組織培養(yǎng)誘發(fā)玉米自交系H99、A188和黃早四的變異研究

于曉明　王霞

摘要：本實驗利用AFLP技術(shù)對這三個玉米自交系的愈傷組織和再生苗進行遺傳變異分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，H99的再生率最低，并且具有最多的遺傳變異；而A188和黃早四的愈傷組織再生率都很高，而且愈傷組織和再生苗的變異較少。說明玉米愈傷組織在組織培養(yǎng)過程中的基因組穩(wěn)定性是與愈傷組織分化再生過程密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞：玉米；組織培養(yǎng)；遺傳變異；AFLP

基金項目：吉林省教育廳科學技術(shù)研究項目（吉教科合字〔2012〕第475號）

中圖分類號： S513.03；S336 文獻標識碼： A DOI編號： 10.14025/j.cnki.jlny.2016.23.051

組織培養(yǎng)誘發(fā)的植物體細胞變異（也稱植物體細胞克隆變異），一般是指在植物細胞、組織或器官的離體培養(yǎng)狀態(tài)下發(fā)生的遺傳變異或表觀遺傳變異[1]，這些變異可以通過細胞分裂和植物再生而傳遞給后代。植物體細胞克隆變異的產(chǎn)生沒有種屬特異性，出現(xiàn)的頻率一般比較高，一個組織培養(yǎng)周期內(nèi)可產(chǎn)生1%～3%的無性系變異，有時甚至能高達90%以上[2]。植物通過體細胞克隆變異，可產(chǎn)生一系列有益的新性狀，對植物品種改良和新品種選育具有重要的意義[3]。然而體細胞胚或通過不定芽繁殖的植株經(jīng)常出現(xiàn)高頻率的體細胞克隆變異現(xiàn)象[4，5]，又使其成為微繁和遺傳轉(zhuǎn)化工作中需要克服的重大難題。本試驗通過AFLP分子標記技術(shù)對玉米玉米自交系H99、A188和黃早四在組織培養(yǎng)過程中發(fā)生的DNA序列變異的頻率和狀態(tài)進行分析，探討分析玉米體細胞克隆遺傳變異的發(fā)生規(guī)律。

1 材料和方法

1.1實驗材料

玉米自交系黃早四H99、A188和黃早四的種子苗、愈傷組織和再生苗。

1.2組織培養(yǎng)和再生

各玉米自交系在授粉后12天，取幼胚，誘導愈傷組織。誘導培養(yǎng)基：N6基本培養(yǎng)基+2.8克/升脯氨酸+1毫克/升 2，4-D+100毫克/升 水解酪蛋白+10毫克/升 硝酸銀+2%蔗糖+0.7%瓊脂（pH5.8），于25±1℃條件下，暗培養(yǎng)4周。繼代培養(yǎng)基：誘導培養(yǎng)基中添加2毫克/升 2，4-D，暗培養(yǎng)4周。分化培養(yǎng)基：N6基本培養(yǎng)基+1毫克/升 NAA+6%蔗糖+0.7%瓊脂（pH5.8），25±1℃、80umol·m-2·s-1光照強度、光照時間為14小時/天的條件下誘導再生苗。待再生苗長至2～3厘米高時取材。

1.3 DNA提取

分別采集種子苗、愈傷組織和再生苗的葉片，用改良的CTAB法[6]提取上述植物材料的基因組DNA。

1.4 AFLP分子標記分析

AFLP分子標記技術(shù)主要包括以下幾個環(huán)節(jié)：酶切連接、預擴增、選擇性擴增、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染檢測[7]。使用的限制性內(nèi)切酶為MseI和EcoRI。

2 結(jié)果

2.1 愈傷組織的誘導和植株再生

玉米幼胚接種到愈傷組織誘導培養(yǎng)基上以后，2天后幼胚開始膨脹，6天后就可見到開始生成愈傷組織，以后半個月內(nèi)都可陸續(xù)見到愈傷組織的產(chǎn)生，黃早四的出愈率最低（42%），A188的最高（80%）（見表1）。雖然H99表現(xiàn)出了較好出愈率但是再生率很低，僅為22.9%。

2.2 AFLP分子標記檢測的遺傳變異

本實驗以20對引物分別對各基因型玉米的種子苗、愈傷組織（愈傷）和隨機選取的4株再生苗（R1-R4）DNA樣品進行了AFLP分析。結(jié)果表明A188、H99、黃早四分別產(chǎn)生826，790，904條帶，呈多態(tài)性的帶的條數(shù)分別為30，62，38（表2）。

以種子苗作為對照，供體來源相同的愈傷組織或再生植株，表現(xiàn)變異的遺傳位點在各個材料中表現(xiàn)并不一致（圖1）：其中A188在愈傷組織和再生苗中變異的頻率比較接近（1.5%～2.7%）；而H99的愈傷組織檢測到了較多的變異（6.2%），4株再生苗的變異相對下降（4.0%～4.5%）；黃早四來源的愈傷組織發(fā)生變異比較少（2.5%），而在其再生苗中的檢測到的變異更少（0.8%～1.5%）。另外，在A188的愈傷組織和再生苗中檢測到的變異中，以條帶新增的變異為主，而H99和黃早四的愈傷組織和再生苗的變異條帶沒有表現(xiàn)出這樣的傾向。

3 討論

在組織培養(yǎng)過程中，為排除由于激素濃度或外部條件的不同或是離體培養(yǎng)時間不同而造成的遺傳變異頻率的不同，本實驗對各個材料均采用一致的誘導、繼代、分化培養(yǎng)基和一致的培養(yǎng)條件，并且選擇相同培養(yǎng)時間的愈傷組織和再生苗。結(jié)果表明，玉米愈傷組織在組織培養(yǎng)過程中的基因組穩(wěn)定性是與愈傷組織分化再生過程密切相關(guān)的，而且不同基因型玉米由組織培養(yǎng)誘導的遺傳變異頻率有較大差異。本實驗結(jié)果對于理解不同基因型玉米在組織培養(yǎng)并誘導再生過程中表現(xiàn)出來的巨大差異有很大幫助。

參考文獻

[1] Larkin P J， Scowcroft W R. Somaclonal variation - a novel source of variability from cell cultures for plant improvement[J]. Theo Appl Genet，1981， 60：443-455.

[2] Smith M K， Drew R A. Current applications of tissue culture in plant propagation and improvement[J]. Austral. J . Plant Physiol， 1990， 17：267-289.

[3] Bouman H， De Klerk GJ.Somaclonal variation. In： Geneve RL， Preece SE and Merkle SA （eds） Biotechnology of ornamental plants[M]. CAB Int， Wallingford， UK， 1997，165-189.

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[5] 刁現(xiàn)民， 孫敬三. 植物體細胞無性系變異的細胞學和分子生物學的發(fā)展. 植物學通報[J]， 1999， 16（04）：372～377.

[6] Moller E.， et al.， A simple and efficient protocol for isolation of high molecular weight DNA from filamentous fungi， fruit bodies， and infected plant tissues. Nucleic Acids Research， 1992. 20（22）： p. 6115.

[7] 羅洋. 肥料和密度對玉米生長發(fā)育及DNA甲基化的影響[D]. 哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學， 2014.

作者簡介：于曉明，吉林農(nóng)業(yè)科技學院，講師，研究方向：遺傳學與基因工程。