 2000型號(hào)。

1.2方法

1.2.1LNA antigene的合成LNA antigene的合成基于HBV的C基因序列。從小鼠血清中提取HBV病毒DNA，使用離心柱法進(jìn)行提取。通過(guò)從NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取完整的HBV基因序列（U95551.1；GI：2182117），使用Primer Premier 5.0和Oligo 6.0等軟件設(shè)計(jì)、篩選并評(píng)估靶向HBV C基因保守核苷酸序列的引物。對(duì)設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行BLAST同源性分析，并將HBV C基因的特異性序列送至上海生工生物工程股份有限公司合成。HBV C基因的上游引物序列：5'-GACCGACCTTGAGGCATACT-3'，下游引物序列：5'-TCCCCACCTTATGAGTCCAA-3'。

1.2.2LNA antigene-NP的制備將儲(chǔ)存在-20 ℃的LNA antigene（0.33 μg/OD）取出，室溫放置15 min后，以356 xg的轉(zhuǎn)速離心1 min，然后加入100 μL ddH2O并混勻，制備成濃度為0.33 μg/μL的LNA溶液。取1.5 mL無(wú)菌EP管，依次加入100 μL的10%葡萄糖和LNA antigene溶液，并用ddH2O將總體積補(bǔ)足至200 μL，渦旋混合后，以356 xg的轉(zhuǎn)速離心30 s，得到5%葡萄糖-LNA antigene混合液，標(biāo)記為溶液Ⅰ。另取一個(gè)1.5 mL無(wú)菌EP管，依次加入100 μL的10%葡萄糖和PLGA，PLGA的用量計(jì)算為0.16 μL/μg LNA antigene。然后用ddH2O將總體積補(bǔ)足至200 μL，渦旋混合后，以356 xg的轉(zhuǎn)速離心30 s，得到5%葡萄糖-PLGA混合液，標(biāo)記為溶液Ⅱ。將溶液Ⅰ和溶液Ⅱ混合，渦旋混勻后得到400 μL的5%葡萄糖-PLGA-LNA antigene混合物。然后以356 xg的轉(zhuǎn)速離心30 s，立即在4 ℃下使用該混合物進(jìn)行轉(zhuǎn)染，以將PLGA包裹的LNA antigene引入HBV轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)。

1.2.3粒徑和Zeta電位測(cè)定LNA antigene-NP的粒徑和Zeta電位通過(guò)納米粒度和Zeta電位分析儀測(cè)定。將適量的納米顆粒懸浮于去離子水中，調(diào)節(jié)濃度至1 mg/mL后，在25 ℃下進(jìn)行測(cè)量。每個(gè)樣品均測(cè)量三次，并記錄平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.4包封率與載藥量的測(cè)定采用間接法，使用核酸/蛋白分析儀測(cè)定載體對(duì)LNA antigene的包封率和載藥量。計(jì)算公式如下：包封率=（實(shí)際包封的藥物量/總投入藥物量）×100%；載入率=（納米粒子總質(zhì)量/實(shí)際包封的藥物量）×100%。每個(gè)樣品均測(cè)定三次，取平均值。將離心收集后的納米顆粒凍干，稱取干粉重量。

1.2.5HepG2肝癌細(xì)胞培養(yǎng)與處理將HepG2肝癌細(xì)胞在含10% FBS和1%青霉素-鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37 ℃，5% CO2條件下維持培養(yǎng)至約80%匯合度。隨后，將細(xì)胞以1×105細(xì)胞/mL的密度接種于24孔板中，并在培養(yǎng)板底部放置無(wú)菌蓋玻片。在細(xì)胞貼壁后，用PBS輕輕洗滌兩次，分別添加含有PBS、未修飾納米顆粒（NP）或LNA antigene-NP（200 nM LNA antigene濃度）的培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育24 h。

1.2.6FAM熒光標(biāo)記和攝取分析為分析LNA antigene-NP在HepG2肝癌細(xì)胞中的攝取效率，用FAM標(biāo)記LNA antigene。處理后的細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，移除培養(yǎng)基，用PBS洗滌兩次，并用4%多聚甲醛溶液固定10 min。固定后的細(xì)胞用PBS洗滌兩次，并用DAPI染色10 min，隨后用PBS洗滌以去除多余染料。最后，使用熒光顯微鏡觀察并記錄FAM和DAPI信號(hào)，通過(guò)合并兩種熒光信號(hào)來(lái)分析LNA antigene-NP在細(xì)胞內(nèi)的分布情況。

1.2.7LNA antigene-NP的體外釋放動(dòng)力學(xué)分析LNA antigene-NP的體外釋放實(shí)驗(yàn)在模擬體液（PBS，pH 7.4）中進(jìn)行。將一定量的LNA antigene-NP懸浮于含有0.5%（w/v）吐溫80的PBS中，置于37 ℃的恒溫?fù)u床中（100 rpm）。在預(yù)定的時(shí)間點(diǎn)（2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24天），取樣并離心（12 000 rpm，4 ℃，10 min），收集上清液，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定260 nm處的吸光度，計(jì)算LNA antigene的累積釋放量。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次，取平均值，并繪制釋放曲線。

1.2.8動(dòng)物模型與實(shí)驗(yàn)分組本實(shí)驗(yàn)使用HBV轉(zhuǎn)基因小鼠模型。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院提供的清潔動(dòng)物房中進(jìn)行，所有操作均符合Covance的要求及《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》，并獲得右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理批準(zhǔn)編號(hào)：YYFY-LL-2023-121）。所有動(dòng)物在符合條件的屏障環(huán)境中飼養(yǎng)，溫度維持在（22±2）℃，濕度控制在50%～60%，并提供12 h光暗周期。實(shí)驗(yàn)前，所有小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周。將8周齡雄性HBV轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為5組，每組6只小鼠，分別為：PBS對(duì)照組、低劑量組（0.5 mg/kg）、中劑量組（2 mg/kg）、高劑量組（5 mg/kg）和ETV陽(yáng)性對(duì)照組（0.5 mg/kg）。

1.2.9LNA antigene-NP的給藥與處理三個(gè)劑量組通過(guò)尾靜脈注射LNA antigene-NP，劑量分別為0.5 mg/kg、2 mg/kg和5 mg/kg，注射體積為200 μL。ETV陽(yáng)性對(duì)照組將ETV溶解于PBS中并以0.5 mg/kg的劑量口服灌胃給藥，PBS對(duì)照組則注射等體積的PBS溶液。各組小鼠均在每天相同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行處理，連續(xù)給藥7天。

1.2.10血清HBV DNA的定量檢測(cè)在第1天、第3天、第5天、第7天通過(guò)眼眶采血法收集小鼠眼眶血約200 μL，使用4%EDTA溶液抗凝，離心（4 ℃，3000 rpm，10 min）后分離血清并保存于-80 ℃以備后續(xù)分析。通過(guò)熒光定量PCR（qPCR）檢測(cè)HBV DNA的抑制率，使用HBV DNA定量檢測(cè)試劑盒按照制造商說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.11血清HBsAg和HBeAg的定量檢測(cè)分別使用HBsAg定量檢測(cè)試劑盒和HBeAg定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)HBsAg和HBeAg的抑制率，依據(jù)制造商說(shuō)明書，采用ELISA法測(cè)定。各項(xiàng)指標(biāo)的抑制率計(jì)算基于對(duì)照組與處理組的差異。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。兩組間差異采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間差異采用單因素方差分析（One-way analysis of variance，One-way ANOVA）。如果One-way ANOVA顯示顯著性差異，進(jìn)一步采用Dunnett's檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2結(jié)果2.1LNA antigene-NP的制備及其粒徑和表面電位特性分析PLGA納米載體的制備流程圖顯示LNA antigene與PLGA材料的聚合過(guò)程，成功制備LNA antigene-NP（圖1A）。NTA檢測(cè)結(jié)果顯示，未修飾NP的粒徑主要分布在100～200 nm之間，而LNA antigene-NP的粒徑分布則略有增加，集中在125～225 nm之間（圖1B）。Zeta電位檢測(cè)結(jié)果表明，LNA antigene-NP的表面電位（接近-30 Zeta電位）較未修飾的NP有所降低（-20 Zeta電位）（t=8.490，P＜0.001）（圖1C）。

2.2LNA antigene-NP納米粒子的包封率和載藥量LNA antigene的總投入量為8 OD（LNA antigene 10 OD=33 mg），PLGA總投入量為100 mg，納米粒子產(chǎn)物約 50 mg。計(jì)算納米粒子對(duì)LNA antigene的包封率為32%（n=3），載藥量為8.448 mg，載入率為16.90%。

2.3LNA antigene-NP在HepG2肝癌細(xì)胞中的攝取效率分析與PBS組相比，NP組的FAM信號(hào)有所增強(qiáng)。FAM信號(hào)的強(qiáng)度反映NP的攝取情況，表明部分NP被細(xì)胞攝取。而在LNA antigene-NP組中，F(xiàn)AM信號(hào)明顯增強(qiáng)，且在細(xì)胞質(zhì)中均勻分布，顯示出LNA antigene-NP被細(xì)胞廣泛攝取，并有效進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)（圖2）。

2.4LNA antigene-NP的體外釋放動(dòng)力學(xué)分析LNA antigene-NP在0至24天內(nèi)顯示出持續(xù)釋放的特點(diǎn)，其中在前4天釋放速率較快，釋放率達(dá)到約60%，隨后釋放速率逐漸減緩，在第8天時(shí)釋放率達(dá)到約80%，并在接下來(lái)的時(shí)間段內(nèi)趨于平穩(wěn)，最終釋放率接近90%（圖3）。

2.5LNA antigene-NP對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠HBV復(fù)制和抗原表達(dá)的抑制效果分析在LNA antigene-NP處理轉(zhuǎn)基因小鼠后的不同時(shí)間點(diǎn)，觀察到對(duì)HBV DNA、HBsAg及HBeAg的抑制效果存在劑量依賴性。在處理的第1天，各劑量組均顯示出一定程度的抑制效果，其中高劑量組（5 mg/kg）對(duì)HBV DNA的抑制率最高，隨后抑制效果逐漸增加并在第7天達(dá)到約40%；中等劑量組（2 mg/kg）顯示出中等抑制效果，HBV DNA的抑制率在第7天達(dá)到約20%；低劑量組（0.5 mg/kg）顯示出較低的抑制效果，HBV DNA的抑制率在第7天維持在約10%。第7天時(shí)，與0 mg/kg組相比，5 mg/kg LNA antigene-NP處理顯著提高了對(duì)HBV DNA的抑制率［F（4，10）=1057，P＜0.001，Dunnett's 檢驗(yàn)P＜0.001］。然而，5 mg/kg LNA antigene-NP對(duì)HBV DNA的抑制率顯著低于ETV組［F（4，10）=1057，P＜0.001，Dunnett's檢驗(yàn)P＜0.001］。見(jiàn)圖4A。

不同濃度LNA antigene-NP對(duì)HBsAg和HBeAg的抑制效果與HBV DNA的趨勢(shì)相似，高劑量組在第7天對(duì)HBsAg和HBeAg的抑制率均達(dá)到60%左右。第7天時(shí)，與0 mg/kg組相比，5 mg/kg LNA antigene-NP處理顯著提高對(duì)HBsAg的抑制率［F（4，10）=2984，P＜0.001，Dunnett's檢驗(yàn)P＜0.001］，而對(duì)HBsAg的抑制率顯著低于ETV組［F（4，10）=2984，P＜0.001，Dunnett's檢驗(yàn)P＜0.001］。見(jiàn)圖4B。同理，與0 mg/kg組相比，5 mg/kg LNA antigene-NP處理顯著提高對(duì)HBeAg的抑制率［F（4，10）=4202，P＜0.001，Dunnett's檢驗(yàn)P＜0.001］，而對(duì)HBeAg的抑制率顯著低于ETV組［F（4，10）=4202，P＜0.001，Dunnett's 檢驗(yàn)P＜0.001］。見(jiàn)圖4C。

3討論HBV是一種全球性健康威脅，其慢性感染可導(dǎo)致嚴(yán)重的肝臟疾病，包括肝硬化和肝細(xì)胞癌［2］。近年來(lái)，NP作為藥物遞送系統(tǒng)在HBV治療中取得顯著進(jìn)展，通過(guò)提高靶組織的藥物濃度、延長(zhǎng)釋放時(shí)間并減少全身副作用，從而顯著增強(qiáng)抗病毒效果［16］。例如，NP遞送的siRNA和mRNA已被證明能有效抑制HBV復(fù)制和抗原表達(dá)，顯示出清除感染的潛力［17-20］。本研究選擇LNA antigene這一特異性靶向HBV基因組的策略，并將其與PLGA-NP結(jié)合，旨在提高遞送效率和增強(qiáng)抗病毒效果。研究表明，PLGA納米顆粒的尺寸主要在300 nm以內(nèi)，絕對(duì)Zeta電位接近20 mV［21］。納米顆粒跟蹤分析檢測(cè)結(jié)果顯示，LNA antigene-NP的粒徑分布（125～225 nm）略大于未裝載的PLGA-NP（100～200 nm）。本研究中LNA antigene的加入導(dǎo)致PLGA納米顆粒粒徑增大的現(xiàn)象，這與其他研究的發(fā)現(xiàn)一致，即siRNA納米顆粒的尺寸與載藥量和表面修飾密切相關(guān)［22］。

PLGA納米載體因其良好的生物相容性、可降解性和藥物遞送特性，廣泛應(yīng)用于藥物遞送和基因治療領(lǐng)域。PLGA納米顆粒通過(guò)納米沉淀法自發(fā)組裝形成穩(wěn)定的納米顆粒［23］。這一自發(fā)組裝過(guò)程可控制顆粒的粒徑、形狀和表面性質(zhì)，從而優(yōu)化其在體內(nèi)的遞送效果。例如，調(diào)節(jié)制備條件可以實(shí)現(xiàn)PLGA-PEG納米顆粒的粒徑可調(diào)性，從而提高藥物遞送的可重復(fù)性和療效預(yù)測(cè)性［24］。此外，PLGA納米顆粒的自發(fā)組裝特性能夠包封大分子藥物或核酸，并通過(guò)調(diào)節(jié)降解速率實(shí)現(xiàn)藥物緩釋［25］。本研究的LNA antigene-NP表面電位接近-30 mV，表明其在水相環(huán)境中的穩(wěn)定性良好。與文獻(xiàn)報(bào)道的PLGA-Lipid混合納米顆粒相比，這種PLGA納米顆粒也具有較低的表面電位，有助于其在體內(nèi)循環(huán)中的穩(wěn)定性［23］。本研究通過(guò)優(yōu)化自發(fā)組裝過(guò)程，LNA antigene包封效率和藥物遞送特性得到了顯著提高，這可能與PLGA納米顆粒自發(fā)組裝形成的緊密聚合結(jié)構(gòu)有關(guān)［26］。這種自發(fā)組裝納米顆粒在體外和體內(nèi)均表現(xiàn)出良好的藥物釋放行為，呈現(xiàn)出典型的兩階段釋放模式［26］。研究表明，PLGA納米顆粒在核酸藥物遞送中具備良好的控制釋放能力，能夠?qū)崿F(xiàn)初期快速釋放和后續(xù)持續(xù)釋放的雙重效果［27］。本研究中，LNA antigene-NP展現(xiàn)出類似的釋放特性，初期釋放較快，隨后趨于平穩(wěn)，最終實(shí)現(xiàn)接近90%的藥物釋放。這種釋放模式與文獻(xiàn)報(bào)道的PLGA載體特性一致，表明LNA antigene-NP在控制藥物釋放方面具有潛力，為長(zhǎng)效基因治療提供了前景。

此外，LNA antigene-NP在HepG2肝癌細(xì)胞中的攝取效率顯著高于未修飾的NP，這表明LNA antigene-NP能夠更有效地進(jìn)入細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)分布均勻，提示LNA antigene-NP可能通過(guò)內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞。LNA antigene-NP不僅能夠有效抑制HBV DNA、HBsAg和HBeAg的表達(dá)，還在劑量依賴性方面表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗病毒活性，這與先前研究中的NP遞送系統(tǒng)結(jié)果相一致。GAO等人［17］制備的PreS/2-21修飾的siRNA納米顆粒對(duì)HBV模型小鼠HBV DNA、HBeAg和 HBsAg的抑制率分別為24.43%、55.45%和38.79%，與本研究5 mg/kg LNA antigene-NP的抑制率（40%～60%）相似。這種顯著的抑制作用可能與LNA antigene通過(guò)與HBV基因組互補(bǔ)結(jié)合，阻斷病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄有關(guān)［10］。然而，低劑量組的抑制效果相對(duì)較弱，這提示在臨床應(yīng)用中需要精確控制劑量以達(dá)到最佳治療效果。

盡管本研究取得了較為積極的結(jié)果，但仍存在一些局限性。首先，LNA antigene-NP的包封率和載藥量仍有提升空間，這對(duì)進(jìn)一步提高其治療效果至關(guān)重要。其次，本研究?jī)H在轉(zhuǎn)基因小鼠模型中進(jìn)行了初步驗(yàn)證，尚未在其他動(dòng)物模型或臨床前試驗(yàn)中進(jìn)行廣泛測(cè)試，因此其安全性和有效性仍需進(jìn)一步評(píng)估。此外，本研究中的LNA antigene-NP制備工藝較為復(fù)雜，在實(shí)際生產(chǎn)和應(yīng)用中可能存在一定挑戰(zhàn)，未來(lái)需要開(kāi)發(fā)更為簡(jiǎn)便和高效的制備方法。

總之，本研究通過(guò)納米載體技術(shù)成功制備LNA antigene-NP，并系統(tǒng)評(píng)估其在體外和體內(nèi)的表現(xiàn)，結(jié)果顯示LNA antigene-NP具有良好的藥物釋放特性和顯著的抗HBV活性。盡管尚存在一些需要優(yōu)化的方面，但該研究為L(zhǎng)NA基因治療的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供了重要依據(jù)。未來(lái)，隨著納米載體技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，LNA antigene-NP有望成為一種安全有效的抗HBV基因治療新策略。參考文獻(xiàn)［1］ NASSER N， TONNERRE P， MANSOURI A， et al. Hepatitis-B virus：replication cycle，targets，and antiviral approaches［J］. Curr Opin Virol， 2023， 63：101360.

［2］ ASANDEM D A， SEGBEFIA S P， KUSI K A， et al. Hepatitis B virus infection：a mini review［J］. Viruses， 2024， 16（5）：724.

［3］ ZHOU H， WANG X M， STEER C J， et al. Efficient silencing of hepatitis B virus S gene through CRISPR-mediated base editing［J］.Hepatol Commun， 2022， 6（7）：1652-1663.

［4］ LOK J， GUERRA VELOZ M F， AGARWAL K. Overview of new targets for hepatitis B virus：immune modulators，interferons，bifunctional peptides，therapeutic vaccines and beyond［J］. Clin Liver Dis， 2023， 27（4）：857-876.

［5］ TSUKUDA S， WATASHI K. Hepatitis B virus biology and life cycle［J］. Antiviral Res， 2020， 182：104925.

［6］ KAMALI M J， SALEHI M， FATEMI S， et al. Locked nucleic acid （LNA）：a modern approach to cancer diagnosis and treatment［J］. Exp Cell Res， 2023， 423（1）：113442.

［7］ DENG Y B， QIN H J， LUO Y H， et al. Blocking the expression of the hepatitis B virus S gene in hepatocellular carcinoma cell lines with an anti-gene locked nucleic acid in vitro［J］. Genet Mol Res， 2015， 14（2）：5445-5451.

［8］ XIAO S R， XU G D， WEI W J， et al. Antiviral effects of hepatitis B virus S gene-specific anti-gene locked nucleic acid in transgenic mice［J］. World J Clin Cases， 2018， 6（8）：183-191.

［9］ DENG Y B， QIN H J， LUO Y H， et al. Antiviral effect of hepatitis B virus S/C gene loci antisense locked nucleic acid on transgenic mice in vivo［J］. Genet Mol Res， 2015， 14（3）：10087-10095.

［10］ JAVANBAKHT H， MUELLER H， WALTHER J， et al. Liver-targeted anti-HBV single-stranded oligonucleotides with locked nucleic acid potently reduce HBV gene expression in vivo［J］. Mol Ther Nucleic Acids， 2018， 11：441-454.

［11］ AKILESH M S， WADHWANI A. Novel applications of nanotechnology in controlling HIV and HSV infections［J］. Curr Drug Res Rev， 2021， 13（2）：120-129.

［12］ KIM E， LIM E K， PARK G， et al. Advanced nanomaterials for preparedness against （Re-） emerging viral diseases［J］. Adv Mater， 2021， 33（47）：e2005927.

［13］ ZHU J H， QIN F H， JI Z H， et al. Mannose-modified PLGA nanoparticles for sustained and targeted delivery in hepatitis B virus immunoprophylaxis［J］. AAPS PharmSciTech， 2019， 21（1）：13.

［14］ MOHAMMED M M， NAIF H M. Poly（lactide-co-glycolide） nanoparticle-mediated vaccine delivery of encapsulated surface antigen protein of hepatitis B virus elicits effective immune response［J］. Viral Immunol， 2022， 35（2）：112-121.

［15］ ZHENG X L， ZHU J H， ZHENG C H， et al. Dissolving microneedle arrays as a hepatitis B vaccine delivery system adjuvanted by APC-targeted poly （lactic-co-glycolic acid） （PLGA） nanoparticles［J］. AAPS PharmSciTech， 2023， 24（1）：42.

［16］ MIAO J， GAO P， LI Q， et al. Advances in nanoparticle drug delivery systems for anti-hepatitis B virus therapy：a narrative review［J］. Int J Mol Sci， 2021， 22（20）：11227.

［17］ GAO L X， YANG J， FENG J T， et al. PreS/2-21-guided siRNA nanoparticles target to inhibit hepatitis B virus infection and replication［J］. Front Immunol， 2022， 13：856463.

［18］ DU Y Q， YANG X L， LI J， et al. Delivery of toll-like receptor 3 ligand poly（I：C） to the liver by calcium phosphate nanoparticles conjugated with an F4/80 antibody exerts an anti-hepatitis B virus effect in a mouse model［J］. Acta Biomater， 2021， 133：297-307.

［19］ KHORENKO M， RAND U， CICIN-SAIN L， et al. Foscarnet-type inorganic-organic hybrid nanoparticles for effective antiviral therapy［J］. ACS Biomater Sci Eng， 2022， 8（4）：1596-1603.

［20］ SHEN Z L， ZHANG S Y， JIANG Q R， et al. Lipid nanoparticle-mediated delivery of IL-21-encoding mRNA induces viral clearance in mouse models of hepatitis B virus persistence［J］. J Med Virol， 2023， 95（9）：e29062.

［21］ CHIU H I， SAMAD N A， FANG L Z， et al. Cytotoxicity of targeted PLGA nanoparticles：a systematic review［J］. RSC Adv， 2021， 11（16）：9433-9449.

［22］ KAMANZI A， GU Y F， TAHVILDARI R， et al. Simultaneous，single-particle measurements of size and loading give insights into the structure of drug-delivery nanoparticles［J］. ACS Nano， 2021， 15（12）：19244-19255.

［23］ PRAMUAL S， LIRDPRAPAMONGKOL K， ATJANASUPPAT K， et al. PLGA-lipid hybrid nanoparticles for overcoming paclitaxel tolerance in anoikis-resistant lung cancer cells［J］. Molecules， 2022， 27（23）：8295.

［24］ MARES A G， PACASSONI G， MARTI J S， et al. Formulation of tunable size PLGA-PEG nanoparticles for drug delivery using microfluidic technology［J］. PLoS One， 2021， 16（6）：e0251821.

［25］ SCHREINER J， RINDT C， WCHTER J， et al. Influence of drug molecular weight on self-assembly and intestinal permeation of polymer-based nanocarriers［J］. Int J Pharm， 2023， 646：123483.

［26］ CHINTAPULA U， YANG S， NGUYEN T， et al. Supramolecular peptide nanofiber/PLGA nanocomposites for enhancing pulmonary drug delivery［J］. ACS Appl Mater Interfaces， 2022， 14（51）：56498-56509.

［27］ GARLAND K M， SEVIMLI S， KILCHRIST K V， et al. Microparticle depots for controlled and sustained release of endosomolytic nanoparticles［J］. Cell Mol Bioeng， 2019， 12（5）：429-442.

（收稿日期：2024-08-28修回日期：2024-10-10）

（編輯：王琳葵 潘明志）