成年雄性毛白楊組培幼化技術(shù)研究

摘 要：【目的】毛白楊以無性繁殖為主，而無性繁殖材料往往存在老化現(xiàn)象，嚴重影響苗木質(zhì)量，研究繁殖材料的幼化技術(shù)對于改善苗木質(zhì)量，促進無性林業(yè)發(fā)展有重要意義?！痉椒ā恳员本┐笈d區(qū)站上村的200年生雄性毛白楊為對象，取其根萌條為繁殖材料，探索2種滅菌試劑處理條件下，不同滅菌時間對外植體成活與生長的影響，同時在MS培養(yǎng)基中設(shè)置不同激素組合研究其增殖的最佳效果，篩選出適合其生長的最佳增殖培養(yǎng)基，通過繼代培養(yǎng)研究此200年生成年雄性毛白楊的組培幼化技術(shù)。【結(jié)果】結(jié)果表明，0.1%氯化汞溶液的滅菌效果比10%次氯酸鈉溶液效果好，最佳滅菌處理為0.1%氯化汞7 min，成活率為57%；最佳增殖培養(yǎng)基為MS+0.7 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA，最高叢生芽分化系數(shù)為2.23，莖高生長量≥1 cm苗的數(shù)量比例為53.33%，顯著高于其他處理；隨著繼代次數(shù)的增加，生長周期由63 d（1代）降至44 d（4代），繼代培養(yǎng)增殖系數(shù)由0.93（1代）提升至4.85（4代），莖高生長量≥3 cm苗的數(shù)量比也從2.23%（1代）顯著增至62.34%（4代）?！窘Y(jié)論】此200年生毛白楊繁殖材料存在一定程度的老化現(xiàn)象，母株的年齡可能影響其根萌條的幼化程度，但隨著繼代次數(shù)的增加，生長勢有了顯著的提高，說明多次繼代培養(yǎng)有較明顯的幼化作用，且隨著繼代次數(shù)的增加，幼化效果也越好。

關(guān)鍵詞：組織培養(yǎng)；成熟樹木；生理衰弱；幼化；雄性毛白楊

中圖分類號：S792.11 文獻標志碼：A 文章編號：1673-923X（2024）08-0009-07

基金項目：“十三五”國家重點研發(fā)計劃項目課題（2016YFD0600403）；林業(yè)和草原科技成果國家級推廣項目（2023133111）；北京市科技計劃項目課題（Z231100003823026）；北京園林綠化增彩延綠科技創(chuàng)新工程—品種研發(fā)及栽培技術(shù)推廣項目（CEG-2015）。

Study on tissue culture juvenation technique of male Populus tomentosa Carr.

ZHANG Jin1，2， WANG Yongge2， PENG Yuxin2， LI Guolei1， WANG Maoliang2， ZHANG Hengyue2， CHANG Xiaochao1， LI Jinjin1， LIU Yong1

（1. School of Forestry， Key Laboratory for Silviculture and Conservation， Ministry of Education， Beijing Forestry University， Beijing 100083， China； 2. Institute of Landscape Architecture， Beijing 100102， China）

Abstract：【Objective】Regeneration of Populus tomentosa mainly rely on asexual reproduction， but the material of asexual propagation often has aging phenomenon.【Method】It is important to understand the aging pattern of reproductive material and the juvenation techniques. In this study， 200 year old mature trees of male P. tomentosa root sprouts were used as study materials. Two sterilization reagents and sterilization times were used to test the impact on the survival rate and growth of propagules. Different hormone combinations in MS medium were designed to select the best multiplication culture medium according to the effect of propagule proliferation. Juvenation technique of mature P. tomentosa were studied through successive sub-culture.【Result】The results showed that sterilization effect of 0.1% mercuric chloride solution was better than the 10% sodium hypochlorite solution. The best sterilization treatment was 0.1% mercuric chloride in 7 min， the highest survival rate was 57%. The best proliferation medium was MS+0.7 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA， in which shoot multiplication coefficient was the highest of 2.23， the proportion of shoot number（shoot increment≥1 cm） was 53.33%， they were significantly higher than other mediums. After 4 generations of breeding the growth cycle decreased from 63 days to 44 days， the proliferation coefficient increased from 0.93 to 4.85， the percentage of plant number （shoot increment≥3 cm） significantly increased from 2.23% to 62.34%.【Conclusion】It was indicated that there was an aging phenomenon in this 200 years old P. tomentosa root sprout. The juvenation effect was much obvious after multiple sub-cultures.

Keywords： tissue culture； mature trees； physiological aging； juvenation； male； Populus tomentosa Carr.

采用無性繁殖方法育苗的樹種，若以苗繁苗或使用大樹枝條作為繁殖材料培育苗木，將會導(dǎo)致造林后樹木生長過程中出現(xiàn)成熟效應(yīng)，即斜長、老化、早衰等現(xiàn)象，嚴重影響了人工林的質(zhì)量[1]。由于成年樹木表現(xiàn)出更穩(wěn)定的形態(tài)生理特性，在進行優(yōu)樹選擇時，從成年樹中選優(yōu)比在幼苗或幼林中選優(yōu)更有效。因此，當選出的優(yōu)樹是成年或老年樹木時，了解成年樹木繁殖材料作為外植體進行組織培養(yǎng)的幼化規(guī)律，對形成可能的幼化技術(shù)具有重要意義。

成年樹木的繁殖材料往往具有成熟效應(yīng)，使得其優(yōu)良性狀在無性繁殖中難以保持，組織培養(yǎng)外植體的器官發(fā)生同時受生長階段變化和培養(yǎng)環(huán)境的影響，目前對這種生長階段變化的研究較少，特別是從成熟階段到幼年階段的逆轉(zhuǎn)變化[2-4]。體外誘導(dǎo)器官發(fā)生被證明是誘導(dǎo)再生的有效方法，也是外植體年幼階段再生（離體培養(yǎng)幼化）的有效途徑[5-6]。如巨杉Sequoiadendron giganteum Buchholz.就通過組培外植體器官發(fā)生的方式實現(xiàn)了幼化[7]，這表明來自組培再生的植物可能具有幼年化的特征，比如更高的微體繁殖能力、生根能力等[8]。研究表明由成年樹木組培獲得的完全幼化的完整植株的數(shù)目并不多，組培幼化技術(shù)還有待證明[9]。完全幼化通常只能在配子形成、有性生殖和胚胎形成過程中獲得，是否可以通過其他手段誘導(dǎo)真正穩(wěn)定的幼化仍然存在爭議[10-11]。如，1997年從橡膠樹Hevea brasiliensis Müll. Arg.成熟外植體中誘導(dǎo)的體細胞胚重新獲得了微體繁殖能力[8，12]，2003年報道的可可樹Theobroma cacao L.離體器官誘導(dǎo)的體細胞胚衍生無性系的能力曾引起科學(xué)界極大的關(guān)注[13]。目前，植物組培幼化技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于許多不同植物物種，但喬木組織培養(yǎng)幼化技術(shù)只在少數(shù)的針葉樹和闊葉樹中被報道過[14-16]。

毛白楊Populus tomentosa Carr.是我國北方地區(qū)的鄉(xiāng)土樹種，在人工林建設(shè)和園林綠化中發(fā)揮著重要作用，其苗木培育多采用無性繁殖，生產(chǎn)上以大樹枝條繁殖苗木的現(xiàn)象十分普遍，從而導(dǎo)致造林后樹木的早衰。近年來，毛白楊的組織培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)較為成熟，大量的研究表明，組培過程中合理搭配使用生長調(diào)節(jié)劑6-BA與NAA能獲得較好的不定芽增殖和生長的效果[17-20]。本研究以成年雄性毛白楊根萌條為對象，使用2種滅菌試劑處理，采用2種植物生長調(diào)節(jié)劑配置增殖培養(yǎng)基，并進行多次繼代培養(yǎng)，探索解決無菌再生體系中的關(guān)鍵技術(shù)問題，了解組培幼化的生長規(guī)律，為成年雄性毛白楊繁殖材料的幼化提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及試劑

1.1.1 試驗材料

試驗用組培外植體采自毛白楊古樹的一年生根萌條，采集地點位于北京市大興區(qū)安定鎮(zhèn)，為散生優(yōu)良雄性毛白楊單株，樹齡為200 a以上，胸徑為134 cm，樹高為25.0 m。

1.1.2 試驗試劑

基礎(chǔ)培養(yǎng)基采用MS，產(chǎn)于Phyto Technology Laboratories（簡稱Phyto Tech）的MURASHIGE SKOOG（含維生素）；凝固劑采用瓊脂，產(chǎn)于MicroanalysisInc的Agar Powder；使用生長素類似物a-Naphthalene acetic acid（NAA），即a-萘乙酸；細胞分裂素使用6-Benzyil aminopurine（6-BA），即6-芐氨基嘌呤。

1.2 試驗方法

1.2.1 啟動培養(yǎng)滅菌試驗

2016年5月，采集樹干基部一年生根萌條。去頂芽和基部不飽滿芽，取中段，將其分剪成帶芽的莖段（具1～2個芽），用洗潔劑水浸泡10 min，用毛筆輕刷。將莖段清洗而后置于流水下沖洗1 h。將沖洗過的莖段轉(zhuǎn)入超凈工作臺，用70%的乙醇浸泡并輕搖30 s，用無菌水清洗3次，再轉(zhuǎn)入不同類型的滅菌劑中進行不同時間的滅菌處理，最后無菌水沖洗5～7次，待用。

滅菌處理試驗設(shè)計為2種滅菌試劑條件下，不同滅菌時間的雙因素完全隨機試驗設(shè)計，具體為10%次氯酸鈉溶液6個時間水平（5、7、10、12、15、20 min），0.1%氯化汞溶液6個時間水平（3、4、5、6、7、8 min），共12個處理，每個處理30個外植體，3次重復(fù)。最后進行外植體成活率的統(tǒng)計，對比次氯酸鈉10%、氯化汞0.1%溶液對外植體成活率的影響。

用無菌解剖刀將滅過菌的外植體與滅菌液體直接接觸的傷口部位斜剪掉一小段，留1.0～1.5 cm莖段，稍傾斜插入MS培養(yǎng)基（pH值=5.9，不添加任何激素），每瓶培養(yǎng)基接種3個芽，放置于溫度為25±2 ℃，光照為12～14 h/d，光強為2 000～2 500 lx的培養(yǎng)室中培養(yǎng)，每隔3 d觀察其成活與生長情況，記錄最終成活率。兩周后取未受污染的外植體進入后續(xù)階段培養(yǎng)。

1.2.2 增殖培養(yǎng)基激素配比試驗

選取生長良好的無菌苗，剪成1.0～1.5 cm長的帶芽莖段，接種在增殖培養(yǎng)基上，增殖培養(yǎng)基分別是在MS培養(yǎng)基中添加不同濃度的細胞分裂素6-BA和生長素類似物NAA，6-BA濃度為0.7、0.5、0.3 mg/L，NAA濃度為0.05、0.03、0.01 mg/L，按照雙因素完全隨機試驗設(shè)計，共9個處理，每個處理30個外植體，3次重復(fù)。無特殊說明，本試驗全部培養(yǎng)基中含蔗糖30 g/L，瓊脂8 g/L，pH值=5.9，培養(yǎng)室條件同上。每隔3 d觀察1次，記錄叢生芽分化的數(shù)量，叢生芽轉(zhuǎn)入芽伸長培養(yǎng)基后，取大于1.0 cm的可接芽作為有效芽計算增殖系數(shù)[21]。

叢生芽分化系數(shù)=外植體分化出芽總數(shù)/外植體總數(shù)。

增殖系數(shù)=莖高生長量≥1.0 cm有效芽的個數(shù)/外植體總數(shù)。

1.2.3 繼代培養(yǎng)試驗

初代培養(yǎng)后，選取生長良好的無菌苗，剪成1.0～1.5 cm長的帶芽莖段，接種到繼代培養(yǎng)基上進行繼代培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)基為試驗選出的最佳增殖培養(yǎng)基，培養(yǎng)室條件同上。記錄每一次繼代無性系各項生長指標。具體測定方法如下：

1.2.3.1 記錄每一次繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)周期

為保證芽培養(yǎng)有足夠穩(wěn)定的植株數(shù)量，每一代培養(yǎng)最大限度地給予其完整的培養(yǎng)周期，即通過觀察與記錄其生長指標，當生長速度降低時，視之為一個繼代周期或培養(yǎng)周期。

1.2.3.2 記錄每一代無性系組培苗增殖系數(shù)與莖高生長情況

持續(xù)觀察，當完成一個培養(yǎng)周期時，記錄其增殖系數(shù)及莖高生長情況。并分別記錄組培苗高度≥3 cm和<3 cm的數(shù)量，觀察無性系每一代間莖高生長量的差異[22]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS軟件對成年雄性毛白楊無性系各項生長指標數(shù)據(jù)進行方差分析，對差異顯著的指標采用Duncan方法進行多重比較（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同滅菌方法對成年雄性毛白楊外植體成活率的影響

通過滅菌處理試驗發(fā)現(xiàn)，2種滅菌劑處理均表現(xiàn)出隨著時間的延長，外植體成活率先升高后降低，其中10%次氯酸鈉在滅菌15 min時效果最好，成活率為38%，0.1%氯化汞在滅菌7 min時成活率達最高，為57%，后者顯著高于前者，因此最佳滅菌處理組合為0.1%氯化汞滅菌7 min（表1）。

2.2 成年雄性毛白楊增殖培養(yǎng)基的篩選

本研究根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，選擇6-BA、NAA作為增殖培養(yǎng)基的生長調(diào)節(jié)劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表2），不同濃度6-BA、NAA處理組合對其芽再生的增殖與生長影響顯著。其中1號MS+0.7 mg/L 6-BA+ 0.01 mg/L NAA處理組合的莖高生長量≥1 cm苗的數(shù)量最高為0.53，所占比例為53%，顯著高于其他處理（P<0.05），叢生芽分化系數(shù)也最高，平均為2.23，除與6號培養(yǎng)基差異不顯著外，均高于其他處理；因此確定MS+0.7 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA為最佳增殖培養(yǎng)基。

2.3 成年雄性毛白楊無性系繼代培養(yǎng)周期的變化情況

觀察芽分化率和莖高生長情況，當其生長穩(wěn)定時，可視為一個繼代周期。由圖1可知，隨著繼代次數(shù)的增加，繼代周期由第1代的63 d，逐漸縮短至第4代的44 d，說明其生長有加快的趨勢。可見，根萌條雖然是一株樹上發(fā)育最年輕的部位，但是由于其母株的年齡較高，也會表現(xiàn)出一定的成熟性，初期生長勢較弱。隨著繼代次數(shù)的增加，生長周期縮短，表明通過組培多次繼代能夠起到一定的幼化作用。

2.4 成年雄性毛白楊無性系繼代培養(yǎng)過程中的生長情況

從表3可看出，成年雄性毛白楊在繼代過程中，隨著繼代次數(shù)增加，增殖系數(shù)由1代的0.93提升至4代的4.85，莖高生長量<3 cm苗的數(shù)量各代間差異不顯著，但在莖高生長量≥3 cm苗的數(shù)量上，4代的3.06顯著高于3代的1.48，而3代又顯著高于1、2代，從莖高生長量≥3 cm苗的數(shù)量百分比上也可以看出4代的62.34%顯著高于其他各代的生長量所占的百分數(shù)，說明多次繼代能使成年雄性毛白楊在一定程度上發(fā)生幼化，且效果明顯。

3 討 論

3.1 植物滅菌劑對成年雄性毛白楊外植體滅菌成活率的影響

植物材料表面滅菌是組織培養(yǎng)過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，合適的滅菌劑可以在有效去除污染物的同時減少對植物細胞的破壞[23]。目前應(yīng)用比較廣泛且效果較好的滅菌劑主要有次氯酸鈉、84消毒液、氯化汞[24-25]等。滅菌的成功與否，還取決于外植體類型，采集時間，材料木質(zhì)化程度等，幼嫩的莖段可以適當縮短滅菌時間[26]。毛白楊莖段附有絨毛，滅菌較不易。研究表明，對于較難滅菌的植物采用0.1%～0.5%氯化汞滅菌效果較好[27]。本試驗于5月采集成年雄性毛白楊根部萌條作為外植體，通過使用10%次氯酸鈉和0.1%氯化汞2種滅菌劑，發(fā)現(xiàn)0.1%氯化汞溶液的滅菌效果較10%次氯酸鈉溶液的好，同時還發(fā)現(xiàn)無論使用哪種滅菌劑，外植體的成活率均隨著滅菌時間的增加而先升高后降低，由此表明滅菌時間太短可能達不到滅菌效果，而時間太長又容易傷害植物組織細胞，綜上所述，本研究篩選出適合于此成年雄性毛白楊外植體的滅菌劑處理組合為0.1%氯化汞溶液滅菌7 min，滅菌效果優(yōu)于其他處理，成活率也較高。

3.2 植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA、NAA對成年雄性毛白楊無性系增殖與生長的影響

植物離體再生過程中，植物激素種類與濃度對外植體不定芽再生及生長起著重要的調(diào)節(jié)作用。目前多數(shù)研究表明，楊樹組織培養(yǎng)過程中，合理搭配使用6-BA與NAA都能獲得不錯的效果[18，20]，而植物基因型的不同，兩者最適合的搭配組合也不同，因此合理選擇6-BA和NAA的配合比例非常關(guān)鍵[28]。劉曉梅[29]研究表明毛白楊雜種莖段不定芽分化需要較低濃度的6-BA（<1.0 mg/L），而6-BA與低濃度的NAA（0.01 mg/L）配合使用能更好促進不定芽的生長。本試驗同樣表明僅使用這兩種生長調(diào)節(jié)劑便可很好的促進毛白楊不定芽的增殖與生長，且一定濃度6-BA與低濃度NAA對無性系不定芽的增殖效果較好，各個處理組合間差異顯著，使用MS+0.3 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA組合處理的無性系各項生長指標均為最低，不定芽分化系數(shù)僅為0.93，高生長量≥1 cm苗的數(shù)量比例也僅為12.78%；使用MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA組合處理的無性系不定芽分化系數(shù)較高為2.00，但高生長量≥1 cm苗的數(shù)量比例僅為23%，莖高生長不足；當使用MS+ 0.7 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA處理組合時，叢生芽分化系數(shù)為最高2.23，莖高生長量≥1 cm苗的數(shù)量比例也為最高53.33%。因此認為，此成年雄性毛白楊古樹組培繁育的最佳增殖培養(yǎng)基處理組合為MS+0.7 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA。

3.3 組織培養(yǎng)多次繼代對成年雄性毛白楊外植體的幼化作用

成熟效應(yīng)（maturation）又被稱為老化，包括遺傳老化、個體發(fā)育老化及分生組織老化等，樹木可以擁有不同成熟程度的組織器官[30-31]。成熟效應(yīng)會導(dǎo)致相對穩(wěn)定的發(fā)育改變，包括生長速率降低，生殖發(fā)育頻率的增加以及形態(tài)特征的改變等[32，33]。幼化（rejuvenation），是指有性生殖和胚胎形成過程中成熟的逆轉(zhuǎn)，或指通過修剪、連續(xù)繼代、嫁接和應(yīng)用植物生長抑制劑等方式處理下發(fā)生的逆轉(zhuǎn)[34-35]。幼化苗木可消除成年大樹的成熟效應(yīng)、位置效應(yīng)和年齡效應(yīng)，使之恢復(fù)到幼年階段[36]。樹木胚后生長一般可分為三個發(fā)育階段，即幼年營養(yǎng)生長階段、成年營養(yǎng)生長階段和成年生殖生長階段。特定階段都有自己特有的形態(tài)和生理生化特性[37-38]。通常，樹木在幼年和青年階段生長速度快，而成年階段生長速度會降低[2，29]。Mc Gowran等[39]也曾研究發(fā)現(xiàn)，相比于年輕櫟樹Quercus robur L.繁育的組培無性系，300年生櫟樹的組培無性系生長勢較弱，幼化性較低。本試驗研究中，200年生毛白楊組培無性系在適宜的培養(yǎng)條件下，前期生長周期長達2個月、增殖系數(shù)低至0.93、莖高生長不足，整體狀態(tài)表現(xiàn)為生長勢弱，幼化性低，與前人的研究結(jié)果相一致。因此，當選擇的優(yōu)樹是成年樹或古樹時（幾十年生或幾百年生大樹），采用幼化繁殖材料及幼化繁育技術(shù)十分重要[40]。張世紅等[41]研究表明20年生的毛白楊外植體隨著繼代的增加，組織成熟程度降低，幼化程度加深。孫立平等[42]對大葉楊實生苗嫩枝進行多次繼代后，可使其莖條微扦插生根率提高至100%，林木由成年向幼年階段轉(zhuǎn)變常表現(xiàn)為生根能力的提升[43]。然而，盡管選用樹木個體發(fā)育中幼化性高的根萌條作為外植體[44]，此200年生雄性毛白楊組培無性系仍然受到母株年齡的影響，表現(xiàn)為前期生長慢，生長勢弱。在前人研究中也發(fā)現(xiàn)隨著母株年齡的增加，采穗插條的生根能力會逐漸減退[45]。本試驗采用200年生毛白楊根萌條作為外植體，隨著繼代次數(shù)的增加，4代生長周期相比1代縮短了19 d，增殖系數(shù)增加了3.92，苗高生長量≥3 cm的苗數(shù)量百分比提高了40.11%，各代間差異不斷增高，生長趨勢明顯加快，幼化效果顯著。綜上所述，無性繁殖材料往往受到母株年齡的影響，而多次組培繼代可實現(xiàn)成年樹木繁殖材料的幼化。

由于古樹根萌條幼化繁殖材料數(shù)量有限，且年齡效應(yīng)對根萌條存在影響，導(dǎo)致試驗難度大，周期長，本試驗只完成了4次繼代，希望在以后的研究中能夠繼續(xù)深入探討組培繼代的幼化規(guī)律。

4 結(jié) 論

以200年生成年雄性毛白楊的根萌條為繁殖材料，組培最適滅菌處理為0.1%氯化汞溶液滅菌7 min，成活率為57%；最佳增殖培養(yǎng)基為MS+ 0.7 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA，平均叢生芽分化系數(shù)為2.23，莖高生長量≥1 cm苗的比例占53.33%；此200年生成年雄性毛白楊的根萌條存在老化現(xiàn)象，多次繼代培養(yǎng)對其有一定程度的幼化作用，增殖系數(shù)由最初1代的0.93增至4代的4.85，莖高生長量≥3 cm苗的數(shù)量比例也由最初1代的2.23%顯著增至4代的62.34%，幼化效果顯著。

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[本文編校：羅 列]