大白菜種質(zhì)資源抗根腫病基因CRa和CRb的分子標(biāo)記鑒定與分析

孫朝輝+馬安峰+曹丹丹+程斐+高建偉

摘 要：大白菜根腫病是一種嚴(yán)重影響大白菜生長(zhǎng)的土傳病害，已成為大白菜重要病害之一。CRa和CRb是大白菜抗根腫病的兩個(gè)重要基因。本研究對(duì)已發(fā)表的4個(gè)CRa分子標(biāo)記進(jìn)行篩選，選出1對(duì)與CRa基因緊密連鎖的標(biāo)記，包括抗病基因標(biāo)記SC2930-T和感病基因標(biāo)記SC2930-Q。利用該CRa基因標(biāo)記和已經(jīng)驗(yàn)證的CRb基因標(biāo)記TCR05對(duì)24份推廣或擬推廣大白菜品種進(jìn)行篩選，選出同時(shí)具有CRa與CRb基因的品種12份，只有CRa基因、沒有CRb基因的品種5份，只有CRb基因、沒有CRa基因的品種3份，CRa與CRb基因均不含有的品種4份，表明CRa與CRb基因均為獨(dú)立遺傳的顯性抗性基因。本研究對(duì)大白菜抗根腫病分子標(biāo)記輔助育種具有重要的參考價(jià)值。

關(guān)鍵詞：大白菜；種質(zhì)資源；根腫??；CRa與CRb；分子標(biāo)記

中圖分類號(hào)：S634.1+Q78文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2016）12-0016-05

Abstract Clubroot disease is one of the most serious diseases of Chinese cabbage （Brassica rapa） caused by the soil-borne plant pathogen Plasmodiophora brassicae. CRa and CRb are the two important genes against to clubroot disease in Chinese cabbage breeding. In this research， we selected a pair of effective SCAR makers SC2930-T and SC2930-Q to detect CRa gene from four published candidates. Depending on this pair of markers and another effective codominant marker TCR05 closely linked to CRb gene， 12 varieties both with CRa and CRb genes， 5 varieties only with CRa gene， 3 varieties only with CRb gene and 4 varieties with neither CRa nor CRb genes were screened out from 24 important Chinese cabbage varieties. This research results showed that both CRa and CRb were independent dominant genes resistant to clubroot disease in Chinese cabbage. This research had great reference values for molecular marker assisted breeding of Chinese cabbage resistant to clubroot disease.

Keywords Chinese cabbage； Germplasm resources； Clubroot disease； CRa and CRb； Molecular markers

大白菜根腫病是由蕓薹根腫菌（Plasmodiophora brassicae Woron.）侵染引起的土傳性病害，嚴(yán)重危害十字花科蔬菜的生產(chǎn)。在我國(guó)云南、四川、山東等地，大白菜根腫病發(fā)生面積已經(jīng)超過種植面積的65%，部分田塊的損失超過50%，嚴(yán)重制約大白菜的生產(chǎn)[1]。實(shí)踐證明，培育抗根腫病品種是防治大白菜根腫病的重要措施。迄今為止，在亞洲蕓薹種中尚未鑒定出十字花科根腫病抗性種質(zhì)，大白菜根腫病抗源均來源于地中海43份CR蕪菁品系，表現(xiàn)出高抗甚至免疫[2]。目前在大白菜上已經(jīng)鑒定出8個(gè)與抗根腫病有關(guān)的基因位點(diǎn)，包括位于A03染色體上的CRa、CRb、CRk和Crr3，以及分別位于A08、A01、A06、A02染色體上的Crr1、Crr2、Crr4和CRC[3-7]。CRa、CRb是兩個(gè)重要的抗根腫病基因，但目前國(guó)內(nèi)利用分子標(biāo)記對(duì)大白菜種質(zhì)資源中這兩個(gè)基因進(jìn)行鑒定的研究報(bào)道不多，限制其育種進(jìn)程。本研究對(duì)國(guó)外已發(fā)表的4個(gè)CRa標(biāo)記進(jìn)行篩選，并利用篩選出的CRa標(biāo)記和我們已經(jīng)驗(yàn)證的CRb標(biāo)記對(duì)來源于國(guó)內(nèi)外的24份重要大白菜種質(zhì)資源進(jìn)行鑒定，并對(duì)CRa和CRb兩個(gè)基因的連鎖關(guān)系進(jìn)行分析，以期為大白菜抗根腫病育種提供高質(zhì)量的抗性種質(zhì)資源和準(zhǔn)確便捷的輔助鑒定方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試大白菜品種共24個(gè)（表1），其中1號(hào)為對(duì)照，是青島地區(qū)主栽品種87-114，其余均為國(guó)內(nèi)外公司最近幾年已經(jīng)推廣或正在測(cè)試的抗根腫病品種。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取及PCR擴(kuò)增條件 取5葉1心期幼嫩的大白菜內(nèi)葉為試材，DNA提取方法參照Williamson等[8]的CTAB法。

PCR反應(yīng)總體積為20 μL：在48孔PCR板中分別加入PCR Master Mix （2×） 10 μL，上游引物和下游引物（10 U/μL）各1 μL，50 ng/μL模板DNA 2 μL，ddH2O補(bǔ)齊至20 μL。

PCR的反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性1 min，55℃退火1.5 min，72℃延伸1.5min，35個(gè)循環(huán)；72℃重延伸10 min，4℃保存。

PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠、電壓5 V/cm條件下電泳1 h，用Goodview染色，Bio-RAD凝膠成像系統(tǒng)成像，觀察并保留結(jié)果。

上述試驗(yàn)所用試劑均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2.2 抗根腫病基因CRa分子標(biāo)記驗(yàn)證與種質(zhì)資源篩選 利用已發(fā)表的4個(gè)SCAR標(biāo)記（表2）對(duì)24份大白菜種質(zhì)資源基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選出與CRa基因緊密連鎖的標(biāo)記，同時(shí)對(duì)種質(zhì)資源中的CRa基因進(jìn)行鑒定。

1.2.3 種質(zhì)資源抗根腫病基因CRb的鑒定 采用已驗(yàn)證的CRb基因SCAR標(biāo)記TCR05對(duì)24份大白菜種質(zhì)資源基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)種質(zhì)資源中的CRb基因進(jìn)行鑒定。TCR05序列，F(xiàn)：5′-AGAATCATGACCGGGGAAAT-3′；R：5′-GCAGCTAAGTCATCGACCAA-3′。

1.2.4 大白菜抗病性鑒定 將采自青島嶗山區(qū)根腫病發(fā)病嚴(yán)重的大白菜病根洗凈后加入適量的水，用粉碎機(jī)磨碎呈勻漿，四層紗布過濾，冷凍離心機(jī)4 000 r/min離心10 min，棄上清，用蒸餾水懸浮沉淀，共重復(fù)3次后棄上清，用蒸餾水將懸浮液孢子濃度調(diào)至2×108個(gè)/mL，4℃保存?zhèn)溆肹9]。

大白菜種質(zhì)資源種子催芽后播于穴盤中。穴盤中所用基質(zhì)為品氏進(jìn)口草炭，用前經(jīng)過高溫滅菌。播種前將每穴下壓成0.5 cm的凹槽，用移液器吸取菌液5 mL注射底部，并將催芽的種子播入其中，覆蓋好。試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)每份種質(zhì)資源播25穴，隨機(jī)排列。播種后，放置在日光溫室中培養(yǎng)。日光溫室白天溫度為20～28℃，夜間為12～20℃。待苗長(zhǎng)到3～4片真葉時(shí)定苗，每穴留一株。35天后將植株取出，洗凈根部泥土，調(diào)查記錄，主根和側(cè)根都無腫瘤記為抗病，只要在主根、側(cè)根或須根出現(xiàn)腫瘤，不分大小均記為感病。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗病基因CRa分子標(biāo)記驗(yàn)證與種質(zhì)資源抗病性鑒定

利用與CRa連鎖的4對(duì)分子標(biāo)記在24份大白菜種質(zhì)資源中進(jìn)行擴(kuò)增，其中3對(duì)引物HC352-2、HC352b7和HC352b16的擴(kuò)增結(jié)果與對(duì)照感病品種相比未表現(xiàn)多態(tài)性和差異性。只有抗病基因標(biāo)記SC2930-T和感病基因標(biāo)記SC2930-Q表現(xiàn)多態(tài)性?？共』驑?biāo)記SC2930-T在17份種質(zhì)資源中擴(kuò)增出800 bp的特異性片段，感病基因標(biāo)記SC2930-Q在14份種質(zhì)資源中也擴(kuò)增出800 bp的特異性片段。

從圖1和圖2可以看出，種質(zhì)資源1、2、5、7、8、17、19沒有標(biāo)記出抗病基因位點(diǎn)，而標(biāo)記出感病基因位點(diǎn)，因此不含抗病基因CRa；9、10、11、14、16、18、20、22、24標(biāo)記出抗病基因位點(diǎn)，而沒有標(biāo)記出感病基因位點(diǎn)，因此抗病基因CRa等位基因是純合的；3、4、6、12、13、15、21、23既標(biāo)記出抗病基因位點(diǎn)，又標(biāo)記出感病基因位點(diǎn)，因此抗病基因CRa的等位基因是雜合的。

從表3可以看出，含有CRa抗病基因的種質(zhì)資源，無論是純合還是雜合，人工接種的結(jié)果都表現(xiàn)為抗病，說明CRa抗病基因是一個(gè)顯性基因。在不含有CRa抗病基因的種質(zhì)資源中，1、7表現(xiàn)為感病，2、5、8、17、19表現(xiàn)為抗病。

2.2 種質(zhì)資源CRb抗病基因的篩選與抗病性鑒定

利用SCAR標(biāo)記TCR05在24份大白菜種質(zhì)資源中進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)抗病基因CRb進(jìn)行鑒定。從圖3可以看出，4、9、12、16、24均只擴(kuò)增出一條279 bp的片段，表明含有等位基因純合的抗病基因CRb；2、3、8、11、13、14、18、19、21、22均擴(kuò)增出279、250 bp兩條片段，表明含有等位基因雜合的抗病基因CRb；1、5、6、7、10、15、17、20、23均只擴(kuò)增出一條250 bp的片段，表明不含抗病基因CRb。

從表4可以看出，含有CRb抗病基因的種質(zhì)資源，無論抗病基因位點(diǎn)是純合還是雜合，人工接種的結(jié)果都表現(xiàn)為抗病，說明CRb抗病基因也是一個(gè)顯性基因。在不含有CRb抗病基因的種質(zhì)資源中，5、6、10、15、17、20、23表現(xiàn)為抗病，1、7表現(xiàn)為感病。在既不含有CRa基因也不含有CRb基因的4份種質(zhì)資源中，5、17表現(xiàn)抗病，1、7表現(xiàn)感病。

3 討論與結(jié)論

利用CRa的抗病基因標(biāo)記SC2930-T和感病基因標(biāo)記SC2930-Q經(jīng)過兩次擴(kuò)增，鑒定出種質(zhì)資源中CRa基因是否存在及其純雜性的分子標(biāo)記結(jié)果與人工接種結(jié)果一致，因此，SC2930-T和SC2930-Q是CRa基因的一對(duì)有效標(biāo)記。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，在大白菜種質(zhì)資源中，CRa和CRb基因只要有一個(gè)存在，且無論等位基因是純合還是雜合的，對(duì)來源于青島嶗山區(qū)的大白菜根腫病都有抗性，說明CRa和CRb基因均屬于顯性主效基因。這一結(jié)果與Piao等[10]在蕓薹屬其他作物中的研究結(jié)果一致。因本試驗(yàn)做的是苗期試驗(yàn)，感染根腫病的幼苗之間根系差異不如成株差異明顯，無法準(zhǔn)確評(píng)價(jià)CRa單獨(dú)存在、CRb單獨(dú)存在、CRa與CRb共同存在時(shí)的抗病性差異，下一步應(yīng)該對(duì)CRa、CRb的抗性差異和CRa與CRb的互作效應(yīng)做深入研究。

Diederichsen等[11]提出 CRa與CRb可能是等位基因或緊密連鎖的2個(gè)抗病位點(diǎn)。本試驗(yàn)24個(gè)大白菜品種中，同時(shí)具有CRa與CRb基因的品種12份，只有CRa基因、沒有CRb基因的品種5份，只有CRb基因、沒有CRa基因的品種3份，CRa與CRb基因均不含有的品種4份。CRa與CRb基因表現(xiàn)為獨(dú)立遺傳，與以往研究結(jié)果不一致?？赡苁窃诖蟀撞伺c歐洲蕪菁多代雜交以及抗根腫病大白菜種質(zhì)與非抗種質(zhì)長(zhǎng)期雜交過程中染色體交換引起的，真正原因有待進(jìn)一步研究。

在4份均不含CRa與CRb基因的大白菜品種中，有兩份仍然表現(xiàn)為抗根腫病，而且均來源于國(guó)內(nèi)，這一試驗(yàn)結(jié)果與楊征等[12]用其他引物標(biāo)記的結(jié)果一致。這是否暗示有新的抗源出現(xiàn)，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

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