洪山菜薹抗根腫病新品系的創(chuàng)制

摘要：以抗根腫病紅菜薹（Brassica rapa ssp. chinensis var. purpurea）種質(zhì)資源GD1為抗源供體，以優(yōu)異洪山菜薹早熟品系DGZ1902為背景材料進(jìn)行回交轉(zhuǎn)育，針對(duì)抗源攜帶的抗病基因CRzi8開(kāi)發(fā)PARMS型分子標(biāo)記，進(jìn)一步結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇、單株優(yōu)選以及根腫病接種鑒定，創(chuàng)制抗根腫病洪山菜薹新品系。結(jié)果表明，開(kāi)發(fā)的標(biāo)記可準(zhǔn)確鑒定回交世代群體的抗性單株。田間病圃抗性鑒定及農(nóng)藝性狀觀察表明，創(chuàng)制的洪山菜薹抗根腫病品系CR-DGZ1902高抗根腫菌4號(hào)生理小種，同時(shí)具有洪山菜薹的農(nóng)藝性狀特征及DGZ1902的早熟特性。

關(guān)鍵詞：洪山菜薹； 分子標(biāo)記； 根腫??； 抗病基因； 新品系

中圖分類(lèi)號(hào)：S634.6" " " " "文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2024）12-0121-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.12.022 開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Development of new Hongshancaitai line with clubroot resistance

REN Zhi-yong， DONG Bin-feng， HE Qing-song， NIE Qi-jun

（Institute of Economic Crops， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan" 430064， China）

Abstract： Using clubroot resistance （CR） Brassica rapa ssp. chinensis var. purpurea germplasm GD1 as the resistant donor， and using DGZ1902， an early mature strain of Hongshancaitai， as the background material， backcross breeding was conducted. The penta-primer amplification refractory mutation system （PARMS） marker for CR gene CRzi8 carried by CR donor was developed and furtherly applied in the marker assistance selection （MAS）， single plant selection and identification of root disease inoculation， finally the new CR Hongshancaitai line was created. The results showed that the PAMRS marker for CRzi8 could accurately detect the CR individuals from the backcross breeding program. Field resistance test and agronomic traits evaluation indicated that the developed CR Hongshancaitai line CR-DGZ1902 was resistant to Plasmodiophora brassicae pathotype 4， and had both agronomic characteristics of Hongshancaitai and early maturity characteristics of DGZ1902.

Key words： Hongshancaitai； molecular marker； clubroot disease； resistance gene； new line

收稿日期：2024-09-02

基金項(xiàng)目：湖北省自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（2023AFB246）；國(guó)家大宗蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（CARS-23-G28）；湖北省支持種業(yè)高質(zhì)量發(fā)展資金項(xiàng)目（HBZY2023B004）

作者簡(jiǎn)介：任志勇（1990-），男，河南潢川人，助理研究員，博士，主要從事薹用白菜遺傳育種，（電話）13986269176（電子信箱）rzy595997565@163.com；通信作者，聶啟軍（1976-），男，湖北武漢人，副研究員，主要從事紅菜薹育種，（電話）13307152212（電子信箱）nqj@hbaas.com。

根腫病是十字花科蔬菜較為嚴(yán)重的土傳病害，根腫病的病原根腫菌屬原生動(dòng)物界根腫菌門(mén)根腫菌屬蕓薹根腫菌（Plasmodiophora brassicae Woronin），專性寄生于十字花科植物，其休眠孢子可在土壤中存活達(dá)7～20年，溫度約24 ℃，濕度60%～80%、pH為5.5～6.5的土壤環(huán)境下較利于其萌發(fā)和侵染寄主［1，2］。根腫病發(fā)病植株根系瘤狀腫大，喪失生理功能，目前尚無(wú)可行的植保防治手段，抗病育種是解決該病害的關(guān)鍵。當(dāng)前大宗十字花科蔬菜如大白菜、甘藍(lán)等已有抗病品種育成［3，4］，但一些具有地域特色的十字花科蔬菜抗根腫病育種亟待加強(qiáng)［5］。

洪山菜薹是武漢市特色蔬菜，也是中國(guó)地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品，被譽(yù)為“金殿御菜”［6］，因原產(chǎn)于武漢市武昌洪山區(qū)一帶而得名，在分類(lèi)學(xué)上屬不結(jié)球白菜變種紅菜薹（Brassica rapa ssp. chinensis var. purpurea）中原產(chǎn)于湖北省武漢市的一類(lèi)特殊地方品種類(lèi)型［7］，主要包括大股子、胭脂紅等品種，生育期90～150 d，耐寒能力強(qiáng)，可露地越冬，營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)旺盛。目前洪山菜薹產(chǎn)業(yè)正在逐步發(fā)展壯大，在湖北省種植面積約0.1萬(wàn)hm2，其中武漢市周邊種植面積占比接近50%［8］。同時(shí)，湖北省內(nèi)鄂西高山蔬菜產(chǎn)區(qū)、江漢平原等區(qū)域近年來(lái)的引種試種規(guī)模正在不斷擴(kuò)大，市場(chǎng)上也出現(xiàn)了早八股、“1902”等一批改良后的洪山菜薹新品系［9，10］。然而由于長(zhǎng)年連作，包括洪山菜薹原產(chǎn)地保護(hù)區(qū)域在內(nèi)的多個(gè)洪山菜薹種植基地根腫病頻繁發(fā)生，危害嚴(yán)重時(shí)30%以上植株感染根腫病，因此開(kāi)展抗病育種，做好抗根腫病洪山菜薹的品種儲(chǔ)備對(duì)支撐洪山菜薹產(chǎn)業(yè)尤為重要。

為了解決洪山菜薹產(chǎn)業(yè)中的根腫病危害問(wèn)題，本研究在前期抗根腫病紅菜薹育種的基礎(chǔ)上，選擇高抗根腫病紅菜薹的種質(zhì)資源GD1為抗源，以洪山菜薹早熟新品系DGZ1902為輪回親本，進(jìn)行抗根腫病洪山菜薹的創(chuàng)制。同時(shí)針對(duì)抗根腫病基因CRzi8開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記，用于每個(gè)世代的分子標(biāo)記輔助選擇，篩選到含有抗根腫病基因的單株后，進(jìn)一步通過(guò)田間性狀觀察，選取與背景材料最為接近的株系進(jìn)入下一輪回交。在連續(xù)兩代回交及一代自交后，獲得了商品薹性狀符合洪山菜薹標(biāo)準(zhǔn)的抗根腫病品系CR-DGZ1902。在抗性方面，根腫菌4號(hào)生理小種是湖北省內(nèi)根腫菌的優(yōu)勢(shì)生理小種［11］，經(jīng)苗期接種及田間病圃鑒定，該品系可高抗4號(hào)生理小種。

1 材料與方法

1.1 材料

含根腫菌4號(hào)生理小種的菌瘤，收集于湖北省宜昌市長(zhǎng)陽(yáng)縣火燒坪鄉(xiāng)根腫病重病田塊；具有洪山菜薹品系大股子遺傳背景的抗根腫病紅菜薹材料GD1［12］；早熟洪山菜薹品系DGZ1902。

1.2 方法

1.2.1 抗根腫病基因CRzi8的PARMS型分子標(biāo)記開(kāi)發(fā) 將CRzi8不同類(lèi)型的抗病與感病等位基因進(jìn)行比較，Crr1a是起源于蕪菁（Brassica rapa ssp. rapifera）且對(duì)4號(hào)生理小種同樣具有抗性的抗根腫病基因［13］，該基因是CRzi8的抗病等位基因，二者序列高度相似，Crr1a的序列從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲?。ǖ卿浱?hào)：AB605024.1），已有研究已經(jīng)取得CRzi8的序列［14］，洪山菜薹對(duì)應(yīng)的感病等位基因序列從最新組裝的洪山菜薹T2T基因組序列中提?。?5］。選擇代表性的SNP（Single nucleotide polymorphism，單核苷酸多態(tài)性）突變位點(diǎn)，將該位點(diǎn)轉(zhuǎn)化為基于PARMS（Penta-primer amplification refractory mutation system，五引物擴(kuò)增受阻突變體系）技術(shù)的分子標(biāo)記，PARMS為國(guó)產(chǎn)化的競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR檢測(cè)技術(shù)，原理與KASP分子標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)一致［16］。DNA提取采用CTAB法（Cetyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化銨法）進(jìn)行，PARMS分子標(biāo)記檢測(cè)體系體積為10 μL，各組分構(gòu)成：2×PARMS master mix 5 μL，Allele X primer（10 μmol/L）0.15 μL，Allele Y primer（10 μmol/L）0.15 μL，Common primer（10 μmol/L）0.4 μL，待測(cè)DNA（100 ng/μL）" " 1 μL，ddH2O 3.3 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性15 min；94 ℃變性20 s，65～57 ℃（-0.8 ℃/Cycle）1 min共10輪循環(huán)；94 ℃變性20 s，57 ℃ 1 min共32輪循環(huán)。PCR完成后，使用TECAN infinite M1000酶標(biāo)儀讀取熒光信號(hào)，然后利用在線軟件snpdecoder（http：//www.snpway.com/snpdecoder/）解析轉(zhuǎn)換熒光信號(hào)，得到清晰直觀的分型圖，并根據(jù)顏色不同輸出基因型結(jié)果。

1.2.2 根腫病抗性的接種鑒定 取出-20 ℃凍存的含根腫菌根瘤，解凍打碎，與育苗基質(zhì)按1∶20（質(zhì)量比）混合，25 ℃環(huán)境下放置48 h后播種。幼苗在溫室內(nèi)生長(zhǎng)4周后，調(diào)查發(fā)病情況。田間病圃鑒定則在湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院內(nèi)的根腫病病圃進(jìn)行，每年8月下旬按正常管理?xiàng)l件將材料定植于病圃中，苗接種鑒定及田間病圃鑒定的單株發(fā)病等級(jí)均分為0～3級(jí)：0級(jí)，根系無(wú)腫瘤；1級(jí)，側(cè)根上有輕微腫瘤；2級(jí)，主根與側(cè)根均有中等大小腫瘤；3級(jí)，根部嚴(yán)重腫大畸變。根據(jù)病情指數(shù)（Disease index，DI）劃定抗病等級(jí)，DI為0的材料為免疫；0lt;DI≤20為高抗；20lt;DI≤40為中抗；40lt;DI≤80為感?。籇Igt;80為高感。

1.2.3 抗根腫病洪山菜薹的回交轉(zhuǎn)育 2020—2022年秋季以DGZ1902為輪回親本，以抗根腫病紅菜薹GD1為抗源，開(kāi)展兩代回交及一代自交。每年8月10—20日播種，出苗后首先利用分子標(biāo)記CRzi8-sep開(kāi)展苗期輔助選擇，保留雜合抗病單株，25 d苗齡后定植雜合抗病單株及輪回親本。每個(gè)回交世代的農(nóng)藝性狀觀察與田間病圃抗性鑒定同時(shí)進(jìn)行，田間抗性鑒定以洪山菜薹品系DGZ1902為對(duì)照。2023年秋季，以DGZ1902為對(duì)照，分別在湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院楊家堰、新科園試驗(yàn)基地觀測(cè)優(yōu)選株系的自交后代的表現(xiàn)，兩個(gè)試驗(yàn)地均采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每個(gè)小區(qū)40株，3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗根腫病基因CRzi8的分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)

本試驗(yàn)中使用的抗根腫病紅菜薹材料中攜帶的抗根腫病基因?yàn)镃Rzi8，該基因?yàn)橐褕?bào)道抗根腫病基因Crr1a潛在的等位抗病基因，CRzi8與Crr1a在編碼區(qū)的第2302處堿基存在C到T非同義突變［14］。本研究基于此處突變結(jié)合PARMS特異性分子標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)，開(kāi)發(fā)了CRzi8的基因標(biāo)記CRzi8-sep（圖1）。其中抗病等位基因特異引物被標(biāo)記為HEX型熒光，感病等位基因標(biāo)記為FAM型熒光（表1），使用已知基因型的抗病、感病及雜合的DNA模板對(duì)該標(biāo)記進(jìn)行測(cè)試，其基因分型的結(jié)果顯示，3種基因型的熒光信號(hào)分區(qū)符合預(yù)期，其中綠色信號(hào)為HEX型熒光，代表抗病基因型，均聚合在Y軸附近，藍(lán)色信號(hào)為FAM型熒光代表的感病基因型，均聚合在X軸附近，雜合基因型為紅色信號(hào)，則大致分布在中心區(qū)域（圖1）。以上研究結(jié)果表明，基于PARMS技術(shù)開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記CRzi8-sep可以用于CRzi8基因的輔助選擇。

2.2 抗根腫病洪山菜薹新品系的轉(zhuǎn)育與篩選

以GD1為抗源供體，以DGZ1902為輪回親本，其中輪回親本作母本，分別于2020年秋季、2021年秋季在湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院本部的重病田塊內(nèi)連續(xù)進(jìn)行兩代的回交轉(zhuǎn)育。因GD1已具備一定洪山菜薹遺傳背景，兩個(gè)回交世代群體均表現(xiàn)出了洪山菜薹的偏晚熟特點(diǎn)，在11月中下旬抗根腫病洪山菜薹回交群體開(kāi)始抽薹，此時(shí)根據(jù)主薹及側(cè)薹表現(xiàn)，從早熟性、薹葉、薹色、口感等方面選擇接近洪山菜薹農(nóng)藝性狀的單株，授以DGZ1902的花粉，收獲回交后代種子。2022年秋季從BC2代群體中獲得1個(gè)早熟單株株系CR-DGZ1902，其熟性與DGZ1902接近，同時(shí)農(nóng)藝性狀又符合洪山菜薹特征，因此重點(diǎn)對(duì)該單株進(jìn)行了自交擴(kuò)繁。2023年秋季進(jìn)行苗期分子標(biāo)記輔助選擇以剔除CR-DGZ1902自交后代中的感病及雜合單株，同時(shí)進(jìn)行根腫病苗期接種與田間抗性鑒定，檢驗(yàn)純合抗病基因型單株的抗性。苗期接種與田間抗性鑒定的結(jié)果表明，純合抗病基因型單株僅少量苗在側(cè)根上發(fā)現(xiàn)輕微根瘤，表現(xiàn)為高抗（圖2）。

2.3 抗根腫病洪山菜薹的田間表現(xiàn)

將CR-DGZ1902自交后代中的純合抗病單株定植于湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院楊家堰、新科園試驗(yàn)基地，對(duì)其農(nóng)藝性狀進(jìn)行進(jìn)一步的觀察?？共沃耆后w在定植后85～95 d開(kāi)始抽薹，其熟性與DGZ1902的85～90 d熟性水平接近，植株生長(zhǎng)勢(shì)旺，耐寒，株高平均75～85 cm，開(kāi)展度90 cm左右，菜薹表皮亮紅色，薹基部粗壯，橫徑平均2.5 cm，粗的可達(dá)4.0 cm以上，薹長(zhǎng)38～53 cm，單薹重可達(dá)90 g以上，上部薹葉披針形，下部薹葉偏卵圓形，葉緣微鋸齒狀（圖3），抗病單株群體的產(chǎn)量與DGZ1902相比偏低，差異顯著或極顯著（表2）?？傮w而言，CR-DGZ1902具備洪山菜薹的基本特征，在熟性方面接近DGZ1902，田間抗性優(yōu)于DGZ1902（圖2），而在商品薹特征方面又與DGZ1902存在一定區(qū)別，商品薹性狀一致性仍低于DGZ1902。

3 小結(jié)與討論

近年來(lái)根腫病在特色十字花科蔬菜上的危害愈演愈烈，加之缺乏抗根腫病品種儲(chǔ)備，已給相關(guān)產(chǎn)業(yè)帶來(lái)巨大威脅［17，18］。洪山菜薹作為湖北省及武漢市周邊重要的十字花科特色蔬菜產(chǎn)業(yè)之一，面臨著越來(lái)越嚴(yán)重的根腫病危害，根腫病從侵染到癥狀初顯需10～16 d，發(fā)展到中期以后開(kāi)始出現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)體生長(zhǎng)遲滯、早衰的癥狀，而洪山菜薹在生長(zhǎng)的中后期，茁壯的營(yíng)養(yǎng)體是持續(xù)采收側(cè)薹的保證，因此根腫病對(duì)洪山菜薹生產(chǎn)的威脅更為嚴(yán)重［19］。因此，本研究創(chuàng)制的抗根腫病洪山菜薹新品系CR-DGZ1902對(duì)解決洪山菜薹產(chǎn)業(yè)上的根腫病問(wèn)題具有重要意義。該品系已在位于武漢市內(nèi)洪山菜薹原產(chǎn)地的根腫病重病田塊進(jìn)行試種，初步緩解了原產(chǎn)地的根腫病危害問(wèn)題。

本研究創(chuàng)制的新品系CR-DGZ1902農(nóng)藝性狀符合基本的洪山菜薹特征，同時(shí)也從輪回親本中導(dǎo)入了早熟特性，但在農(nóng)藝性狀如薹葉大小、商品薹順直度、商品薹一致性等方面仍與優(yōu)異洪山菜薹品系DGZ1902存在差異。從親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的不同種屬、變種導(dǎo)入抗病基因，常會(huì)因抗病基因所在染色體區(qū)段的交換重組頻率較低導(dǎo)致連鎖累贅，使得栽培種在獲得抗性基因的同時(shí)，其他農(nóng)藝性狀也發(fā)生變化［20，21］。前期研究表明，CRzi8基因起源于與紅菜薹親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的蕓薹種變種之一蕪菁，后被應(yīng)用于大白菜育種中［14，22］。CRzi8基因位于A08染色體上，在其前后存在1個(gè)約1.6 Mb的漸滲片段［14］，因此也不能排除CR-DGZ1902與其輪回親本的性狀差異由連鎖累贅導(dǎo)致。綜合以上分析，抗根腫病洪山菜薹新品系CR-DGZ1902仍需通過(guò)進(jìn)一步的回交轉(zhuǎn)育以擺脫連鎖累贅，并進(jìn)行多個(gè)世代的性狀選擇，使其成為一致性更高、性狀更優(yōu)異的抗根腫病洪山菜薹品系。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 張 慧，張淑江，李 菲，等.大白菜抗根腫病育種研究進(jìn)展［J］.園藝學(xué)報(bào)，2020，47（9）：1648-1662.

［2］ 蘇賀楠，秦六月，楊雙娟，等.大白菜根腫病抗感品種間的侵染過(guò)程及生理生化差異分析［J］.中國(guó)瓜菜，2024，37（6）：45-51.

［3］ 王麗麗，王 鑫，吳海東，等.抗根腫病中早熟大白菜新品種遼白27的選育［J］.中國(guó)蔬菜，2023（5）：105-107.

［4］ 何 超，祖貴東，趙慶煉，等.威寧縣夏秋抗根腫病結(jié)球甘藍(lán)品種篩選試驗(yàn)［J］.上海蔬菜，2024（1）：4-6.

［5］ 李崇娟，楊 鼎，呂鳳仙，等.抗根腫病長(zhǎng)柄芥育種材料的創(chuàng)制與鑒定［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2024，63（4）：82-89，95.

［6］ 張德純.武漢洪山菜薹［J］.中國(guó)蔬菜，2018（5）：94.

［7］ CHENG F，SUN R F，HOU X L，et al. Subgenome parallel selection is associated with morphotype diversification and convergent crop domestication in Brassica rapa and Brassica oleracea［J］.Nature genetics，2016，48（10）：1218-1224.

［8］ 馮 軍，袁尚勇，林處發(fā)，等.湖北省洪山菜薹產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀調(diào)查分析與對(duì)策［J］.長(zhǎng)江蔬菜，2022（18）：3-6.

［9］ 聶啟軍，朱鳳娟，任志勇，等.鄂西高山洪山菜薹栽培技術(shù)［J］.長(zhǎng)江蔬菜，2023（17）：5-9.

［10］ 聶啟軍，葉曉佑，馮 軍，等.洪山菜薹產(chǎn)業(yè)發(fā)展優(yōu)勢(shì)及制約因素探討［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2022，61（S1）：244-246.

［11］ PANG W X，LIANG Y，ZHAN Z X，et al. Development of a sinitic clubroot differential set for the pathotype classification of Plasmodiophora brassicae［J］.Frontiers in plant science，2020（11）：568771.

［12］ 聶啟軍，邱正明，朱鳳娟，等.抗根腫病紅菜薹新組合HCR1和HCR2的選育［J］.長(zhǎng)江蔬菜，2018（2）：41-44.

［13］ YANG Z Q，JIANG Y F，GONG J F，et al. R gene triplication confers European fodder turnip with improved clubroot resistance［J］.Plant biotechnology journal，2022（20）：1502-1517.

［14］ REN Z Y，LI J Q，ZHANG X Y，et al. Utilizing resequencing big data to facilitate Brassica vegetable breeding： Tracing introgression pedigree and developing highly specific markers for clubroot resistance［J］.Horticultural plant journal，2024，10（3）：771-783.

［15］ ZHOU Y F，YE H Z，LIU E W，et al.The complexity of structural variations in Brassica rapa revealed by assembly of two complete T2T genomes［J］.Science bulletin，2024（69）：2346-2351.

［16］ LU J，HOU J，OUYANG Y D，et al. A direct PCR-based SNP marker-assisted selection system （D-MAS） for different crops［J］.Molecular breeding，2020，40：9.

［17］ 胡 韜，徐 翔，賈 剛，等.苤藍(lán)根腫病全程綠控技術(shù)的田間應(yīng)用效果［J］.中國(guó)植保導(dǎo)刊，2020，40（10）：53-55.

［18］ 吳藝飛，丁茁荑，周曉波，等.菜薹根腫病顯微觀察及抗病性鑒定［J］.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2020，36（17）：129-133.

［19］ 吳仁鋒.洪山菜薹病害的識(shí)別與防治［J］.長(zhǎng)江蔬菜，2022（23）：53-54.

［20］ LIN T，ZHU G T，ZHANG J H，et al. Genomic analyses provide insights into the history of tomato breeding［J］. Nature genetics，2014，46（11）：1220-1226.

［21］ ZHANG L，SU W Q，TAO R，et al. RNA sequencing provides insights into the evolution of lettuce and the regulation of flavonoid biosynthesis［J］.Nature communications，2017，8（1）：2264.

［22］ 程 斐，宋 瑩，張清霞，等.大白菜衍生系‘CR117-95’抗根腫病基因鑒定與染色體定位分析［J］.分子植物育種，2024（1）：1-10.