金絲楸CbuCYP71D15基因克隆及表達分析

摘 要：【目的】通過對金絲楸CbuCYP71D15基因的分子特征和表達模式進行研究分析，為揭示CbuCYP71D15基因在金絲楸心材顏色形成過程中的作用提供參考依據(jù)?！痉椒ā炕诮鸾z楸木材樣本的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，采用常規(guī)PCR擴增技術(shù)克隆獲得CbuCYP71D15基因的編碼區(qū)序列（CDS）全長，利用ProtParam，Protscale，PSORT Prediction等在線工具對CbuCYP71D15基因進行基礎(chǔ)生物信息學(xué)分析。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，探究CbuCYP71D15基因在邊材中的表達水平。同時，采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）的方法分析該基因在金絲楸不同組織部位中的表達模式。【結(jié)果】成功克隆得到長為1 497 bp的CbuCYP71D15基因序列，生物信息學(xué)分析顯示該基因編碼498個氨基酸，相對分子量為56.5 kD，理論等電點為9.16，是穩(wěn)定的親水蛋白，其二級結(jié)構(gòu)主要由α螺旋（46.18%）和無規(guī)則卷曲（34.34%）組成，存在跨膜區(qū)段。通過序列比對及系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)，CbuCYP71D15基因所編碼的氨基酸序列與芝麻的同源序列相似度最高，同源蛋白遺傳關(guān)系最近，且CYP71Ds在進化過程中是保守的，CbuCYP71D15蛋白具有細胞色素P450超家族特征的保守結(jié)構(gòu)域及血紅素結(jié)合位點，屬于CYP71家族。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析顯示CbuCYP71D15基因在邊材中的表達水平與1，4-萘醌類化合物在邊材中的表達趨勢一致。qRT-PCR分析表明，CbuCYP71D15基因在金絲楸各組織部位均有表達，在邊材中表達水平最高，根中表達水平最低?！窘Y(jié)論】CbuCYP71D15基因可能在金絲楸心材呈色物質(zhì)的合成代謝過程中起到羥化作用，可為進一步解析CbuCYP71D15基因在金絲楸中的生物學(xué)功能提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：金絲楸；CYP71D15；基因克?。槐磉_分析

中圖分類號：S781.41 文獻標志碼：A 文章編號：1673-923X（2024）08-0150-09

基金項目：“十四五”國家重點研發(fā)計劃項目（2021YFD2200301）；中國林業(yè)科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費項目（CAFYBB2023QB001）。

Cloning and expression analysis of CbuCYP71D15 gene from Catalpa bungei ‘jinsi’

XU Yanhong1，2， YU Xiaochi2，3， YI Fei1， WANG Junhui2， LIANG Hongwei1， MA Wenjun2

（1. College of Biological and Pharmaceutical Sciences， China Three Gorges University， Yichang 443002， Hubei， China； 2. Chinese Academy of Forestry， Beijing 100091， China； 3. Northeast Forestry University， Harbin 150040， Heilongjiang， China）

Abstract：【Objective】The molecular characteristics and expression patterns of CbuCYP71D15 gene in Catalpa bungei ‘jinsi’were analyzed to provide a reference for revealing the role of CbuCYP71D15 gene in the formation of ‘jinsiqiu’ heartwood color.【Method】Based on the transcriptome data of ‘jinsi’ wood samples， the full-length coding sequence （CDS） of CbuCYP71D15 gene was cloned by conventional PCR amplification technology. The bioinformatics analysis of CbuCYP71D15 gene was carried out by ProtParam， Protscale， PSORT Prediction and other online tools. Transcriptome data were analyzed to explore the expression level of CbuCYP71D15 gene in sapwood. At the same time， the expression pattern of this gene in different tissues of ‘jinsi’ was analyzed by real-time fluorescence quantitative PCR （qRT-PCR）.【Result】The CbuCYP71D15 gene sequence with a length of 1 497 bp was successfully cloned. Bioinformatics analysis showed that the gene encodes 498 amino acids， with a relative molecular weight of 56.5 kD and a theoretical isoelectric point of 9.16. It was a stable hydrophilic protein. Its secondary structure was mainly composed of alpha helix （46.18%） and random coil （34.34%）， and there was a transmembrane segment. The encoded amino acid sequence was found to have the highest similarity to the homologous sequence of S. indicum by sequence alignment and phylogenetic analysis， and the genetic relationship of homologous proteins was the closest. Moreover， CYP71Ds are conserved during evolution， and CbuCYP71D15 protein had conserved domains and heme binding sites characterized by cytochrome P450 superfamily， it belonged to CYP71 family. Transcriptome data analysis showed that the expression level of CbuCYP71D15 gene in sapwood was consistent with the trend that 1，4-naphthoquinones were significantly higher in GS1 than in GS2 and GS3. The qRT-PCR analysis showed that CbuCYP71D15 gene was expressed in all tissues of ‘jinsi’， and the expression abundance was the highest in sapwood.【Conclusion】The CbuCYP71D15 gene may be involved in the synthesis and metabolism of chromophoric substances in the heartwood of ‘jinsi’. This study can provide a basis for further analysis of the biological function of CbuCYP71D15 gene in ‘jinsiqiu’.

Keywords： Catalpa bungei ‘jinsi’； CYP71D15； gene cloning； expression analysis

金絲楸Catalpa bungei ‘jinsi’為紫葳科Bignoniaceae梓屬Catalpa喬木，是我國珍貴用材和園林觀賞樹種，主要分布于山東、河南、江蘇、安徽等省，具有樹干通直圓滿、出材率高、材質(zhì)優(yōu)、耐腐等特性[1]，是中高檔家具、樂器和軍工等方面的優(yōu)質(zhì)用材。此外，金絲楸心材呈金黃色（圖1），且占比高達85%以上，縱切面拋光后紋理如金絲，其特殊的心材顏色進一步提高了金絲楸的經(jīng)濟價值。

木材的顏色與其內(nèi)部含有的次生代謝物有關(guān)[2]。梓屬植物中的次生代謝物主要有環(huán)烯醚萜類、萘醌類、黃酮類和苯酚類等，其中萘醌類化合物主要分布于植物的莖皮和莖木中。植物中的萘醌類化合物基本屬于1，4-萘醌，多數(shù)含有異戊二烯基，其顏色為黃色至玫紅色，酚羥基、甲氧基等助色基團的加入可增強化合物的顏色，引入的基團越多，顏色越深。前期研究表明金絲楸心材中含有豐富的1，4-萘醌類化合物，它們是金絲楸心材的主要呈色物質(zhì)。其主要在邊材中合成，于邊心材轉(zhuǎn)換區(qū)達到高峰。目前1，4-萘醌類化合物的合成通路尚不完全明確，但羥基化反應(yīng)是其合成通路中的重要反應(yīng)之一。

在植物中，細胞色素P450（Cytochrome P450，CYP450s）蛋白是最大的蛋白質(zhì)超家族，CYP450s主要通過與多種底物相互作用來參與生物堿、萜類、脂肪酸、植物激素、黃酮類代謝物的初級代謝和生物合成與降解[3-8]。其經(jīng)典反應(yīng)是在分子上的非活性碳中心引入一個氧原子來促進羥基化反應(yīng)[9]。已有研究報道細胞色素P450在植物次生代謝物合成中具有重要作用，Pan等[10]發(fā)現(xiàn)SbCYP71AM1參與高粱Sorghum bicolor中高粱酮的生物合成，其能夠?qū)?-十五碳三烯基間苯二酚-3-甲醚二羥基化為二氫高粱酮；Seki等[11-12]研究表明甘草Glycyrrhiza uralensis中連續(xù)的兩步氧化反應(yīng)由CYP450s催化進行，首先由GsCYP88D6將β-香樹脂醇轉(zhuǎn)變?yōu)?1-羰基-β-香樹脂醇，再通過GsCYP72A154的催化將該產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為甘草酸。Guo等[13]研究發(fā)現(xiàn)丹參Salvia miltiorrhiza中SmCYP76AH1參與鐵銹醇的生物合成，使次丹參酮二烯羥基化形成鐵銹醇。這些研究表明，植物細胞色素P450的催化活性極其廣泛，能在植物體內(nèi)的多種初級代謝和次級代謝中起作用，特別是生物合成中的羥基化過程。

通過對金絲楸邊材樣本的轉(zhuǎn)錄組與代謝組聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)金絲楸邊材中CbuCYP71D15基因的表達與1，4-萘醌及其羥基衍生物含量積累趨勢一致。由此推測CbuCYP71D15基因可能與1，4-萘醌類化合物的合成相關(guān)，并在其合成過程中起到了羥基化的作用。為進一步探究金絲楸中CbuCYP71D15基因的相關(guān)信息及表達規(guī)律，本研究基于金絲楸木材樣本的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)克隆獲得了CbuCYP71D15基因編碼序列（CDS）的全長，并對其編碼蛋白的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特征和系統(tǒng)進化進行分析，同時應(yīng)用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)分析CbuCYP71D15基因在金絲楸不同組織部位中的表達模式。以期為探究CbuCYP71D15基因在金絲楸心材呈色物質(zhì)合成中的調(diào)控作用、解析金絲楸心材顏色的形成機理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在河南省洛陽市洛寧縣伙子村（34°23′08″N，111°40′35″E）完成樣品采集。選擇3株生長狀況一致的21年生金絲楸作為試驗材料，從距離地面1.3 m處鋸解木材圓盤，并采集金絲楸的根，1、3、5年生小枝及成熟葉片，每個組織部位至少采集10 g，采集的樣品迅速用錫箔紙包裹好，置于干冰中速凍寄回實驗室，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 目的基因的獲取

將木材圓盤的邊材部分分解出來，將分解好的金絲楸邊材樣品，經(jīng)液氮冷凍后，利用研磨儀（MM400，Retsch）在低溫下迅速研磨至粉末狀。使用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（DP441，天根）提取樣品總RNA；并使用微量分光光度計NanoDrop2000 spectrophotometer（Thermo Scientific）檢測RNA濃度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，-80 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

cDNA合成使用PrimeScript？ II 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒進行，參考試劑盒說明書，在離心管配制反應(yīng)混合液：Oligo dT Primer（50 μM）1 μL、dNTP Mixture（10 mM each）1 μL、總RNA<5 μg，以RNase-free ddH2O補至總體積為10 μL，65 ℃恒溫孵育5 min后，冰上迅速冷卻。向上述反應(yīng)液（10 μL）中加入5×PrimeScript Buffer4 μL、RNase Inhibitor （40 U/μL）0.5 μL，以PrimeScript II RTase （200 U/μL）1 μL、RNase-free ddH2O補至總體積為20 μL。緩慢混勻，42 ℃反轉(zhuǎn)錄1 h，95 ℃下酶失活5 min，冰上冷卻，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)CbuCYP71D15基因的CDS序列，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計擴增引物CbuCYP71D15-F/ CbuCYP71D15-R（表1）。以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，通過常規(guī)PCR方法克隆基因。PCR擴增體系如下：PrimeSTAR HS （Premix）25 μL，引物F和引物R各2 μL，cDNA模板2 μL，用滅菌雙蒸水補足至50 μL。擴增程序：95 ℃下預(yù)變性10 min；95 ℃下變性30 s，58 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸90 s；共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳后，將含有目的DNA的瓊脂糖凝膠切下，使用MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit V 4.0試劑盒（TaKaRa）進行目的條帶的純化回收。回收產(chǎn)物連接到T載體（pEASY-Blunt Zero Cloning vector，北京全式金），利用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞，經(jīng)菌落PCR檢測后，選取陽性克隆送上海生工生物工程有限公司進行測序分析。

1.3 CbuCYP71D15基因編碼蛋白分析

通過DNAMAN軟件將CbuCYP71D15基因序列翻譯為氨基酸序列。利用ExPASy網(wǎng)站中的ProtParam和Protscale在線工具預(yù)測分析CbuCYP71D15基因編碼蛋白的理化性質(zhì)和親疏水性列譜。使用PSORT Prediction進行CbuCYP71D15基因編碼蛋白的亞細胞定位預(yù)測分析。應(yīng)用DTU.dk網(wǎng)站中的SignaIP 4.1在線軟件預(yù)測CbuCYP71D15基因編碼蛋白是否具有信號肽。使用SOPMA和SWISSMODEL全自動蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)同源建模的方法預(yù)測分析CbuCYP71D15基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)，利用NCBI Conserved Domians預(yù)測分析CbuCYP71D15基因編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。

1.4 同源分析

將獲得的CbuCYP71D15蛋白序列在UniProt網(wǎng)站上進行Blast同源序列比對，尋找其在不同物種中同源性較高的蛋白序列。選擇18個不同物種，采用MEGA軟件的鄰接法（Neighbor-Joining，Bootstrap=1 000）將18個同源蛋白構(gòu)建進化樹[14]。并進一步選取芝麻等同源性較高的其他8個物種的CYP71D亞家族的相關(guān)蛋白序列與CbuCYP71D15蛋白序列進行多序列比對分析。

1.5 組織表達特異性分析

提取金絲楸的根，邊材，1、3、5年生小枝和成熟葉片的RNA，RNA提取按照RNAPrep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（DP441，天根）說明書進行。參照PrimeScript？ RT reagent Kit（Perfect Real Time）試劑盒（Takara）說明書，將RNA樣品反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR反應(yīng)，內(nèi)參基因選擇CfMADH[15]。按照實時熒光定量PCR引物設(shè)計規(guī)則，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計CbuCYP71D15基因的實時熒光定量特異性引物見表2，由生工生物工程（上海）有限公司合成。qPCR反應(yīng)體系及程序參照2x SYBR Green qPCR Mix試劑盒（北京金百特生物技術(shù)有限公司）說明書進行，設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。熒光定量PCR結(jié)果采用2-ΔΔCT方法計算基因的相對表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 金絲楸CbuCYP71D15基因的克隆

金絲楸邊材總RNA提取電泳檢測結(jié)果顯示：RNA條帶清晰可見（圖2A），說明RNA未降解，完整性較好，可用于后續(xù)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。基于CbuCYP71D15基因CDS序列設(shè)計特異性引物，以獲得的cDNA為模板，進行常規(guī)PCR，克隆獲得CbuCYP71D15基因，將其連接到PUC57載體上轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，菌落PCR檢測條帶位置在1 500～2 250 bp之間，更靠近1 500 bp，與預(yù)期大小一致（圖2B）。將陽性克隆送測序，測序結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致，CbuCYP71D15基因CDS全長為1 497 bp。

2.2 CbuCYP71D15編碼蛋白的基礎(chǔ)生物信息學(xué)分析

CbuCYP71D15基因的編碼序列含有1 497個核苷酸，編碼498個氨基酸和一個終止密碼子，氨基酸序列如圖3所示。ProtParam預(yù)測理化性質(zhì)結(jié)果顯示CbuCYP71D15編碼蛋白的相對分子質(zhì)量為56 506.83 Da，分子式為C2569H4071N677O716S19，理論等電點為9.16，負電荷的殘基總數(shù)（Asp+Glu）為54個，帶正電荷的殘基總數(shù)（Arg+Lys）為64個。其脂溶指數(shù)為98.06，不穩(wěn)定系數(shù)為37.39。親疏水性預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，CbuCYP71D15多肽鏈第16個與第401個氨基酸位點具有最高與最低疏水性/親水性分值，分別為2.600與-2.622，其親水性總平均指數(shù)為-0.126（圖4A）。亞細胞定位預(yù)測結(jié)果表明，CbuCYP71D15編碼蛋白主要分布于細胞核、細胞質(zhì)、線粒體，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、過氧化物酶體等也有分布。信號肽預(yù)測結(jié)果顯示該蛋白不存在信號肽（圖4B）。

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明，CbuCYP71D15基因編碼蛋白是由α螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲四種結(jié)構(gòu)模式組成，其中α螺旋占比最大，為46.18%，無規(guī)則卷曲次之，占比34.34%，延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角分別占14.06%與5.42%（圖4D）。因此推測該蛋白的主要二級結(jié)構(gòu)由α-螺旋和無規(guī)則卷曲構(gòu)成。蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)建模結(jié)果顯示，CbuCYP71D15基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)組成主要為α-螺旋，與其二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果一致。同時，預(yù)測結(jié)果顯示該蛋白是由一個親水性球狀結(jié)構(gòu)和一個單跨膜錨定位點組成（圖4C），其為親水蛋白。CbuCYP71D15基因編碼蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果可知，CbuCYP71D15蛋白具有細胞色素P450超家族特征的保守結(jié)構(gòu)域及血紅素結(jié)合位點，說明其為CYP450超家族成員。同時，其具有保守蛋白結(jié)構(gòu)域：CD11072，即CYP71-like家族，本研究認為CbuCYP71D15蛋白是CYP71家族的成員（圖4E）。

2.3 CbuCYP71D15的系統(tǒng)發(fā)育分析

將CbuCYP71D15基因編碼蛋白序列在UniProt上進行Blast同源序列比對，發(fā)現(xiàn)CbuCYP71D15蛋白序列與多種植物的相似性達到60%以上，其中，與胡麻科Pedaliaceae的芝麻的相似性最高，達到81.4%，其次是玄參科Scrophulariaceae的松蒿Phtheirospermum japonicum和斑點猴面花Erythranthe guttata，分別為76.3%和74.0%。獲取芝麻等18個物種的同源氨基酸序列進行進化關(guān)系分析，結(jié)果如圖5所示，金絲楸CbuCYP71D15蛋白序列與芝麻（XP 011081934.1）聚在同一分支，表明它們之間的同源蛋白遺傳關(guān)系最近。

利用DNAMAN進行同源序列比對，結(jié)果顯示：CbuCYP71D15蛋白與芝麻、松蒿等8種同源性較高的植物CYP71Ds蛋白序列具有相似的結(jié)構(gòu)功能域，均包含7個代表序列簇Ⅰ組的E類細胞色素P450蛋白的保守Motif、CD11072保守蛋白結(jié)構(gòu)域和一個基于高度保守的半胱氨酸殘基保守位點，即半胱氨酸血紅素鐵結(jié)合位點（Cytochrome P450 cysteine heme-iron ligand signature）（圖6），進而推測CbuCYP71D15基因編碼蛋白可能與辣薄荷Mentha×piperita等中的CYP71Ds具有類似的功能。同時，保守結(jié)構(gòu)域也進一步佐證了CbuCYP71D15蛋白屬于CYP71氏族的成員。

2.4 CbuCYP71D15基因的表達模式分析

基于前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對CbuCYP71D15基因在邊材中的表達水平進行分析，結(jié)果如圖7所示，CbuCYP71D15基因在金絲楸邊材所劃分的三個區(qū)域GS1、GS2和GS3（圖1B）中均有表達，且相對表達量差異極顯著（P<0.01）。CbuCYP71D15在GS1區(qū)域的基因表達水平最高，為50.98；在GS2和GS3區(qū)域的基因表達水平都很低，且差異不顯著，分別為1.64和1.88。

運用實時熒光定量PCR檢測CbuCYP71D15基因在金絲楸不同組織部位中的相對表達量，結(jié)果表明，CbuCYP71D15基因在金絲楸的1、3、5年生小枝、根、邊材和葉中均有表達，但不同組織部位中的相對表達水平不同。如圖8所示，CbuCYP71D15基因在根系中的相對表達量最低，僅為0.13，邊材中的相對表達量最高，為1.73，是根系中基因表達量的13.3倍，差異顯著。值得注意的是1、3、5年生小枝中CbuCYP71D15基因的相對表達量均顯著低于邊材，但三者之間的相對表達量差異不顯著。

3 結(jié)論與討論

3.1 討 論

金絲楸材質(zhì)優(yōu)良，心材呈金黃色且占比極高，近年來在珍貴硬闊材市場上供不應(yīng)求，因此，對于金絲楸心材顏色及成材時間方面提出了更高的要求，使金絲楸心材呈色物質(zhì)及其代謝合成途徑的研究也逐步受到關(guān)注。木材的不同顏色與其內(nèi)部含有的各種抽提物有關(guān)，通常心材因含較多抽提物而使其材色較深。抽提物中的次生代謝物對木材顏色影響最明顯，植物能夠合成200 000種以上的次生代謝產(chǎn)物，這些天然產(chǎn)物的形成與次生代謝途徑中酶基因的表達密切相關(guān)[16]。

在植物基因組中，細胞色素P450家族作為參與生物代謝最大的超家族之一，包括超過1 000個家族和2 500個亞家族[17-18]。根據(jù)進化關(guān)系，可將植物CYP450s分成11個簇（Clans），兩類：單基因家族簇（CYP51、CYP74、CYP97、CYP710、CYP711、CYP727、CYP746）和多基因家族簇（CYP71、CYP72、CYP85、CYP86）[19]。本研究中的CbuCYP71D15基因認為是多基因家族CYP71氏族的一員。

本研究成功地從金絲楸中克隆獲得了一個細胞色素P450單加氧化酶基因CbuCYP71D15，并通過對CbuCYP71D15編碼蛋白進行相關(guān)生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)CbuCYP71D15編碼蛋白主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲構(gòu)成，存在跨膜區(qū)段。根據(jù)蛋白不穩(wěn)定系數(shù)≤40時為穩(wěn)定蛋白，>40為不穩(wěn)定蛋白[20]，親水性總平均值為負值時表示為親水性蛋白，正值表示為疏水蛋白[21]，推測CbuCYP71D15基因編碼蛋白質(zhì)為一個穩(wěn)定的親水性蛋白。此外，參考亞細胞定位結(jié)果，結(jié)合CYP450s酶是廣泛存在于微生物、動植物中與膜結(jié)合的血紅蛋白類酶[22]，可以進一步推測CbuCYP71D15編碼蛋白主要分布在線粒體膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜等細胞器膜上。經(jīng)系統(tǒng)進化樹分析和氨基酸多序列比對發(fā)現(xiàn)，CbuCYP71D15基因編碼蛋白在進化上與胡麻科的芝麻同源蛋白遺傳關(guān)系最近，具有81.4%的高相似性，與其他植物的CYP71Ds進行比對，顯示其功能結(jié)構(gòu)域保守，且都具有CYP71蛋白家族結(jié)構(gòu)域，說明CYP71Ds在生物演變過程中具有高度的保守性，即CbuCYP71D15基因編碼蛋白可能具有與其他CYP71Ds類似的使萜類化合物等代謝物羥基化的功能。其中辣薄荷的MpCYP71D15能夠?qū)ⅲ?S）-檸檬烯羥基化為薄荷醇的前體反式異哌啶醇[23]，莨菪Hyoscyamus muticus的HmCYP71D55參與螺巖蘭草酮的生物合成，催化Premnaspirodiene和Solavetivol的連續(xù)和獨立的羥基化反應(yīng)[24]。煙草Nicotiana tabacum的NtCYP71D20參與椒二醇的生物合成，催化5-表-馬兜鈴烯在C1和C3位置的連續(xù)和獨立的羥基化[25]。由此本研究認為CbuCYP71D15基因編碼蛋白可能參與1，4-萘醌及其羥基衍生物的生物合成，并在其中起羥基化的作用。

對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析可知，CbuCYP71D15基因在邊材GS1中的表達量明顯高于GS2和GS3，且GS2和GS3間差異不顯著的趨勢，與1，4-萘醌類化合物在邊材中的含量積累趨勢一致，且前期研究表明1，4-萘醌及其羥基衍生物是金絲楸心材呈金黃色的主要物質(zhì)，并在邊材中合成。據(jù)此推測CbuCYP71D15基因可能催化1，4-萘醌類化合物的合成。對金絲楸CbuCYP71D15基因在不同組織部位中的表達模式分析發(fā)現(xiàn)，CbuCYP71D15基因在邊材中的表達水平最高，在根中的表達水平最低，差異顯著。而在1、3、5年生小枝中的相對表達水平較邊材中低，且相互間相對表達水平差異不顯著。結(jié)合鄧麗萍[26]對楸樹邊心材生長特性及性質(zhì)變化規(guī)律的研究發(fā)現(xiàn)心材于5.26年后才開始形成，推測這一結(jié)果可能與心材形成時間在5.26年后有關(guān)。

綜上所述，本研究對金絲楸CbuCYP71D15基因及其編碼蛋白進行了初步探究，通過生物信息學(xué)軟件分析，結(jié)合CbuCYP71D15基因的表達情況，推測CbuCYP71D15基因參與金絲楸心材主要呈色物質(zhì)1，4-萘醌類化合物的生物合成，并行使羥基化功能。然而，CbuCYP71D15基因編碼產(chǎn)物參與1，4-萘醌類物質(zhì)合成的具體步驟還有待深入研究，后續(xù)可通過煙草瞬時轉(zhuǎn)化、體外酶活及同源轉(zhuǎn)化等試驗進一步驗證。

3.2 結(jié) 論

本研究成功克隆了金絲楸CbuCYP71D15基因CDS序列，并分析了CbuCYP71D15基因編碼蛋白的基本理化性質(zhì)和序列結(jié)構(gòu)，認為該基因?qū)儆贑YP71氏族成員，具有類似于CYP71Ds的羥基化功能。明確了CbuCYP71D15基因在金絲楸中的表達模式，其在邊材中表達水平最高，且在邊材GS1中的表達量明顯高于GS2和GS3。該變化趨勢與1，4-萘醌化合物在邊材中的含量變化趨勢一致，初步認為CbuCYP71D15基因參與金絲楸心材主要呈色物質(zhì)1，4-萘醌類化合物的生物合成。研究結(jié)果可為深入開展金絲楸CbuCYP71D15基因的功能研究，解析金絲楸心材呈色機理提供理論依據(jù)。

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[本文編校：羅 列]