川芎-赤芍藥對(duì)及其有效成分抑制ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞泡沫化及鐵調(diào)素的作用機(jī)制

摘要目的：觀察川芎-赤芍藥對(duì)及其有效成分能否減緩細(xì)胞泡沫化，并探討其作用機(jī)制。方法：采用氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）誘導(dǎo)人單核細(xì)胞白血病（THP-1）細(xì)胞建立泡沫化模型，將川芎-赤芍藥對(duì)及其有效成分分別作用于ox-LDL誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞。采用油紅O染色分析細(xì)胞泡沫化程度，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）檢測(cè)鐵代謝相關(guān)鐵調(diào)素（Hep）、膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（FPN）、鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白（HJV）、血色素沉著癥基因（HFE）、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體2（TfR2）mRNA表達(dá)情況。結(jié)果：油紅O細(xì)胞染色后鏡下可見(jiàn)，染色后的紅色脂滴因川芎-赤芍藥對(duì)及其有效成分干預(yù)而減少。與對(duì)照組比較，模型組Hep、FPN、HFE、TfR2 mRNA表達(dá)上升，HJV mRNA表達(dá)減少；與模型組比較，川芎-赤芍藥對(duì)及其有效成分干預(yù)組抑制作用明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論：川芎-赤芍藥對(duì)及其有效成分可抑制ox-LDL誘導(dǎo)的THP-1源巨噬細(xì)胞泡沫化，作用機(jī)制與川芎-赤芍藥對(duì)及其有效成分調(diào)節(jié)鐵代謝相關(guān)基因表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞川芎-赤芍藥對(duì)；巨噬細(xì)胞泡沫化；鐵調(diào)素；川芎嗪；芍藥苷；實(shí)驗(yàn)研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.18.008

Mechanism of Chuanxiong-Chishao and its Effective Ingredients on ox-LDL-induced Macrophage Foaming and Hepcidin

XU Guipeng， WEI Fengni， CHEN Qiting， LIN Baohong， CHEN Lijie， ZHANG Miao

Shenzhen Second People′s Hospital， Shenzhen 518000， Guangdong， China

Corresponding AuthorZHANG Miao， E-mail： shuixi.an@163.com

AbstractObjective：To observe the effect of Chuanxiong-Chishao and its effective ingredients on cell foaming，and to explore its mechanism of action.Methods：The foaming model of THP-1 cells was established by oxidized low density lipoprotein（ox-LDL）.The tohoku hospital pediatrics-1（THP-1） cells induced by ox-LDL were treated with Chuanxiong-Chishao and its effective ingredients respectively.The cell foam was analyzed by oil red O staining，and the mRNA expressions of hepcidin（Hep），ferroportin（FPN），ferrimodulin regulatory protein（HJV），hemochromatosis gene（HFE） and transferrin receptor 2（TfR2） were detected by reverse transcription quantitative polymerase chain reaction（RT-qPCR）.Results：Oil red O staining showed that the number of red fat drops decreased with the intervention of Chuanxiong-Chishao and its effective ingredients.Compared with the control group，the mRNA expressions of Hep，F(xiàn)PN，HFE and TfR2 increased in the model group，while mRNA expression of HJV decreased.Compared with the model group，Chuanxiong-Chishao and its effective ingredients of the intervention group showed obvious inhibitory effect，and the differences were statistically significant（P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusion：Chuanxiong-Chishao and its effective ingredients could inhibit the ox-LDL-induced THP-1-derived macrophage foaming，and its mechanism of action was related to the regulation of iron metabolism related gene expression.

KeywordsChuanxiong-Chishao; macrophage foaming; ferroportin; ligustrazine; paeoniflorin; experimental study

活血化瘀中藥川芎-赤芍藥對(duì)防治動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）的臨床及動(dòng)物相關(guān)研究較多，抗AS療效已被證實(shí)，但具體作用機(jī)制尚未明確［1-3］。相關(guān)研究顯示，鐵代謝及鐵調(diào)素（hepcidin，Hep）/膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ferroportin，F(xiàn)PN）信號(hào)通路異常是促進(jìn)AS的重要危險(xiǎn)因素，可能成為治療AS的新靶點(diǎn)［4-5］。鐵是機(jī)體必需的微量元素，Hep是富含半胱氨酸的具有負(fù)性鐵調(diào)節(jié)作用的在肝內(nèi)合成的抗菌多肽，可抑制單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)鐵的釋放及腸道鐵的吸收［6-7］。FPN是哺乳動(dòng)物膜鐵輸出的蛋白，受Hep調(diào)節(jié)，當(dāng)Hep與其受體FPN結(jié)合，泛素化誘導(dǎo)降解了FPN，使鐵在細(xì)胞內(nèi)滯留，減少鐵的輸出。Hepcidin/Ferroportin軸可調(diào)節(jié)鐵平衡，在體內(nèi)受到精準(zhǔn)的調(diào)控，通過(guò)協(xié)調(diào)小腸上皮細(xì)胞調(diào)控鐵的吸收，協(xié)調(diào)肝臟細(xì)胞和脾臟巨噬細(xì)胞中儲(chǔ)存的鐵釋放，調(diào)控機(jī)體游離的鐵濃度，維持機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)［7］。Hep的分子調(diào)控機(jī)制復(fù)雜，主要是通過(guò)骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）信號(hào)途徑［8］。鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白（HJV）是血色素沉著癥基因（HFE）2的產(chǎn)物，其是BMPs的協(xié)同受體，通過(guò)BMP受體增強(qiáng)BMP通路信號(hào)傳導(dǎo)［9］。當(dāng)機(jī)體累積過(guò)量的鐵時(shí)可產(chǎn)生一種復(fù)合物，這種復(fù)合物是由細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（TfR）1或TfR2、HFE與飽和轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合形成，通過(guò)促進(jìn)BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控Hep表達(dá)［10-11］。因此，在鐵調(diào)節(jié)中FPN、Hep、HFE、HJV、TfR2參與其中并發(fā)揮重要作用。

巨噬細(xì)胞泡沫化是公認(rèn)的體外AS細(xì)胞模型，為進(jìn)一步探討川芎-赤芍藥對(duì)及其有效成分對(duì)AS的影響及其機(jī)制，本研究采用人單核細(xì)胞白血?。═HP-1）細(xì)胞，通過(guò)丙二醇甲醚醋酸脂（PMA）及氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）誘導(dǎo)為泡沫細(xì)胞，構(gòu)建AS體外模型；建模成功后加入川芎-赤芍藥對(duì)及其有效成分進(jìn)行干預(yù)，并設(shè)置空白對(duì)照組及陽(yáng)性藥物組，進(jìn)而觀察川芎-赤芍藥對(duì)及其有效成分對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的影響及作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

人單核/巨噬細(xì)胞株THP-1購(gòu)自中科院上海生命科學(xué)研究院生化與細(xì)胞所。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物

川芎嗪、芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；川芎-赤芍藥對(duì)及單體凍干粉購(gòu)自華潤(rùn)三九藥業(yè)；辛伐他?。ê贾菽硸|制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：M023632，規(guī)格：每片20 mg）。

1.3實(shí)驗(yàn)試劑

RPMI-1640培養(yǎng)液，胎牛血清（Hyclone）；PMA（大連唯諾商貿(mào)有限公司）；Trizol（Takara）；油紅O染料（Sigma）；逆轉(zhuǎn)錄及SYBR Green PCR 試劑盒（ABI）。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)及模型制備

THP-1細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基（含10%標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清、100 U/mL鏈霉素及100 U/mL青霉素）中。培養(yǎng)條件：37 ℃恒溫培養(yǎng)箱，5%的CO2，細(xì)胞密度為2×106個(gè)細(xì)胞數(shù)，間隔2～4 d進(jìn)行傳代。

巨噬細(xì)胞泡沫化模型的建立：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞計(jì)數(shù)后的THP-1細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中，以1 000 r/min離心3 min后，棄上清，加入PMA（160 nmol/L）的細(xì)胞培養(yǎng)基，48 h后觀察細(xì)胞狀態(tài)。THP-1單核細(xì)胞分化，表現(xiàn)為細(xì)胞體積增大，由懸浮變成貼壁，偽足由圓形變成不規(guī)則形狀，表明已分化成THP-1細(xì)胞源性的巨噬細(xì)胞。

分化誘導(dǎo)成功后，加入含ox-LDL（100 mg/L）、10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后觀察到細(xì)胞體積繼續(xù)增大，脂質(zhì)變多，有透亮脂滴形成；使用油紅O對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，細(xì)胞質(zhì)中可見(jiàn)較多圓形、亮紅色及典型戒環(huán)樣的脂滴，表明THP-1細(xì)胞巨噬源性泡沫細(xì)胞模型構(gòu)建成功。

1.5油紅O染色

取狀態(tài)較好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期THP-1細(xì)胞接種于6孔板中，PMA處理48 h，使其分化為巨噬細(xì)胞，再給予ox-LDL誘導(dǎo)24 h后油紅O染色，蘇木素復(fù)染，顯微鏡下觀察并照相。

1.6實(shí)驗(yàn)分組

將PMA誘導(dǎo)后的THP-1源性巨噬細(xì)胞混勻后分為9組，每組4孔，分別為對(duì)照組（正常巨噬細(xì)胞）、模型組（ox-LDL 100 mg/L）、陽(yáng)性藥物組（ox-LDL 100 mg/L＋辛伐他汀 1 μmol/L）、川芎嗪組（ox-LDL 100 mg/L＋川芎嗪 500 μmol/L）、芍藥苷組（ox-LDL 100 mg/L＋芍藥苷 500 μmol/L）、川芎組（ox-LDL 100 mg/L＋川芎20 g/L）、赤芍組（ox-LDL 100 mg/L＋赤芍20 g/L）、川芎嗪＋芍藥苷組（ox-LDL 100 mg/L＋川芎嗪 500 μmol/L＋芍藥苷500 μmol/L）、芎芍藥對(duì)組（ox-LDL 100 mg/L＋川芎-赤芍藥對(duì)20 g/L）。

1.7逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）測(cè)定目的基因

收集細(xì)胞，使用Trizol將細(xì)胞充分裂解，進(jìn)行RNA提??；按說(shuō)明書(shū)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；再經(jīng)過(guò)預(yù)變性、擴(kuò)增等PCR反應(yīng)計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。Hep正向引物5′-CCTGACCAGTGGCTCTGTTT-3′，反向引物5′-CACATCCCACACTTTGATCG-3′；FPN正向引物5′-ACCTCGCTGGTGGTACAGAATGTT-3′，反向引物5′-AGCAGGAAGTGAGAACCCATCCAT-3′；HFE正向引物5′-GGATCTTGGAGCAAACCTCA-3′，反向引物5′-GACACCACTCCCAACTTCGT-3′；HJV正向引物5′-TTCCAATCCTGCGTCTTTGAT-3′，反向引物5′- GGAAAAGGTGCAAGTTCTCCAA-3′；TfR2正向引物5′-CCATCAGTGCTGACATTGCT-3′，反向引物5′- TGGGGGTAGAGACTCTGTGG-3′。以GAPDH為內(nèi)參，對(duì)照組及模型組作為對(duì)照，各藥物干預(yù)組目的基因的mRNA相對(duì)含量用2－△△Ct計(jì)算。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用GraphPad Prism 9.4統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1川芎-赤芍藥對(duì)及其有效成分對(duì)巨噬細(xì)胞泡沫化的影響

紅O染色后顯微鏡下可見(jiàn)：對(duì)照組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有少量的紅色微粒；模型組經(jīng)ox-LDL誘導(dǎo)后，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有大量亮紅色的脂滴，細(xì)胞體積變大，并出現(xiàn)了戒環(huán)樣的典型泡沫細(xì)胞形態(tài)；與模型組比較，川芎嗪組、芍藥苷組、川芎組、赤芍組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的紅色脂滴均顯著減少、變小，川芎嗪＋芍藥苷組及芎芍藥對(duì)組紅色脂滴減少更顯著。詳見(jiàn)圖1。

2.2川芎-赤芍藥對(duì)及其有效成分對(duì)泡沫細(xì)胞Hep mRNA表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，模型組Hep mRNA表達(dá)升高（P＜0.01）；與模型組比較，陽(yáng)性藥物組、川芎嗪組、芍藥苷組、川芎組、赤芍組、川芎嗪＋芍藥苷組、芎芍藥對(duì)組Hep mRNA表達(dá)均減少，且川芎嗪＋芍藥苷組降低最顯著，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。詳見(jiàn)圖2。

2.3川芎-赤芍藥對(duì)及其有效成分對(duì)泡沫細(xì)胞FPN mRNA表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，模型組FPN mRNA表達(dá)升高（P＜0.01）；與模型組比較，陽(yáng)性藥物組、赤芍組、川芎嗪＋芍藥苷組、芎芍藥對(duì)組FPN mRNA表達(dá)均降低，且陽(yáng)性藥物組降低最顯著，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。詳見(jiàn)圖3。

2.4川芎-赤芍藥對(duì)及其有效成分對(duì)泡沫細(xì)胞HFE mRNA表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，模型組HFE mRNA表達(dá)升高（P＜0.01）；與模型組比較，陽(yáng)性藥物組、川芎嗪組、芍藥苷組、川芎組、赤芍組、川芎嗪＋芍藥苷組、芎芍藥對(duì)組HFE mRNA表達(dá)均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。詳見(jiàn)圖4。

2.5川芎-赤芍藥對(duì)及其有效成分對(duì)泡沫細(xì)胞HJV mRNA表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，模型組HJV mRNA表達(dá)降低（P＜0.01）；與模型組比較，陽(yáng)性藥物組、川芎嗪組、芍藥苷組、川芎組、赤芍組、川芎嗪＋芍藥苷組、芎芍藥對(duì)組HJV mRNA表達(dá)均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。詳見(jiàn)圖5。

2.6川芎-赤芍藥對(duì)及其有效成分對(duì)泡沫細(xì)胞TfR2 mRNA表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，模型組TfR2 mRNA表達(dá)升高（P＜0.01）；與模型組比較，陽(yáng)性藥物組、川芎嗪組、芍藥苷組、川芎組、赤芍組、川芎嗪＋芍藥苷組、芎芍藥對(duì)組TfR2 mRNA表達(dá)均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。詳見(jiàn)圖6。

3討論

AS是引起心腦血管疾病的重要病理因素之一，嚴(yán)重威脅人類(lèi)的健康及生命，但具體機(jī)制尚未明確。有研究證實(shí)，鐵代謝紊亂與AS關(guān)系密切，可促進(jìn)脂質(zhì)過(guò)氧化、炎癥等病理過(guò)程，AS斑塊不穩(wěn)定、斑塊內(nèi)出血、鐵沉積及脂質(zhì)過(guò)氧化是晚期AS斑塊的重要特征［12］。相關(guān)研究顯示，在AS的發(fā)展過(guò)程中，鐵代謝相關(guān)信號(hào)通路有重要的關(guān)聯(lián)作用，Hepcidin/Ferroportin信號(hào)通路是鐵代謝主要的信號(hào)通路，該通路異常是AS的重要危險(xiǎn)因素，可能成為治療AS的新靶點(diǎn)。研究表明，Hep和FPN比例在AS的發(fā)病中發(fā)揮著重要的作用［13-14］。一項(xiàng)流行病學(xué)調(diào)查顯示，絕經(jīng)后的女性Hep水平與AS的發(fā)生關(guān)系密切，Hep和FPN比例與AS的發(fā)病密切相關(guān)［15］。體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，AS斑塊中的Hep水平升高，可促進(jìn)AS斑塊內(nèi)鐵沉積、炎癥反應(yīng)及脂質(zhì)在巨噬細(xì)胞聚積［16-17］。體外研究發(fā)現(xiàn)，ox-LDL通過(guò)刺激誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞Hep表達(dá)，內(nèi)化降解巨噬細(xì)胞膜的FPN，引起細(xì)胞內(nèi)鐵沉積，上調(diào)噬紅巨噬細(xì)胞內(nèi)聚積脂質(zhì)，從而誘發(fā)炎癥、氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡［18］。Wunderer等［12］研究指出，BMP-Hep-FPN軸可能作為預(yù)防和治療心血管疾病的新靶標(biāo)。

中醫(yī)藥在抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝等方面的多靶點(diǎn)作用使其在預(yù)防及抗AS方面有獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)。瘀血阻滯是AS主要的病因病機(jī)，活血化瘀是目前防治該病的有效策略。活血化瘀藥對(duì)（川芎-赤芍）是從經(jīng)典方血府逐瘀湯中精制簡(jiǎn)化得來(lái)［19］。川芎溫通辛散，是血中之氣藥，既化瘀活血又行血中氣滯；赤芍寒苦，散瘀止痛、涼血清熱；二藥配伍，增加活血化瘀功效同時(shí)借氣而行血，使破滯行血效力增倍。陳可冀院士治療冠心病經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入（PCI）術(shù)后血瘀證常用川芎-赤芍藥對(duì)，該藥對(duì)為治療該病的專(zhuān)方專(zhuān)藥［20］。川芎嗪為川芎發(fā)揮效用的主要成分，具有抗炎、減輕氧化應(yīng)激、抗血栓等作用［21］。芍藥苷為赤芍發(fā)揮效用的主要組分，可保護(hù)心臟、神經(jīng)，具有抗炎、抗凝、抗氧化等［22］。川芎-赤芍藥對(duì)及其效用組分相須互補(bǔ)，協(xié)同改善心腦血管疾病如AS等的病理變化［23］。多項(xiàng)研究顯示，活血化瘀中藥單體川芎嗪能有效改善AS小鼠鐵過(guò)載，降低血脂并抑制斑塊形成，具有調(diào)節(jié)機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)及抗氧化損傷的作用［18-19，24］。

本研究選用活血化瘀中藥藥對(duì)川芎-赤芍，構(gòu)建ox-LDL刺激誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞即AS體外模型，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組Hep、FPN、HFE、TfR2 mRNA表達(dá)均增多，HJV mRNA降低（P＜0.05）；與模型組比較，陽(yáng)性藥物組、川芎嗪組、芍藥苷組、川芎組、赤芍組、川芎嗪＋芍藥苷組、芎芍藥對(duì)組FPN、Hep、HFE、TfR2 mRNA表達(dá)均降低，HJV mRNA升高（P＜0.05）；油紅O結(jié)果提示巨噬細(xì)胞泡沫化模型造模成功，PCR結(jié)果證明模型組Hepcidin、FPN、HFE、TfR2表達(dá)增高、HJV降低，川芎-赤芍藥對(duì)及其有效成分可抑制其異常表達(dá)。提示中藥川芎-赤芍藥對(duì)及其有效成分通過(guò)降低Hepcidin、FPN、HFE、TfR2，升高HJV，調(diào)節(jié)Hepcidin/Ferroportin信號(hào)通路，從而發(fā)揮改善AS的作用。

綜上所述，鐵代謝及Hepcidin/Ferroportin軸為靶點(diǎn)的AS研究處于起步階段，活血化瘀藥對(duì)在AS過(guò)程中鐵代謝及Hepcidin/Ferroportin通路調(diào)節(jié)作用的研究較少，亟待開(kāi)發(fā)。本研究為川芎-赤芍藥對(duì)的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)，并為活血化瘀新藥中成藥的研發(fā)及機(jī)制研究提供Hepcidin相關(guān)的新靶點(diǎn)和新思路，為中醫(yī)藥的現(xiàn)代化發(fā)展提供了科學(xué)的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，對(duì)闡明AS病變加重、發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)及有效的治療藥物具有重要的臨床意義。

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（收稿日期：2023-03-31）

（本文編輯薛妮）