蘿卜抽薹相關(guān)SRAP分子標(biāo)記篩選與分析

劉哲+許園園+蘇小俊

摘要：利用抽薹性狀差異較大的晚抽薹蘿卜品種L2和早抽薹蘿卜品種E6配制雜交組合，構(gòu)建F2群體。通過田間調(diào)查，選用極晚和極早抽薹單株分別構(gòu)建晚抽池（BSA-1）和早抽池（BSA-2），用288對SRAP組合對兩親本進(jìn)行PCR分析，共篩選出166對SRAP引物組合。通過2個基因池及基因池中各單株對篩選出的引物進(jìn)行復(fù)篩，獲得引物組合me3+em9，其在晚抽池中可擴(kuò)增出多態(tài)性片段LB；對156株F2單株進(jìn)行驗證發(fā)現(xiàn)，LB與晚抽薹基因緊密連鎖，其遺傳距離為5.7 cM。

關(guān)鍵詞：蘿卜；晚抽薹；分子標(biāo)記；遺傳距離

中圖分類號： Q943；S631.103文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0074-03

抽薹開花是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的一個重要現(xiàn)象，不僅對植物生殖器官的形成起關(guān)鍵作用，而且關(guān)乎到植物的生物產(chǎn)量和產(chǎn)品品質(zhì)。先期抽薹在十字花科作物栽培上是一個倍受關(guān)注的問題，不僅會降低十字花科作物的生物產(chǎn)量，而且會影響到產(chǎn)品的品質(zhì)，晚抽薹是十字花科作物一個重要的育種目標(biāo)[1]。生物技術(shù)的發(fā)展給作物遺傳育種研究帶來巨大變化，分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用是其中之一。分子標(biāo)記具有位點豐富、多態(tài)性高、穩(wěn)定可靠等特點，且檢測不受時間和性狀表達(dá)限制，可鑒別基因型的純合或雜合。本研究利用與晚抽薹基因緊密連鎖的分子標(biāo)記可以方便準(zhǔn)確識別不同晚抽薹基因的特點，通過群體分離分析法（BSA）篩選出與晚抽薹蘿卜基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，以實現(xiàn)分子標(biāo)記輔助育種，減少蘿卜選育過程中對表型性狀的依賴，從而大大提高蘿卜的育種效率。

1材料與方法

1.1材料

蘿卜晚抽薹品種L2，為韓國白玉春蘿卜第9代自交系；早抽薹品種E6，為短葉13蘿卜第10代自交系，均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所提供。將晚抽薹與早抽薹親本進(jìn)行雜交再自交，形成F2分離世代群體共計156株單株。引物由上海英俊進(jìn)行合成；dNTPs、TaqDNA聚合酶等分子生物學(xué)試劑，均購于TaKaRa公司。

1.2試驗方法

1.2.1DNA提取與檢測試驗于2014年在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所高效園藝作物遺傳改良重點實驗室進(jìn)行，基因組DNA提取采用改良的CTAB法。采用DYY-Ⅲ-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，緩沖液為1.2%TAE，瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳時電壓100 V（5 V/cm），時間為1 h。電泳結(jié)束，在 FR-200 紫外可見分析裝置上檢測、照相，記錄結(jié)果。

1.2.2SRAP反應(yīng)采用優(yōu)化的SRAP反應(yīng)體系，SRAP引物序列參考Li等信息[2-3]。PCR反應(yīng)體系（10 μL）為：3.0 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L dNTPs，0.3 μmol/L上、下游引物，0.6 U TaqDNA聚合酶，20 ng模板DNA。PCR反應(yīng)程序為94 ℃變性3 min；94 ℃ 60 s，35 ℃ 60 s，72 ℃ 90 s，5個循環(huán)；94 ℃ 60 s，50 ℃ 60 s，72 ℃ 90 s，33個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，80 V預(yù)電泳30 min，160 V電泳2.5 h。凝膠中含有Arc ∶[KG-*3]Bis為29 ∶[KG-*3]1 6.65 mL，5×TBE 5 mL，TEMED 20 μL，10%AP 0.3 mL。1×TBE電泳緩沖液配方（1 L）為：0.054 g Tris，0027 5 g硼酸，0.25 mol/L EDTA 0.04 mL，pH值為8.0。電泳結(jié)束，采用0.5%冰醋酸、10%乙醇固定15～20 min，0.2% AgNO3溶液染色12～15 min；蒸餾水洗滌2次，于含1.5%NaOH、0.4%甲醛、0.002% Na2S2O3的顯影液中顯影，白熾燈箱下觀察拍照。

1.2.3引物篩選利用蘿卜晚抽薹品種代號L2和早抽薹品種E6的DNA為模板，從現(xiàn)有288對SRAP引物中篩選出雙親間存在多態(tài)性、條帶清楚、易于識別、可以穩(wěn)定擴(kuò)增的引物；基于抽薹性狀表現(xiàn)型，在F2群體中選取極早抽薹和極晚抽薹單株各10株，構(gòu)建早抽池（BSA-1）及晚抽池（BSA-2），待幼苗長至5葉1心時提取DNA，等量混合；分別提取各單株基因組DNA，以早抽池、晚抽池及2個基因池中各單株 DNA 為模板，對篩選出的多態(tài)性引物進(jìn)行再次篩選，尋找可能與目標(biāo)基因連鎖的標(biāo)記；用獲得的DNA標(biāo)記對F2群體進(jìn)行標(biāo)記。PCR 產(chǎn)物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計及連鎖分析

用篩選到的具有多態(tài)性引物組合對待檢測F2群體的DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，統(tǒng)計有差異、易于識別的多態(tài)性條帶，有帶記為1，無帶記為0。田間調(diào)查時，分別以1、0記錄晚抽薹、早抽薹的植株；根據(jù)引物擴(kuò)增結(jié)果，建立SRAP數(shù)據(jù)庫；使用Joinmap 4.0分析分子標(biāo)記，設(shè)最小LOD值為3.0，并用Kosambi函數(shù)將重組值轉(zhuǎn)換成圖距單位（cM）。

2結(jié)果與分析

[FL（2K2]em9進(jìn)一步驗證，各標(biāo)記在分離群體中并非表現(xiàn)為全有和全無的差別，有少數(shù)晚抽薹蘿卜單株未能擴(kuò)增出差異條帶，同樣也有少數(shù)早抽薹單株擴(kuò)增產(chǎn)生差異條帶。用Joinmap 4.0軟件對分子標(biāo)記進(jìn)行分析得知，me3+em9與蘿卜晚抽薹基因緊密連鎖，其遺傳距離為5.7 cM（圖4）。

3結(jié)論與討論

分子標(biāo)記技術(shù)與其他分子生物學(xué)研究相比，具有簡單快捷的優(yōu)點。相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（SRAP）是Li等[2]發(fā)展的一種分子標(biāo)記方法，具有簡便、產(chǎn)率高、可顯示大量的共顯性標(biāo)記、易從序列中得到分離條帶等優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于圖譜構(gòu)建、比較基因組學(xué)、基因克隆和遺傳多樣性等研究[4-9]。Li等在對羽衣甘藍(lán)×花椰菜的RI系構(gòu)建遺傳圖譜時，用SRAP成功標(biāo)記了芥子油脫飽和基因BoGLSALK，該基因在圖譜Ll連鎖群上距SRAPl33標(biāo)記為1.4 cM[7]。另外，研究人員在中國白菜中發(fā)現(xiàn)了1個與雄性不育基因有關(guān)的SRAP標(biāo)記，在油菜中篩選到1個與恢復(fù)基因連鎖的SRAP標(biāo)記，在芹菜中獲得1個與病毒抗性基因緊密連鎖的SRAP標(biāo)記[10]。

抽薹性狀屬于數(shù)量性狀遺傳，易受環(huán)境條件的限制影響。目前，利用分子標(biāo)記技術(shù)對抽薹性狀的研究已有諸多報道。Ken等通過甘藍(lán)和青花菜的F2群體RFLP連鎖圖，鑒定出控制從種植至現(xiàn)蕾天數(shù)的主效基因位于第2、第7連鎖群上，從種植到現(xiàn)蕾的天數(shù)、現(xiàn)蕾到開花的天數(shù)這2個性狀的許多標(biāo)記位點密切相關(guān)。曹維榮等運用RAPD技術(shù)，采用混合分離群體法（BSA）對甘藍(lán)遲抽蔓基因相連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行研究，得到與甘藍(lán)遲抽蔓基因相連鎖的RAPD標(biāo)記Nl-750，其連鎖距離為7.9 cM[11]。卓祖闖等運用RAPD、SRAP、RSAP、SSR、SCAR技術(shù)，采用BSA法對大白菜晚抽蔓基因緊密連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行研究，分別獲得1個晚抽蔓基因緊密連鎖的RAPD標(biāo)記和RSAP標(biāo)記，同時獲得1個與早抽蔓基因連鎖的SRAP標(biāo)記[12]。

本研究中，從288對引物中篩選獲得116對可以在雙親間穩(wěn)定擴(kuò)增出清晰條帶、表現(xiàn)出多態(tài)性的引物組合，多態(tài)率為40.3%；將116對引物的PCR產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯凝膠酰胺電泳構(gòu)建圖譜，共得到條帶285條，其中多態(tài)性條帶為66條，多態(tài)率為23.2%，每對引物擴(kuò)增出的條帶數(shù)量范圍為0～40，多態(tài)性條帶的數(shù)量范圍為0～5，得到與蘿卜晚抽薹基因緊密連鎖的標(biāo)記1個，其遺傳距離為5.7 cM。這為以后的蘿卜晚抽薹育種提供了理論基礎(chǔ)。

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