軟棗獼猴桃性別相關(guān)的SRAP分子標(biāo)記

李旭+吳松權(quán)+姜明亮+樸一龍

摘要：以軟棗獼猴桃成齡雌株、雄株葉片為試驗(yàn)材料，利用SRAP分子標(biāo)記手段及SPSS軟件對(duì)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果表明，從初篩的80對(duì)引物中篩選出15對(duì)可穩(wěn)定擴(kuò)增出多態(tài)性條帶的引物組合，19個(gè)雌、雄植株共得到77個(gè)條帶，多態(tài)性條帶為72個(gè)，多態(tài)率達(dá)到93.50%；雌株多態(tài)性比率為68.8%，雄株多態(tài)性比率為87.0%；me2-em1、me6-em6、me7-em5、me7-em7這4對(duì)引物的擴(kuò)增結(jié)果表現(xiàn)出雌雄株間的多態(tài)性比率具有明顯差異；供試的19個(gè)植株經(jīng)聚類(lèi)分析分成2組，2組中均有70%以上表現(xiàn)出相同的性別。基于性別相關(guān)的SRAP可以有效分辨出軟棗獼猴桃雌株、雄株。

關(guān)鍵詞：軟棗獼猴桃；雌雄異株；性別鑒定；SRAP；分子標(biāo)記

中圖分類(lèi)號(hào)： Q943文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號(hào)：1002-1302（2016）08-0069-03

軟棗獼猴桃[Actinidia arguta （Seib.et Zucc.）Plangch.ex Miq.]是獼猴桃科獼猴桃屬中水平和垂直分布最廣泛的多年生落葉藤本果樹(shù)之一[1]，我國(guó)南北各地、朝鮮、日本、俄羅斯均有分布，以我國(guó)東三省資源最為豐富，其中，小興安嶺和長(zhǎng)白山山區(qū)較為多見(jiàn)，是珍貴的抗寒果樹(shù)資源。軟棗獼猴桃果實(shí)富含維生素C、酚類(lèi)物質(zhì)、類(lèi)胡蘿卜素及多種礦質(zhì)元素，具有一定的藥用價(jià)值。目前，軟棗獼猴桃作為第3代獼猴桃，受到世界各國(guó)的廣泛關(guān)注，其產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)正蓬勃發(fā)展。但是，軟棗獼猴桃為雌雄異株植物，以雌株產(chǎn)果實(shí)，雌株的經(jīng)濟(jì)價(jià)值明顯高于雄株，而軟棗獼獼猴桃實(shí)生苗需要5～7年才能結(jié)果，童期漫長(zhǎng)，且實(shí)生繁殖后代出現(xiàn)雌雄比約為1 ∶[KG-*3]4的性別分離[2]，不利于生產(chǎn)需要。雌雄異株和幼苗期雌雄無(wú)法辨別給軟棗獼猴桃種質(zhì)資源的改良和育種帶來(lái)巨大困難，因此，軟棗獼猴桃的性別鑒定在生產(chǎn)和遺傳育種方面有著重要的意義。

分子標(biāo)記技術(shù)具有簡(jiǎn)單快捷等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為植物輔助育種的重要手段。DNA 分子標(biāo)記技術(shù)被應(yīng)用于植物的性別鑒定，提高了植物性別鑒定的準(zhǔn)確性和實(shí)用性。Michelmore等提出的群體分離分析法（BSA）是一種有效的定位基因方法[3]，并據(jù)此得到了一些雌雄異株的植物性別連鎖DNA標(biāo)記；Mulcahy等在Silene latifolia中用60條隨機(jī)引物篩選到4條與性別連鎖的RAPD標(biāo)記[4]；Hormaza等通過(guò)700條引物的篩選，在Pistacia vera中找到1條單獨(dú)性別連鎖的RAPD標(biāo)記[5]。相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（SRAP）是Li等發(fā)展的新型分子標(biāo)記[6]，該標(biāo)記通過(guò)獨(dú)特的引物設(shè)計(jì)對(duì)可讀框（open reading frames，ORFs）進(jìn)行特異性擴(kuò)增，具有簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、產(chǎn)率高、標(biāo)記分布均勻、多態(tài)性強(qiáng)、目的片段便于克隆等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于圖譜構(gòu)建、比較基因組學(xué)、基因克隆和親緣關(guān)系等研究[7-10]，而在性別決定方面僅應(yīng)用于少數(shù)幾種植物中[11-14]。利用SRAP 分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)軟棗獼猴桃性別的相關(guān)特異片段研究未見(jiàn)報(bào)道。

本研究利用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)軟棗獼猴桃的雌、雄基因組DNA差異進(jìn)行研究，以期為軟棗獼猴桃幼苗期性別鑒定、軟棗獼猴桃性別相關(guān)基因的克隆提供科學(xué)依據(jù)。同時(shí)，SRAP體系的建立為利用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)軟棗獼猴桃進(jìn)行相關(guān)研究提供了一定的理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料于2014年8月取自延邊大學(xué)野生漿果資源圃（楓林），選取生長(zhǎng)勢(shì)一致、無(wú)病蟲(chóng)害的6年生野生軟棗獼猴桃雌株、雄株，分別取其成熟葉片，用冰盒保存，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，液氮速凍。雄株取10個(gè)樣品，記為X1～X10；雌株取9個(gè)樣品，記為C1～C9。所用SRAP引物（表1），均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

采用改良的CTAB法提取軟棗獼猴桃各株基因組DNA，用紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定DNA 在波長(zhǎng)為260、280 nm處的D值，檢測(cè)其純度及濃度；用1.4%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的大小和完整性；稀釋成濃度為50 ng/μL的工作液，分裝，超低溫冰箱保存，備用。

1.2軟棗獼猴桃的SRAP擴(kuò)增

SRAP擴(kuò)增條件在參照鄧傳良等反應(yīng)體系[14]的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，確定軟棗獼猴桃的SRAP-PCR反應(yīng)體系（20 μL）為：400 ng基因組DNA，2 μmol/L的正向、反向引物1.0 μL，10×buffer 2.0 μL，2.5 mmol/L dNTP Mixture 0.4 μL，1.25 U/μL Taq酶0.3 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，37 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸90 s，15個(gè)循環(huán)；94 ℃變性1 min，52 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。將上下游引物進(jìn)行自由組合，從80對(duì)引物組合的擴(kuò)增圖譜中篩選出帶型清晰、雌雄基因組具有明顯差異、重復(fù)性好且多態(tài)性高的引物組合。08%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果，用500萬(wàn)像素?cái)?shù)碼相機(jī)拍照。

1.3數(shù)據(jù)處理及分析

將清晰可辨的DNA條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，弱帶中穩(wěn)定的條帶予以保留，不穩(wěn)定的條帶忽略不計(jì)，計(jì)算雌、雄性別特異的條帶數(shù)，樣品間同一遷移位置上的電泳條帶記為1，無(wú)則記為0。利用SPSS 19.0軟件進(jìn)行歐氏距離平方法聚類(lèi)分析，按照Ward method離差平方建立聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖。

2結(jié)果與分析

2.1軟棗獼猴桃基因組的SRAP擴(kuò)增

以構(gòu)建的軟棗獼猴桃雌、雄基因池DNA為模板，從初篩的80對(duì)引物中篩選出15對(duì)可以穩(wěn)定擴(kuò)增出多態(tài)性條帶的引物組合。由圖1、表2可見(jiàn)，多態(tài)性位點(diǎn)的分子量主要分布在300～1 000 bp之間，19個(gè)雌、雄植株共得到77個(gè)條帶，多態(tài)性條帶為72個(gè)，多態(tài)率達(dá)到93.50%；每對(duì)引物平均擴(kuò)增出5.13個(gè)條帶，多態(tài)性條帶數(shù)為4.80個(gè)；雌株多態(tài)性比率為68.8%，雄株多態(tài)性比率為87.0%；me2-em1、me6-em6、me7-em5、me7-em7這4對(duì)引物的擴(kuò)增結(jié)果表現(xiàn)出雌雄株間的多態(tài)性比率差異明顯；沒(méi)有出現(xiàn)與性別相關(guān)的特異條帶，但軟棗獼猴桃雌、雄株基因組具有較為明顯的差異性。

2.2軟棗獼猴桃雌株、雄株聚類(lèi)分析

由圖2可見(jiàn)，供試的19個(gè)植株共分成2大組，組Ⅰ包括8個(gè)植株，其中含有2個(gè)雄株，編號(hào)為3、8，雌株占比為7143%，組Ⅱ包括11個(gè)植株，其中含有3個(gè)雌株，編號(hào)為 17～19，雄株占比為72.73%，2組中均有70%以上表現(xiàn)出相同的性別。獼猴桃為功能性雌雄異株植物，自20世紀(jì)70年代發(fā)現(xiàn)能結(jié)果的雄株以來(lái)，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，獼猴桃在性別表達(dá)上幾乎呈現(xiàn)連續(xù)變異，至少有6種不同的性別表現(xiàn)型[1]，軟棗獼猴桃性別變異可能是造成約30%分辨不清的原因?；谛詣e相關(guān)的SRAP可以有效分辨軟棗獼猴桃的雌株、雄株。

3結(jié)論與討論

SRAP 分子標(biāo)記技術(shù)是對(duì)開(kāi)放閱讀框進(jìn)行的特異擴(kuò)增，利用該技術(shù)對(duì)基因組擴(kuò)增所獲取的特異片段直接代表了基因的表達(dá)狀況，有利于對(duì)基因的表達(dá)及功能研究[15-18]。吳文珊等將SRAP分子標(biāo)記應(yīng)用于薜荔（Ficus pumila Linn.）早期性別鑒定，得到1條雌性多態(tài)性片段[19]。鄭翠芳等利用SRAP 分子標(biāo)記技術(shù)建立了愛(ài)玉子（Ficus awkeotsang Makino.）性別相關(guān)的DNA指紋數(shù)據(jù)庫(kù)，并獲得愛(ài)玉子的2個(gè)雄性特異片段[11]。Zhou等利用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)獲得野牛草（Buchloe dactyloides）的1個(gè)雌性特異片段[13]。鄧傳良等利用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)獲得菠菜（Spinacia oleracea L.）和萚草[Humulus scandens （Lour.） Merr.]性別相關(guān)的特異條帶[12，14]。

本研究從80對(duì)SRAP 引物中篩選出15對(duì)多態(tài)性較強(qiáng)的引物，利用瓊脂糖凝膠電泳分離條帶，從19個(gè)供試材料中共得到77個(gè)條帶，多態(tài)性條帶為72個(gè)，多態(tài)率達(dá)到93.50%；每對(duì)引物平均擴(kuò)增出的條帶數(shù)為5.13個(gè)，多態(tài)性條帶數(shù)為480個(gè)；雌株多態(tài)性比率為68.80%，雄株多態(tài)性比率為8700%；me2-em1、me6-em6、me7-em5、me7-em7這4對(duì)引物的擴(kuò)增結(jié)果表現(xiàn)出雌株、雄株間的多態(tài)性比率差異明顯。軟棗獼猴桃性染色體的發(fā)育機(jī)制與菠菜類(lèi)似[20]，但并沒(méi)有出現(xiàn)如菠菜那樣的特異條帶[14]，這說(shuō)明軟棗獼猴桃雌株、雄株的基因組具有較為明顯的差異性。軟棗獼猴桃雌株、雄株聚類(lèi)分析將供試的19個(gè)植株分成2大組，組Ⅰ雌株占比為7143%，組Ⅱ雄株占比為72.73%，2組中均有70%以上表現(xiàn)出相同的性別。目前，在葡萄上已經(jīng)證實(shí)，性別決定基因可能與易受環(huán)境影響的一些基因發(fā)生互作[21]。因此，本研究軟棗獼猴桃存在30%性別分辨不清的原因很可能是由軟棗獼猴桃性別變異造成的，基于性別相關(guān)的SRAP可以有效分辨軟棗獼猴桃雌株、雄株，雖不能達(dá)到100%的分辨，但這完全可以符合現(xiàn)階段軟棗獼猴桃性別鑒定工作的需要。

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