長白山山蘭組織培養(yǎng)技術(shù)研究

摘要［目的］研究山蘭組織培養(yǎng)條件。［方法］以長白山山蘭（Oreorchispatens）的假鱗莖為研究材料，分析消毒處理、激素組合、生根培養(yǎng)等對山蘭假鱗莖組織培養(yǎng)的影響，篩選最佳消毒處理組合和假鱗莖不同階段的最適培養(yǎng)基。［結(jié)果］山蘭假鱗莖最適消毒處理為75%乙醇45s+0.1%升汞表面消毒5min，無菌苗污染率為10.94%，成活率為87.62%；山蘭最佳的增殖、分化和生根培養(yǎng)基均為1/4MS+1.5mg/LZT+0.050mg/LNAA+20g/L蔗糖+8g/L瓊脂，pH5.6，增殖率為78.89%，分化率為88.34%，生根率為83.85%。［結(jié)論］該研究建立了山蘭的組織培養(yǎng)再生體系，可為長白山區(qū)其他瀕危植物的保護和繁育提供技術(shù)支撐與開發(fā)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞山蘭；組織培養(yǎng)；消毒處理；激素組合；生根培養(yǎng)；假鱗莖

中圖分類號S567.23"文獻標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611（2024）24-0133-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.24.030

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

ResearchonTissueCultureTechnologyofOreorchispatensinChangbaiMountain

WANGYuan1，LUShuang2，SHAYue1etal

（1.CollegeofLifeSciences，ChangchunNormalUniversity，Changchun，Jilin130000;2.KeyState-ownedForestryTechnologyServiceCenterofJilinProvince，Changchun，Jilin130000）

Abstract［Objective］TostudythetissuecultureconditionsofOreorchispatens.［Method］ThepseudobulbsofOreorchispatensinChangbaiMountainwereusedasresearchmaterialstoanalyzetheeffectsofdisinfectiontreatment，hormonecombinationandrootingcultureonthetissuecultureofpseudobulbsofOreorchispatensinordertoscreenthebestdisinfectiontreatmentcombinationandtheoptimalmediumfordifferentstagesofpseudobulbs.［Result］Theoptimaldisinfectiontreatmentofpseudobulbswas75%alcoholfor45s+0.1%mercuricchloridefor5min，thecontaminationrateofasepticseedlingswas10.94%，andthesurvivalratewas87.62%.Thebestmediumforproliferation，differentiationandrootingwas1/4MS+1.5mg/LZT+0.050mg/LNAA+20g/Lsucrose+8g/Lagar，pH5.6，andtheproliferationratewas78.89%，thedifferentiationratewas88.34%，andtherootingratewas83.85%.［Conclusion］ThisstudyestablishedthetissuecultureandregenerationsystemofOreorchispatens，whichcanprovidetechnicalsupportanddevelopmentbasisfortheprotectionandbreedingofotherendangeredplantsinChangbaiMountainarea.

KeywordsOreorchispatens（Lindl.）Lindl.;Tissueculture;Disinfectiontreatment;Hormonecombination;Rootingcultivation;Pseudobulbs

長白山山蘭［Oreorchis patens （Lindl.） Lindl.］為蘭科（Orchidaceae）山蘭屬（Oreorchis）多年生附生草本植物，也被人們叫做“冰球子”^［1］。野生廣泛分布于中國東北地區(qū)（黑龍江、遼寧和吉林）、西南（四川、貴州和云南北部）、西北（甘肅）、華中（江西、湖南）和臺灣，主要分布于海拔1 000～3 000 m 的林下、林緣、灌叢、草甸或溝谷旁^［2］。經(jīng)過干燥處理的假鱗莖可以作為藥材，其葉片一般呈現(xiàn)1～2片，6月底葉子逐漸開始枯萎，7月底又萌發(fā)新葉^［3-4］，其味甘、性寒、辛，有小毒，具有滋陰補腎、清熱解毒、益氣養(yǎng)生、消癰散結(jié)的功效，用于瘰疬、無名腫毒、癰疳瘡腫、蛇蟲咬傷等的治療^［5-6］。民間把山蘭作為山慈菇來入藥，俗稱“山芋頭”^［7］。山慈菇作為一味歷史悠久的常用藥材，自古以來便擁有廣泛的應(yīng)用傳統(tǒng)，在《中國藥典》中，山慈菇這一藥材被明確記載其植物來源包括杜鵑蘭［Cremastra appendiculata （D.Don） Makino］、獨蒜蘭［Pleione bulbocodioides （Franch.） Rolfe］和云南獨蒜蘭［Pleione yunnanensis （Rolfe） Rolfe］^［8-9］。此外，據(jù)《中華本草》與《中藥大辭典》記載，來自山蘭屬的植物如山蘭、獨葉山蘭等的假鱗莖，同樣被認(rèn)定為山慈菇的有效入藥部分^［10-11］。近年來，由于山慈菇的3種原植物供不應(yīng)求，長白山地區(qū)大量收購山蘭，導(dǎo)致野生山蘭儲量銳減，成為珍稀植物。因此，筆者采用組織培養(yǎng)技術(shù)進行快速繁殖是保護長白山山蘭野生資源和解決山蘭稀缺的有效辦法，以期得到最優(yōu)的山蘭組織培養(yǎng)條件，創(chuàng)新山蘭組織培養(yǎng)和快繁技術(shù)，為長白山山蘭種質(zhì)資源保存、精準(zhǔn)利用和規(guī)范化育苗等提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗材料2023年5月取長春師范大學(xué)種質(zhì)保存中心在通化縣興林鎮(zhèn)闊葉林下仿生態(tài)栽培的3年生山蘭假鱗莖萌發(fā)新芽作為組織培養(yǎng)材料。

1.2試驗方法

1.2.1外植體消毒。

山蘭假鱗莖流水沖洗15min，表面沖洗干凈后，將其放在超凈工作臺上，用75%乙醇浸泡30、45、60s，無菌水沖洗3～5次，再用0.1%升汞（HgCl2）消毒4、5、6min，最后無菌水沖洗3～5次，將不同消毒處理組合（表1）進行正交試驗設(shè)計。

1.2.2假鱗莖增殖培養(yǎng)中激素組合篩選。以1/4MS培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中添加蔗糖20g/L和瓊脂8g/L，調(diào)節(jié)pH為5.6，以玉米素（ZT）、萘乙酸（NAA）為不同因素，設(shè)置不同濃度水平進行正交試驗設(shè)計（表2），ZT設(shè)置0.5、1.0、1.5mg/L3個濃度梯度，NAA設(shè)置0.025、0.050、0.100mg/L3個濃度梯度，共9個處理。

1.2.3假鱗莖分化為球莖培養(yǎng)中激素組合篩選。以假鱗莖增殖培養(yǎng)基為參照，繼續(xù)篩選最適假鱗莖分化為球莖的激素組合。

1.2.4球莖生根培養(yǎng)中激素組合篩選。以假鱗莖增殖培養(yǎng)基為參照，繼續(xù)篩選最適球莖生根的激素組合。

1.2.5培養(yǎng)條件。取山蘭假鱗莖進行誘導(dǎo)，在基本培養(yǎng)基中添加不同種類的植物生長激素應(yīng)用于不同培養(yǎng)階段，使用1mol/L的NaOH溶液和1mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH。設(shè)置（25±2）℃、光照強度1000lx、每天光照12h的培養(yǎng)室條件。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析通過Excel和SPSS統(tǒng)計軟件對測定數(shù)據(jù)進行整合與處理，并利用Duncan新復(fù)極差測驗法對其進行顯著性分析，以獲得更加精確的結(jié)果。試驗數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析的相關(guān)計算公式如下：

污染率=污染的假鱗莖數(shù)／接種假鱗莖總數(shù)×100%

成活率=正常生長的假鱗莖數(shù)／接種假鱗莖總數(shù)×100%

增殖率=假鱗莖增殖數(shù)／接種假鱗莖數(shù)×100%

分化率=分化球莖數(shù)／接種假鱗莖數(shù)×100%

生根率=生根的球莖數(shù)／接種球莖數(shù)×100%

2結(jié)果與分析

2.1不同消毒處理組合對滅菌效果的影響

山蘭假鱗莖經(jīng)過消毒滅菌處理，每瓶接種一個假鱗莖，每30瓶為一個處理，3次重復(fù)，在空白的1/4MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)7d后不同組合消毒處理的消毒效果見表3。從表3可以看出，不同消毒處理組合對山蘭假鱗莖的污染率和成活率有一定影響，所選的處理組合需要兼具較高的成活率和較低的污染率。污染率最高的組合是序號1，為49.98%，其滅菌效果是最差的；序號5污染率是最低的，為10.94%；其次是序號4和序號9，2個處理組合之間沒有顯著的差異。成活率比較高且達(dá)到70%以上的處理組合有序號1、4、5，其中序號5的成活率最高，為87.62%；序號9的污染率較低（19.33%），但其成活率同樣也很低，為30.58%，這表明消毒劑的使用時間過長，會損害假鱗莖的生命力。所有消毒處理組合中序號5滿足較高的成活率和較低的污染率，因此，山蘭假鱗莖最適消毒處理為75%乙醇45s+0.1%升汞表面消毒5min。

2.2不同培養(yǎng)基對假鱗莖增殖的影響從表4可以看出，不同濃度配比的培養(yǎng)基對山蘭假鱗莖增殖的影響具有明顯差異。除了1/4MS+0.5mg/LZT培養(yǎng)基中，隨著NAA濃度的升高，假鱗莖增殖率呈逐漸升高的趨勢，其他不同培養(yǎng)基在統(tǒng)一1/4MS和ZT濃度時，隨著NAA濃度的升高，假鱗莖增殖率均先升高后降低。其中，當(dāng)培養(yǎng)基為1/4MS+1.5mg/LZT+0.050mg/LNAA時，假鱗莖增殖率最高，為78.89%。因此，山蘭假鱗莖增殖的最適培養(yǎng)基為1/4MS+1.5mg/LZT+0.050mg/LNAA+20g/L蔗糖+8g/L瓊脂，pH5.6。在最適培養(yǎng)基中山蘭假鱗莖的增殖情況如圖1所示。

2.3不同培養(yǎng)基對假鱗莖分化為球莖的影響從表5可以看出，不同濃度配比的培養(yǎng)基對山蘭假鱗莖分化為球莖的影響具有明顯差異。在1/4MS+1.5mg/LZT+0.050mg/LNAA+20g/L蔗糖+8g/L瓊脂、pH5.6的分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，分化率最高，為88.34%，瓶苗長勢最佳（圖2）。

2.4不同培養(yǎng)基對球莖生根的影響從表6可以看出，不同濃度配比的培養(yǎng)基對山蘭球莖生根的影響具有明顯差異。除了1/4MS+1.0mg/LZT培養(yǎng)基中，隨著NAA濃度的升高，假鱗莖生根率呈逐漸降低的趨勢，其他同一單因素變量下生根率則是呈先升高而后降低的趨勢；在1/4MS+1.5mg/LZT+0.050mg/LNAA+20g/L蔗糖+8g/L瓊脂、pH5.6的生根培養(yǎng)基中，球莖生根率最高，為83.85%。在最適培養(yǎng)基中山蘭假鱗莖的生根情況如圖3所示。

3結(jié)論與討論

山蘭作為一種名貴的藥材在醫(yī)藥方面發(fā)揮重要作用，由于其有較高的藥用價值和經(jīng)濟價值，人們?yōu)楂@取利益進行貪婪的開采，導(dǎo)致山蘭的野生資源急劇流失，使其生態(tài)環(huán)境遭受了嚴(yán)重破壞，其自然條件的繁殖方式已無法滿足市場需求^［12-13］。因此對山蘭的組織培養(yǎng)研究勢在必行。近年來，已有學(xué)者對山蘭外植體（種子、原球莖等）進行組織培養(yǎng)技術(shù)研究^［14-15］。張正海等^［14］研究發(fā)現(xiàn)，將消毒處理好的山蘭種子播撒在相應(yīng)培養(yǎng)基上進行無菌萌發(fā)，可以觀察萌發(fā)過程種子的形態(tài)變化；張正海等^［15］選用“原球莖增殖-原球莖分化為球莖-球莖生根”的組培流程，這為該試驗提供一定的思路。

激素在植物組織培養(yǎng)中起著至關(guān)重要的作用，有效誘導(dǎo)一種植物育苗或促進幼莖良好生長所需的激素類型和濃度的不同取決于培養(yǎng)階段的不同^［16］，因此該研究用不同濃度激素進行配比篩選出假鱗莖各階段最適培養(yǎng)基。在研究過程中要控制好消毒條件，嚴(yán)格控制好溫度、pH、光照時間等因素，避免這些因素對山蘭生長環(huán)境產(chǎn)生不利影響^［17］。接種必須在無菌環(huán)境中進行，因為假鱗莖的滅菌效果對山蘭的組織培養(yǎng)有很大影響。在分配培養(yǎng)基時，培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基的量應(yīng)盡可能相同。在接種過程中，應(yīng)注意確保每種培養(yǎng)基中的材料在相同的條件下生長。

該研究以山蘭假鱗莖為外植體，對其滅菌方式及假鱗莖增殖、假鱗莖分化為球莖、球莖生根培養(yǎng)基進行篩選，建立了山蘭組織培養(yǎng)的體系。在1/4MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加不同濃度的ZT、NAA激素，通過不同激素配比找出山蘭各階段的最適培養(yǎng)基。經(jīng)流水沖洗15min后，以75%乙醇45s+0.1%升汞5min浸泡處理的滅菌效果最佳。其中山蘭最佳的增殖、分化和生根的培養(yǎng)基均為1/4MS+1.5mg/LZT+0.050mg/LNAA+20g/L蔗糖+8g/L瓊脂，pH5.6，增殖率為78.89%，分化率為88.34%，生根率為83.85%。

參考文獻

［1］姚百寧.長白山山蘭繁育及根際促生菌研究［D］.長春：長春大學(xué)，2021.

［2］中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會.中國植物志［M］.北京：科學(xué)出版社，2004：564-566．

［3］高宇丹.山蘭的化學(xué)成分及其生物活性研究［D］.長春：長春中醫(yī)藥大學(xué)，2020.

［4］CHUNGMY，LPEZ-PUJOLJ，MAKIM，etal.GeneticdiversityinthecommonterrestrialorchidOreorchispatensanditsrarecongenerOreorchiscoreana：Inferenceofspeciesevolutionaryhistoryandimplicationsforconservation［J］.Thejournalofheredity，2012，103（5）：692-702.

［5］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.

［6］BAEKH，OKKH，KIMSY.Sodiumhypochloritetreatmentandlight-emittingdiode（LED）irradiationeffectoninvitrogerminationofOreorchispatens（Lindl.）Lindl［J］.Journalofplantbiotechnology，2014，41（1）：44-49.

［7］李靜，樸仁哲，郭軒池，等.山蘭繁育技術(shù)研究進展［J］.南方農(nóng)業(yè)，2022，16（22）：1-3.

［8］田新新.山蘭資源開發(fā)利用關(guān)鍵技術(shù)研究［D］.長春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

［9］魏偉.山蘭藥材的化學(xué)成分及其多糖免疫藥理活性研究［D］.長春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

［10］國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會.中華本草：第8卷［M］.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999：744．

［11］江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典（上冊）［M］.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1986：202．

［12］張命軍，劉學(xué)芝，劉丹，等.長白山珍稀藥材山蘭的研究進展［J］.農(nóng)業(yè)與技術(shù)，2019，39（20）：61-62.

［13］甘甜.山蘭化學(xué)成分及其體外抗氧化活性研究［D］.長春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2017.

［14］張正海，張悅，張亞玉，等.山蘭種子無菌萌發(fā)及形態(tài)變化研究［J］.特產(chǎn)研究，2017，39（2）：5-8.

［15］張正海，張亞玉，孫海，等.山蘭萌發(fā)種子定向培養(yǎng)成苗技術(shù)研究［J］.特產(chǎn)研究，2019，41（4）：53-56，67.

［16］何永鵬，羅興忠，封海東，等.白芨組織培養(yǎng)與馴化栽培技術(shù)研究［J］.現(xiàn)代園藝，2020，43（11）：32-33.

［17］張正海，張亞玉，孫海，等.山蘭原球莖途徑種苗快繁技術(shù)［J］.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2024，46（1）：58-63.