雞滑液囊支原體HB-MS分離株致病性研究

摘 要：為深入研究河北省某蛋雞場支原體病發(fā)病和迅速擴(kuò)散的原因，本研究對現(xiàn)場的致病因子開展了病原學(xué)和生物學(xué)特性的研究。采集病雞上顎裂粘液樣本，通過細(xì)菌生物學(xué)特性分析、形態(tài)觀察、PCR檢測、測序和動(dòng)物回歸試驗(yàn)等，成功分離并純化到了一株雞滑液囊支原體。結(jié)果表明分離株HB-MS可降解葡萄糖產(chǎn)酸使培養(yǎng)基變黃色，在顯微鏡下可以觀察到經(jīng)典“荷包蛋”狀菌落，符合支原體的生物學(xué)特征；SPF雞致病性試驗(yàn)分析顯示，HB-MS具有較強(qiáng)致病性，并能再次分離到；遺傳進(jìn)化分析顯示，本次分離的HB-MS株與現(xiàn)有支原體親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。以上研究結(jié)果為蛋雞支原體防控提供了重要的科學(xué)依據(jù)，有助于制訂有效的治療和預(yù)防策略。

關(guān)鍵詞：雞滑液囊支原體；分離鑒定；致病性試驗(yàn)；藥敏試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：S858.31 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1673-1085（2025）01-0048-05

雞支原體感染（Mycoplasma gallisepticum infection），又稱慢性呼吸道?。–RD），可以長期潛伏在雞群中。感染后的雞只會(huì)出現(xiàn)一系列臨床癥狀，包括呼吸困難、咳嗽、打噴嚏、鼻腔和眼瞼分泌物增多等[1]。主要通過呼吸道飛沫、直接接觸及垂直傳播等途徑傳播，污染的飼料、水和設(shè)備也可能成為感染的媒介。由于支原體沒有細(xì)胞壁，對許多常用的抗生素如青霉素類和頭孢菌素類具有天然耐藥性，因此治療起來相對困難[2]。診斷雞支原體感染通常需要綜合考慮臨床癥狀、流行病學(xué)信息以及實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果。其中，PCR技術(shù)因其高靈敏度和特異性，已成為診斷支原體感染的常用方法[3，12-14]。

對某肉雞場區(qū)內(nèi)支原體發(fā)病情況開展持續(xù)性監(jiān)測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，外地運(yùn)輸來的一批飼料中攜帶支原體，致使支原體在該場迅速傳播，發(fā)病雞表現(xiàn)腳墊腫大、腿關(guān)節(jié)化膿性炎癥以及呼吸道炎癥等臨床癥狀，兩周內(nèi)雞群整體患病率為70%，病死率高達(dá)55%。

1" 材料與方法

1.1" 材料

雞滑液囊支原體改良Frey液體培養(yǎng)基、改良Frey固體培養(yǎng)基均購自北京中海生物科技有限公司中海生物科技（棗莊）有限公司，雞滑液囊支原體MS-HB分離株由北京華都峪口家禽研究院分離并保存。試驗(yàn)過程中使用的SPF雞胚購自于北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司。

1.2" HB-MS分離株的分離培養(yǎng)與純化

送檢病雞每日死亡6～8只，呈現(xiàn)典型的呼吸道癥狀，腳墊、腿關(guān)節(jié)處出現(xiàn)腫脹，喜臥拒食。滅菌棉拭子采集上腭裂處粘液，溶于滅菌PBS（pH=7.4），經(jīng)過0.45 μm濾器過濾，將濾液以1：4置于支原體液體培養(yǎng)基中，同時(shí)做3個(gè)重復(fù)，置于37 ℃有氧溫箱中培養(yǎng)，待培養(yǎng)基顏色變黃后進(jìn)行傳代3次，后接種于支原體固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～5 d，每間隔12 h觀察一次，低倍鏡下可見典型的“荷包蛋”樣菌落，挑單菌轉(zhuǎn)移至支原體液體培養(yǎng)基中增菌培養(yǎng)，上述過程需重復(fù)3次，以確保單菌落的純化效果，所得純化菌液保存于-80℃待用。

1.3" 臨床分離株MS基因檢測

使用Primer Primer 6.0設(shè)計(jì)MS基因片段擴(kuò)增引物（P：5’-CAACCCTCCAGGTCAACTCT-3’；R：5′-CTCTTAACAGGATTCCAGCATGT-3’），片段大小為124 bp。PCR反應(yīng)體系20 μL：DNA模版2 μL，上、下游引物各1 μL，2×Taq MasterMix 10 μL，ddH2O 6 μL。PCR擴(kuò)增程序設(shè)置：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性45 min；55 ℃ 退火30 min；72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)。5 mL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，以Gel Extraction Kit（200）膠回收試劑盒回收純化目的條帶，純化產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行雙向測通。使用DNA star軟件，將所得基因序列與經(jīng)典株進(jìn)行同源性比較。

1.4" 致病性試驗(yàn)

將30只45日齡SPF雞平均分為3組，試驗(yàn)1組經(jīng)腳墊注射HB-MS菌液，濃度為106 CCU/mL，0.5 mL/只；試驗(yàn)2組經(jīng)腳墊注射HB-MS菌液，濃度為107 CCU/mL，0.5 mL/只；試驗(yàn)3組經(jīng)腳墊注射支原體改良Frey液體培養(yǎng)基，0.5 mL/只；每間隔12 h觀察雞群情況，攻毒14 d后剖檢觀察病理變化。

2" 結(jié)果

2.1" 菌落形態(tài)及初步鑒定

過濾的菌液接種于支原體液體培養(yǎng)基24 h后出現(xiàn)顏色變化，40 h后液面呈亮黃色（圖1A）；接種于支原體固體培養(yǎng)基40 h后肉眼可見大量針尖狀、透明樣菌落（圖1B），電子顯微鏡4倍下可見經(jīng)典“荷包蛋”菌落（圖1C）。綜合支原體液體培養(yǎng)基中的指示劑因葡萄糖被分解產(chǎn)酸而變色、典型的支原體菌落形態(tài)等結(jié)果，可初步判定分離菌株HB-MS為支原體。

2.2" PCR鑒定及遺傳進(jìn)化分析結(jié)果

PCR分別對HB-MS分離株的MS基因進(jìn)行擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示MS基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物位于124 bp處，與預(yù)期條帶大小相符（圖2），空白對照無條帶出現(xiàn)。與GenBank中已登錄的禽源支原體MS基因部分核苷酸序列進(jìn)行同源性比較，顯示HB-MS分離株與其他12株支原體親緣性較遠(yuǎn)（圖3）。

2.3" 致病性結(jié)果

混合感染后第14天，對所有試驗(yàn)組和對照組的雞進(jìn)行剖檢，重點(diǎn)觀察了氣囊、腳墊的病理變化。試驗(yàn)組死亡情況見表1，且試驗(yàn)1組、2組雞的氣囊、腳墊均出現(xiàn)不同程度的病理變化（圖4）。腳墊組織病理學(xué)結(jié)果顯示，其疏松結(jié)締組織水腫，并伴有大量炎性細(xì)胞浸潤（圖5）。

3" 討論

雞滑液囊支原體嚴(yán)重危害我國養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展，可水平和垂直傳播，傳染性高，極難凈化[4-5]。因此，支原體的防控凈化一直是困擾養(yǎng)雞業(yè)的難題。雞滑液囊支原體在臨床上主要采用的檢測方法是病原分離鑒定、血清學(xué)方法和生物學(xué)方法等[6-7]，其中病原分離鑒定是檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，但臨床上該病常與其他細(xì)菌性疾?。ㄈ缙咸亚蚓?、鏈球菌引起的關(guān)節(jié)炎等）混和感染，導(dǎo)致臨床死亡率升高和滑液囊支原體的分離率降低[8]，并且滑液囊支原體的臨床陽性率高，但分離率較低，極大制約了該病的防治。

雞支原體病嚴(yán)重影響家禽健康和生產(chǎn)性能，需要多措并舉才能有效防治這一疾病。當(dāng)出現(xiàn)疑似支原體感染癥狀時(shí)，應(yīng)盡早采集患雞的典型病料樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測，確診是否為支原體感染。根據(jù)藥物敏感性測試結(jié)果，選擇有效的抗生素進(jìn)行治療。在專業(yè)人員的指導(dǎo)下，按照推薦劑量和療程合理用藥，避免濫用和誤用藥物。與此同時(shí)，養(yǎng)殖場也應(yīng)提高生物安全意識(shí)，嚴(yán)格控制人員和車輛進(jìn)出，設(shè)立專門的消毒通道，對所有進(jìn)入養(yǎng)殖區(qū)域的人員和車輛進(jìn)行徹底消毒，防止病原體帶入。養(yǎng)殖場的雞舍、設(shè)備和周圍環(huán)境要定期進(jìn)行徹底清潔和消毒，減少病原體的生存和傳播。對新引進(jìn)的種雞進(jìn)行嚴(yán)格的隔離觀察和健康檢查，確保它們未攜帶支原體[9]。采取必要的措施防止養(yǎng)殖場周邊野生動(dòng)物和害蟲的侵入，避免傳播媒介進(jìn)入場區(qū)感染雞群[10]。加強(qiáng)環(huán)境管理，保持雞舍良好的通風(fēng)換氣，減少氨氣和其他有害氣體的聚積，注意合理控制養(yǎng)殖密度，避免過度擁擠導(dǎo)致的應(yīng)激反應(yīng)，為雞只創(chuàng)造一個(gè)舒適的生活環(huán)境。同時(shí)，臨床上預(yù)防支原體疾病發(fā)生的最優(yōu)方案是制定合理的疫苗接種計(jì)劃，按計(jì)劃對雞群進(jìn)行免疫接種[11]。高效、安全的疫苗品種，可以確保疫苗的質(zhì)量和效力，并要注意接種時(shí)間、劑量和接種方式精確。

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Study on chicken Mycoplasma synovialis HB-MS isolate strains pathogenicity and drug resistance

CAI Liangshuo1， LIU Wentao1，LIU Yanhan2， CHEN Shuo3，" CHENG Chunge3， LIU Ruonan1， ZHANG Liyong1， CHEN Jing2， ZOU Dongmin1

（1.Hebei North University ，Zhangjiakou" 076450， China;

2. Shandong Animal Disease Prevention and Control Center ， Jinan" 250010， China;

3.BeJing Huaduyukou Poultry Industry Co. LTD.， Beijing" 101206， China）

Abstract： In order to further investigate the causes of the onset and rapid spread of Mycoplasma infection in a chicken farm in Hebei Province， this study conducted a study on the pathogenic factors and biological characteristics on site. We collected mucus samples from the maxillary cleft of diseased chickens and successfully isolated and purified a strain of Mycoplasma pneumoniae through bacterial biological characteristics analysis， morphological observation， PCR detection， sequencing， and animal regression experiments. The results showed that the isolated strain HB-MS can degrade glucose and produce acid， causing the culture medium to turn yellow. Under the microscope， classic \"egg shaped\" colonies can be observed， which is consistent with the biological characteristics of Mycoplasma; The pathogenicity test analysis of SPF chickens shows that HB-MS has strong pathogenicity and can be re isolated. Genetic evolution analysis shows that the HB-MS strain isolated in this study has a distant relationship with existing Mycoplasma. The above research results provide important scientific basis for the prevention and control of Mycoplasma in laying hens， and help formulate effective treatment and prevention strategies.

Keywords： Mycoplasma; Isolation and identification; Pathogenicity testing; Drug sensitivity test

收稿日期：2024-08-08

基金項(xiàng)目：河北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金（HBCT2024270407）；

山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（重大科技創(chuàng)新工程）項(xiàng)目（2022CXGC010606-03）

通信作者：鄒東敏（1990—），男，博士，從事動(dòng)物臨床疾病防治相關(guān)工作，E-mail：1921892333@qq.com