蘿卜抽薹相關(guān)SRAP分子標(biāo)記篩選與分析

劉哲+許園園+蘇小俊

摘要：利用抽薹性狀差異較大的晚抽薹蘿卜品種L2和早抽薹蘿卜品種E6配制雜交組合，構(gòu)建F2群體。通過(guò)田間調(diào)查，選用極晚和極早抽薹單株分別構(gòu)建晚抽池（BSA-1）和早抽池（BSA-2），用288對(duì)SRAP組合對(duì)兩親本進(jìn)行PCR分析，共篩選出166對(duì)SRAP引物組合。通過(guò)2個(gè)基因池及基因池中各單株對(duì)篩選出的引物進(jìn)行復(fù)篩，獲得引物組合me3+em9，其在晚抽池中可擴(kuò)增出多態(tài)性片段LB；對(duì)156株F2單株進(jìn)行驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，LB與晚抽薹基因緊密連鎖，其遺傳距離為5.7 cM。

關(guān)鍵詞：蘿卜；晚抽薹；分子標(biāo)記；遺傳距離

中圖分類(lèi)號(hào)： Q943；S631.103文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號(hào)：1002-1302（2016）08-0074-03

抽薹開(kāi)花是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的一個(gè)重要現(xiàn)象，不僅對(duì)植物生殖器官的形成起關(guān)鍵作用，而且關(guān)乎到植物的生物產(chǎn)量和產(chǎn)品品質(zhì)。先期抽薹在十字花科作物栽培上是一個(gè)倍受關(guān)注的問(wèn)題，不僅會(huì)降低十字花科作物的生物產(chǎn)量，而且會(huì)影響到產(chǎn)品的品質(zhì)，晚抽薹是十字花科作物一個(gè)重要的育種目標(biāo)[1]。生物技術(shù)的發(fā)展給作物遺傳育種研究帶來(lái)巨大變化，分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用是其中之一。分子標(biāo)記具有位點(diǎn)豐富、多態(tài)性高、穩(wěn)定可靠等特點(diǎn)，且檢測(cè)不受時(shí)間和性狀表達(dá)限制，可鑒別基因型的純合或雜合。本研究利用與晚抽薹基因緊密連鎖的分子標(biāo)記可以方便準(zhǔn)確識(shí)別不同晚抽薹基因的特點(diǎn)，通過(guò)群體分離分析法（BSA）篩選出與晚抽薹蘿卜基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，以實(shí)現(xiàn)分子標(biāo)記輔助育種，減少蘿卜選育過(guò)程中對(duì)表型性狀的依賴(lài)，從而大大提高蘿卜的育種效率。

1材料與方法

1.1材料

蘿卜晚抽薹品種L2，為韓國(guó)白玉春蘿卜第9代自交系；早抽薹品種E6，為短葉13蘿卜第10代自交系，均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所提供。將晚抽薹與早抽薹親本進(jìn)行雜交再自交，形成F2分離世代群體共計(jì)156株單株。引物由上海英俊進(jìn)行合成；dNTPs、TaqDNA聚合酶等分子生物學(xué)試劑，均購(gòu)于TaKaRa公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1DNA提取與檢測(cè)試驗(yàn)于2014年在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所高效園藝作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，基因組DNA提取采用改良的CTAB法。采用DYY-Ⅲ-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，緩沖液為1.2%TAE，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電泳時(shí)電壓100 V（5 V/cm），時(shí)間為1 h。電泳結(jié)束，在 FR-200 紫外可見(jiàn)分析裝置上檢測(cè)、照相，記錄結(jié)果。

1.2.2SRAP反應(yīng)采用優(yōu)化的SRAP反應(yīng)體系，SRAP引物序列參考Li等信息[2-3]。PCR反應(yīng)體系（10 μL）為：3.0 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L dNTPs，0.3 μmol/L上、下游引物，0.6 U TaqDNA聚合酶，20 ng模板DNA。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃變性3 min；94 ℃ 60 s，35 ℃ 60 s，72 ℃ 90 s，5個(gè)循環(huán)；94 ℃ 60 s，50 ℃ 60 s，72 ℃ 90 s，33個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，80 V預(yù)電泳30 min，160 V電泳2.5 h。凝膠中含有Arc ∶[KG-*3]Bis為29 ∶[KG-*3]1 6.65 mL，5×TBE 5 mL，TEMED 20 μL，10%AP 0.3 mL。1×TBE電泳緩沖液配方（1 L）為：0.054 g Tris，0027 5 g硼酸，0.25 mol/L EDTA 0.04 mL，pH值為8.0。電泳結(jié)束，采用0.5%冰醋酸、10%乙醇固定15～20 min，0.2% AgNO3溶液染色12～15 min；蒸餾水洗滌2次，于含1.5%NaOH、0.4%甲醛、0.002% Na2S2O3的顯影液中顯影，白熾燈箱下觀(guān)察拍照。

1.2.3引物篩選利用蘿卜晚抽薹品種代號(hào)L2和早抽薹品種E6的DNA為模板，從現(xiàn)有288對(duì)SRAP引物中篩選出雙親間存在多態(tài)性、條帶清楚、易于識(shí)別、可以穩(wěn)定擴(kuò)增的引物；基于抽薹性狀表現(xiàn)型，在F2群體中選取極早抽薹和極晚抽薹單株各10株，構(gòu)建早抽池（BSA-1）及晚抽池（BSA-2），待幼苗長(zhǎng)至5葉1心時(shí)提取DNA，等量混合；分別提取各單株基因組DNA，以早抽池、晚抽池及2個(gè)基因池中各單株 DNA 為模板，對(duì)篩選出的多態(tài)性引物進(jìn)行再次篩選，尋找可能與目標(biāo)基因連鎖的標(biāo)記；用獲得的DNA標(biāo)記對(duì)F2群體進(jìn)行標(biāo)記。PCR 產(chǎn)物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及連鎖分析

用篩選到的具有多態(tài)性引物組合對(duì)待檢測(cè)F2群體的DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，統(tǒng)計(jì)有差異、易于識(shí)別的多態(tài)性條帶，有帶記為1，無(wú)帶記為0。田間調(diào)查時(shí)，分別以1、0記錄晚抽薹、早抽薹的植株；根據(jù)引物擴(kuò)增結(jié)果，建立SRAP數(shù)據(jù)庫(kù)；使用Joinmap 4.0分析分子標(biāo)記，設(shè)最小LOD值為3.0，并用Kosambi函數(shù)將重組值轉(zhuǎn)換成圖距單位（cM）。

2結(jié)果與分析

[FL（2K2]em9進(jìn)一步驗(yàn)證，各標(biāo)記在分離群體中并非表現(xiàn)為全有和全無(wú)的差別，有少數(shù)晚抽薹蘿卜單株未能擴(kuò)增出差異條帶，同樣也有少數(shù)早抽薹單株擴(kuò)增產(chǎn)生差異條帶。用Joinmap 4.0軟件對(duì)分子標(biāo)記進(jìn)行分析得知，me3+em9與蘿卜晚抽薹基因緊密連鎖，其遺傳距離為5.7 cM（圖4）。

3結(jié)論與討論

分子標(biāo)記技術(shù)與其他分子生物學(xué)研究相比，具有簡(jiǎn)單快捷的優(yōu)點(diǎn)。相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（SRAP）是Li等[2]發(fā)展的一種分子標(biāo)記方法，具有簡(jiǎn)便、產(chǎn)率高、可顯示大量的共顯性標(biāo)記、易從序列中得到分離條帶等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于圖譜構(gòu)建、比較基因組學(xué)、基因克隆和遺傳多樣性等研究[4-9]。Li等在對(duì)羽衣甘藍(lán)×花椰菜的RI系構(gòu)建遺傳圖譜時(shí)，用SRAP成功標(biāo)記了芥子油脫飽和基因BoGLSALK，該基因在圖譜Ll連鎖群上距SRAPl33標(biāo)記為1.4 cM[7]。另外，研究人員在中國(guó)白菜中發(fā)現(xiàn)了1個(gè)與雄性不育基因有關(guān)的SRAP標(biāo)記，在油菜中篩選到1個(gè)與恢復(fù)基因連鎖的SRAP標(biāo)記，在芹菜中獲得1個(gè)與病毒抗性基因緊密連鎖的SRAP標(biāo)記[10]。

抽薹性狀屬于數(shù)量性狀遺傳，易受環(huán)境條件的限制影響。目前，利用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)抽薹性狀的研究已有諸多報(bào)道。Ken等通過(guò)甘藍(lán)和青花菜的F2群體RFLP連鎖圖，鑒定出控制從種植至現(xiàn)蕾天數(shù)的主效基因位于第2、第7連鎖群上，從種植到現(xiàn)蕾的天數(shù)、現(xiàn)蕾到開(kāi)花的天數(shù)這2個(gè)性狀的許多標(biāo)記位點(diǎn)密切相關(guān)。曹維榮等運(yùn)用RAPD技術(shù)，采用混合分離群體法（BSA）對(duì)甘藍(lán)遲抽蔓基因相連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行研究，得到與甘藍(lán)遲抽蔓基因相連鎖的RAPD標(biāo)記Nl-750，其連鎖距離為7.9 cM[11]。卓祖闖等運(yùn)用RAPD、SRAP、RSAP、SSR、SCAR技術(shù)，采用BSA法對(duì)大白菜晚抽蔓基因緊密連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行研究，分別獲得1個(gè)晚抽蔓基因緊密連鎖的RAPD標(biāo)記和RSAP標(biāo)記，同時(shí)獲得1個(gè)與早抽蔓基因連鎖的SRAP標(biāo)記[12]。

本研究中，從288對(duì)引物中篩選獲得116對(duì)可以在雙親間穩(wěn)定擴(kuò)增出清晰條帶、表現(xiàn)出多態(tài)性的引物組合，多態(tài)率為40.3%；將116對(duì)引物的PCR產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯凝膠酰胺電泳構(gòu)建圖譜，共得到條帶285條，其中多態(tài)性條帶為66條，多態(tài)率為23.2%，每對(duì)引物擴(kuò)增出的條帶數(shù)量范圍為0～40，多態(tài)性條帶的數(shù)量范圍為0～5，得到與蘿卜晚抽薹基因緊密連鎖的標(biāo)記1個(gè)，其遺傳距離為5.7 cM。這為以后的蘿卜晚抽薹育種提供了理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：[HJ1.78mm]

[1]黃細(xì)松. 白菜開(kāi)花時(shí)間相關(guān)基因的分子標(biāo)記及春化相關(guān)基因的克隆和表達(dá)分析[D]. 杭州：浙江大學(xué)，2006.

[2]Li G，Quiros C F. Sequence-related amplified polymorhism（SRAP），a new marker system based on a simple PCR reaction：its application to mapping and gene tagging in Brassica[J]. Theoretical and Applied Genetics，2001，103（2）：455-461.

[3]張波. 不結(jié)球白菜晚抽蔓分子標(biāo)記及抽蓄性遺傳分析[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[4]劉雅輝，閆紅飛，楊文香，等. 小麥抗葉銹病基因[WTBX][STBX]Lr19[WTBZ][STBZ]的SRAP標(biāo)記[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2007，22（4）：193-196.

[5]陳暉，陳美霞，陶愛(ài)芬，等. 長(zhǎng)果種黃麻SRAP標(biāo)記遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建及3個(gè)質(zhì)量性狀基因定位[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，44（12）：2422-2430.

[6]Yeboah M X. A genetic linkage map of cucumber （Cucumis sativus L.） combining SRAP and ISSR markers[J]. African Journal of Biotechnology，2007（6）：2784-2791.

[7]Li G，Gao M，Yang B，et al. Gene for gene alignment between the Brassica and Arabidopsis genomes by direct transcriptome mapping[J]. Theoretical and Applied Genetics，2003，107（1）：168-180.

[8]Xu L，Wang L J，Gong Y Q，et al. Genetic linkage map construction and QTL mapping of cadmium accumulation in radish （Raphanus sativus L.）[J]. Theoretical and Applied Genetics，2012，125（4）：659-670.

[9]張冬菊，李世超，吳鵬夫，等. 基于表型和SRAP標(biāo)記的切花菊品種遺傳多樣性分析[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2014，41（1）：118-130.[ZK）]

[10]柳李旺，龔義勤，黃浩，等. 新型分子標(biāo)記SRAP與TRAP及其應(yīng)用[J]. 遺傳，2004，26（5）：777-781.

[11]曹維榮，王超. 甘藍(lán)遲抽薹基因的RAPD標(biāo)記[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，2007（5）：167-169.

[12]卓祖闖，萬(wàn)恩梅，張魯剛，等. 大白菜抽薹性狀的主基因+多基因遺傳分析[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，2009，29（5）：923-928.