胸腔積液ADA聯(lián)合外周血T-SPOT.TB、D-二聚體對結(jié)核性胸膜炎的早期診斷價值

[摘" "要]" "目的：探討胸腔積液腺苷脫氨酶（adenosine deaminase， ADA）、結(jié)核感染T細(xì)胞斑點實驗（tuberculosis infection T-cell spot test， T-SPOT.TB）、D-二聚體（D-dimer， D-D）聯(lián)合檢測對結(jié)核性胸膜炎（tuberculosis pleurisy， TPE）的早期診斷價值。方法：選取2021年1月—2023年12月南通市第六人民醫(yī)院收治住院患者118例，其中TPE患者62例為TPE組，非結(jié)核性胸膜炎患者56例為非結(jié)核性胸膜炎（non-tuberculous pleurisy， NTPE）組。分別檢測和比較兩組胸腔積液中ADA含量、外周血T-SPOT.TB試驗中ESAT6、CFP10斑點孔數(shù)及D-D水平，比較不同指標(biāo)之間的差異性及相關(guān)性。應(yīng)用ROC曲線分析上述指標(biāo)對TPE的早期診斷價值。結(jié)果：TPE組胸腔積液ADA含量、外周血ESAT6、CFP10斑點孔數(shù)以及D-D水平分別為[38.95（24.92， 49.17） U·L-1、20.00（12.75， 40.00）孔、20.00（8.50， 40.00）孔、3.52（1.99， 5.95） mg·L-1]，與NTPE組[10.55（7.35， 16.57） U·L-1、1.00（0.00， 4.00）孔、0.00（0.00， 4.00）孔、1.17（0.74， 2.29） mg·L-1]相比均明顯升高（Z=-6.405、-5.411、-6.517、-6.468，均Plt;0.001）。TPE組外周血ESAT6、CFP10斑點孔數(shù)與胸腔積液ADA含量均呈中度正相關(guān)（r=0.596、0.581，均Plt;0.001），而外周血ESAT6、CFP10斑點孔數(shù)與D-D水平則呈低度正相關(guān)（r=0.398、0.443，均Plt;0.001）。胸腔積液ADA、外周血ESAT6、CFP10及D-D早期診斷TPE的ROC曲線的AUC分別為0.842、0.845、0.840、0.789。上述4種指標(biāo)聯(lián)合檢測的AUC為0.960，敏感度和特異度分別為87.1%和96.43%，均高于單個指標(biāo)。結(jié)論：TPE患者胸腔積液ADA含量、外周血ESAT6、CFP10斑點孔數(shù)及D-D水平均升高，聯(lián)合診斷可提高TPE的診斷效果，有助于臨床早期診斷TPE。

[關(guān)鍵詞]" "結(jié)核性胸膜炎；腺苷脫氨酶；結(jié)核感染T細(xì)胞斑點實驗；D-二聚體

[中圖分類號]" "R521.7" " " " " " " "[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]" "A" " " " " " " "[文章編號]" "1674-7887（2024）05-0438-05

Value of pleural effusion ADA combined with peripheral blood T-SPOT.TB and D-dimer in

early diagnosis of tuberculosis pleurisy

ZHU Huiming WANG Shouwei SHEN Tian （Department of Clinical Laboratory， Affiliated Nantong Hospital of Shanghai University， The Sixth People＇s Hospital of Nantong， Jiangsu 226001）

[Abstract]" "Objective： To explore the early diagnostic value of pleural effusion adenosine deaminase（ADA） combined with peripheral blood tuberculosis infection T-cell spot test（T-SPOT.TB） and D-dimer（D-D） in tuberculosis pleurisy（TPE）. Methods： Total of 118 inpatients in the Sixth People＇s Hospital of Nantong from January 2021 to December 2023 were enrolled in this study and divided into a group（62 cases） with TPE patients and a group（56 cases） with non-tuberculosis pleurisy（NTPE） patients. The levels of pleural effusion ADA， peripheral blood T-SPOT. TB（ESAT6 and CFP10 wells） and D-D were measured. The differences and correlations in all indicators were analyzed between the two groups. The ROC curve was applied to evaluate the sensitivity and specificity of these indicators in the early diagnosis of tuberculosis pleurisy. Results： The levels of pleural effusion ADA， peripheral blood ESAT6， CFP10 wells and D-D from the TPE group were 38.95（24.92， 49.17） U·L-1， 20.00（12.75， 40.00） wells， 20.00（8.50， 40.00） wells， and 3.52（1.99， 5.95） mg·L-1 respectively， which were significantly higher than corresponding[10.55（7.35， 16.57） U·L-1， 1.00（0.00， 4.00） wells， 0.00（0.00， 4.00） wells and 1.17（0.74， 2.29） mg·L-1] in the NTPE group（Z=-6.405， -5.411， -6.517， -6.468， all Plt;0.001）. Furthermore， the levels peripheral blood ESAT6 and CFP10 wells had moderate positive relationship with the level of pleural effusion ADA in the TPE group（r=0.596， 0.581， both Plt;0.001）. And the levels peripheral blood ESAT6 and CFP10 wells had low positive relationship with the level of D-D（r=0.398， 0.443， both Plt;0.001）. The AUC of ROC curve of pleural effusion ADA， peripheral blood ESAT6， CFP10 wells and D-D for early diagnosis of TPE were 0.842， 0.845， 0.840， 0.789 respectively. In addition， the AUC obtained by simultaneous measurement of ADA， ESAT6， CFP10 wells and D-D was as high as 0.960， and the sensitivity and specificity of diagnosing TPE were 87.1% and 96.43%， which were higher than any individual indicator. Conclusion： The levels of pleural effusion ADA， peripheral blood ESAT6、CFP10 wells and D-D all show varying degrees of increase in the TPE patients， and can assist in early diagnosis of TPE.

[Key words]" "tuberculosis pleurisy; adenosine deaminase; tuberculosis infection T-cell spot test; D-dimer

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis， MTB）引起的慢性感染性疾病，其發(fā)病率及死亡率呈明顯上升趨勢。2022年全球新發(fā)1 000多萬例結(jié)核病[1]。結(jié)核性胸膜炎（tuberculosis pleurisy， TPE）指MTB及其代謝產(chǎn)物侵入高敏狀態(tài)的胸膜腔，從而引起的胸膜炎癥性疾病，是結(jié)核病中的一大類，占胸腔積液病因的30%～60%[2]。目前臨床常用的診斷技術(shù)如胸膜活檢、結(jié)核菌培養(yǎng)及胸腔積液涂片等存在創(chuàng)傷性大、檢測周期長以及陽性率低等不足，均不利于臨床早期診斷TPE[3-4]。由于不同病因引起胸腔積液的治療方案差異較大，因此尋找出一種準(zhǔn)確度高且快速、簡便的檢測方法對早期診斷和治療TPE極其重要。國內(nèi)外研究[5-6]發(fā)現(xiàn)，胸腔積液腺苷脫氨酶（adenosine deaminase， ADA）對TPE具有較好的診斷價值。此外，結(jié)核感染T細(xì)胞斑點實驗（tuberculosis infection T-cell spot test， T-SPOT.TB）采用酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)通過對結(jié)核特異性抗原ESAT6、CFP10的檢測，判定患者體內(nèi)有無結(jié)核效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，操作簡單，24 h內(nèi)即可確診，此方法具有標(biāo)本采集量少、重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)點，臨床上對TPE的診斷有了大幅的提升[7-8]。然而，ADA和T-SPOT.TB在診斷敏感度以及特異度方面仍存在一定的不足[9]。近年有學(xué)者[10]發(fā)現(xiàn)TPE患者外周血中D-二聚體（D-dimer， D-D）水平明顯升高，可能與胸膜炎癥反應(yīng)引起機(jī)體凝血功能異常有關(guān)，越來越多的研究人員[11]通過測定外周血D-D水平以輔助診斷TPE。因此，本研究通過回顧性分析TPE患者胸腔積液中ADA含量、外周血T-SPOT.TB試驗中ESAT6、CFP10斑點孔數(shù)及D-D水平，探究這些指標(biāo)對TPE的早期診斷價值。

1" "對象與方法

1.1" "研究對象" "選取2020年1月—2023年12月南通市第六人民醫(yī)院收治的住院患者118例，其中入住結(jié)核科的TPE患者62例，年齡34～92歲，納入TPE組；選取同期我院呼吸科、腫瘤科等收治的非結(jié)核性胸膜炎（non-tuberculous pleurisy， NTPE）患者56例（其中惡性胸腔積液39例、炎性胸腔積液8例、不明原因胸腔積液9例），年齡28～85歲，納入NTPE組。收集入選的118例患者的臨床資料，包括臨床癥狀、高血壓史、吸煙飲酒史及糖尿病史等。本研究方案經(jīng)南通市第六人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：NTLYLL2024010），所有患者均知曉并簽署知情同意書。

1.2" "納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1" "納入標(biāo)準(zhǔn)" "依據(jù)《中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS288—2017》[12]，TPE組納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）確診標(biāo)準(zhǔn)：①胸腔積液MTB涂片2次陽性；②胸腔積液MTB涂片1次陽性同時胸腔積液MTB培養(yǎng)1次陽性；③胸膜病理活檢支持結(jié)核感染。（2）臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)：①胸腔積液為滲出液；②ADA數(shù)值升高；③結(jié)核抗體陽性或T-SPOT.TB陽性或結(jié)核菌素純蛋白衍生物（purified protein derivative， PPD）實驗中度以上陽性；④分子生物學(xué)方法檢測MTB Xpert檢查陽性或MTB的RNA陽性或DNA陽性[13]。NTPE組納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）惡性胸腔積液：胸腔積液或胸膜組織中發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤細(xì)胞（經(jīng)病理學(xué)證實）。（2）炎性胸腔積液：胸腔積液經(jīng)病原學(xué)檢查出MTB以外的病原菌如細(xì)菌、真菌等。（3）不明原因胸腔積液：胸腔積液病因目前無法明確且未行抗結(jié)核治療[14]。

1.2.2" "排除標(biāo)準(zhǔn)" "（1）合并嚴(yán)重心腦血管疾病或胸部外傷者；（2）有抗結(jié)核藥物治療史者；（3）服用華法林等抗凝藥物者；（4）嚴(yán)重腎功能不全、藥物過敏者。

1.3" "儀器與試劑" "美國貝克曼AU5800全自動生化分析儀，寧波瑞源生物科技有限公司提供配套試劑；Sysmex CS5100全自動血液凝固分析儀以及原裝配套試劑；T-SPOT.TB檢測試劑由上海歐弗得醫(yī)療器械公司提供。

1.4" "標(biāo)本采集及測定

1.4.1" "胸腔積液ADA檢測" "應(yīng)用穿刺針采集胸腔積液送檢，分裝專用試管后，3 000 r/min離心10 min分離出上清液。AU5800全自動生化分析儀測定上清液中所含ADA濃度，其檢測原理為過氧化物酶法。

1.4.2" "T-SPOT.TB檢測" "（1）外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell， PBMCs）提?。嚎崭共杉o脈血5 mL置于肝素鋰抗凝管內(nèi)，充分混勻，將5 mL全血與5 mL RPMI 1640培養(yǎng)液混勻，加到5 mL分離液中，2 260 r/min離心22 min分離出云霧狀態(tài)PBMCs層，繼續(xù)加入培養(yǎng)液洗2次，離心7 min/次，棄去上清液留下PBMCs。（2）孵育：將分離的PBMCs加入500 μL細(xì)胞培養(yǎng)液，調(diào)整密度為2.5×106/mL，將100 μL細(xì)胞懸液加入各孔，37 ℃溫箱孵育16～20 h。（3）顯色：孵育完成后用PBS沖洗孔板4次，加入堿性磷酸酶標(biāo)記二抗，2～8 ℃再次孵育1 h，PBS清洗各孔4次，再各孔加入顯色底物，室溫7 min后，加去離子水終止反應(yīng)，原理為酶聯(lián)免疫斑點法。（4）結(jié)果判讀：若空白對照孔斑點0～5個，抗原A或B孔與空白孔斑點數(shù)相差6個，則為T-SPOT.TB陽性；若空白對照孔斑點gt;5個，抗原A或B孔斑點數(shù)超過空白斑點數(shù)2倍，則判定為T-SPOT.TB陽性[15]。

1.4.3" "測定血漿D-D水平" "用檸檬酸鈉抗凝采集靜脈2 mL內(nèi)，充分混勻5～8次，采用低速冷凍離心機(jī)3 000 r/min 離心15 min分離出血漿。在Sysmex CS5100全自動血液凝固分析儀，采用免疫比濁法檢測血漿D-D水平。所有操作按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行，且所有檢測項目的質(zhì)量控制均在控。

1.5" "統(tǒng)計學(xué)方法" "采用SPSS 27.0統(tǒng)計軟件，符合正態(tài)分布的計量資料用ｘ±s表示，兩組之間比較采用t檢驗；呈偏態(tài)分布資料以中位數(shù)M（P25， P75）表示，采用非參數(shù)檢驗。計數(shù)資料以n（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Pearson相關(guān)性分析進(jìn)行相關(guān)分析。采用ROC曲線評價ADA、T-SPOT.TB以及D-D單用或聯(lián)合檢測對TPE的診斷價值，計算AUC、敏感度、特異度等指標(biāo)。Plt;0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2" "結(jié)" " " 果

2.1" "兩組患者一般資料比較" "兩組患者年齡、性別比、高血壓史、糖尿病史、吸煙史、飲酒史、咯血、發(fā)熱情況比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均Pgt;0.05），見表1。

2.2" "兩組胸腔積液ADA含量、外周血ESAT6、CFP10斑點孔數(shù)及D-D水平比較" "與NTPE組相比，TPE組胸腔積液ADA、外周血ESAT6、CFP10斑點孔數(shù)及D-D水平明顯升高（均Plt;0.001），見表2。

2.3" "TPE組胸腔積液ADA含量、外周血ESAT6、CFP10斑點孔數(shù)及D-D水平之間的相關(guān)性" "ESAT6、CFP10斑點孔數(shù)與胸腔積液ADA含量均呈中度正相關(guān)（r=0.596、0.581， 均Plt;0.001），TPE組患者外周血ESAT6與CFP10斑點孔數(shù)呈高度正相關(guān)（r=0.840， Plt;0.001），ESAT6、CFP10斑點孔數(shù)與D-D水平呈低度正相關(guān)（r=0.398、0.443， 均Plt;0.001），見圖1。

2.4" "ADA、ESAT-6、CFP10斑點孔數(shù)及D-D水平早期診斷TPE性能分析" "項目診斷性能分析顯示，胸腔積液ADA含量、外周血ESAT6、CFP10斑點孔數(shù)及D-D診斷TPE的ROC曲線的AUC分別為0.842、0.845、0.840、0.789，聯(lián)合測定時AUC最大（0.960），敏感度為87.10%，特異度為96.43%，均高于單個指標(biāo)，見表3、圖2。

3" "討" " " 論

TPE是由于MTB感染胸膜腔所產(chǎn)生的變態(tài)反應(yīng)而發(fā)生的炎癥，是肺結(jié)核的常見類型之一，也是胸腔積液產(chǎn)生的常見原因之一[16]。目前可通過臨床癥狀、影像學(xué)觀察、痰及胸腔積液MTB培養(yǎng)以及胸膜活檢等方式對TPE進(jìn)行臨床診斷，但由于TPE通常在MTB感染機(jī)體后6～12周才出現(xiàn)明顯的病理變化，其發(fā)病過程較為緩慢[17]；胸膜活檢具有創(chuàng)傷性且胸腔積液MTB涂片/培養(yǎng)陽性率極低；近年廣泛應(yīng)用于臨床的核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)雖提高了MTB檢出率，但總體敏感度僅28%～81%[18]，仍需探索更為敏感高效的TPE診斷指標(biāo)。

ADA廣泛存在于人體組織和細(xì)胞中，其中淋巴組織含量最高，ADA是參與機(jī)體免疫關(guān)系的代謝酶，是腺嘌呤生成次黃嘌呤的關(guān)鍵酶。研究[19]表明，MTB引起的特異性細(xì)胞免疫中，ADA在淋巴細(xì)胞分化中的活性大幅升高。傳統(tǒng)上胸腔積液ADA輔助診斷TPE的診斷界值為45 U/L。本研究通過ROC曲線對胸腔積液ADA分析，發(fā)現(xiàn)其診斷TPE的最佳臨界值為31.25 U/L，與文玉琪等[20]的研究結(jié)果一致，其敏感度和特異度分別為71.00%、94.64%。

T-SPOT.TB是以MTB基因中存在特殊編碼的ESAT6和CFP10作為T細(xì)胞特異性刺激原，ESAT6、CFP10通過刺激T淋巴細(xì)胞生成致敏T淋巴細(xì)胞、INF-γ，通過計算斑點的數(shù)量來推測體內(nèi)對MTB反應(yīng)的效應(yīng)T細(xì)胞[21]，研究[22]表明T-SPOT.TB檢查具有較高的靈敏度和特異度。本研究ESAT6、CFP10診斷結(jié)核性胸膜炎的敏感度分別為82.30%、71.00%，特異度分別為82.14%、76.79%，與文獻(xiàn)[23]的研究結(jié)果相符。然而T-SPOT.TB檢查雖然檢測方便，但其單獨診斷敏感度和特異性不高，診斷價值仍有待提高。

此外，通過比較兩組凝血功能指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)TPE組外周血D-D含量明顯高于NTPE組（均Plt;0.001）。D-D是纖維蛋白的降解產(chǎn)物，水平升高提示患者機(jī)體出現(xiàn)繼發(fā)性纖溶亢進(jìn)現(xiàn)象，并形成血栓，反映機(jī)體的高凝狀態(tài)[24]。臨床實踐中發(fā)現(xiàn)TPE患者體內(nèi)存在異常凝血功能，從而引血漿D-D明顯升高[11]。張艷麗等[3]研究表明，TPE胸腔積液中D-D濃度高于非結(jié)核性胸腔積液，從而導(dǎo)致患者血漿中D-D含量升高。近年來，不少研究[25]表明血漿D-D含量與結(jié)核性滲出性胸膜炎的發(fā)生呈正相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)外周血ESAT6、CFP10斑點孔數(shù)與D-D水平則呈低度正相關(guān)（r=0.398、0.443，均Plt;0.001），血漿D-D水平早期診斷PTE性能分析AUC、敏感度、特異度分別為0.789、71.00%、76.79%，低于其他檢測方法。

ROC曲線分析顯示，胸腔積液ADA含量、外周血ESAT6、CFP10斑點孔數(shù)及D-D的AUC分別為0.842、0.845、0.840、0.789，但是聯(lián)合測定的AUC高達(dá)0.960，敏感度為87.10%，特異度為96.43%，均高于單個指標(biāo)。上述結(jié)果提示胸腔積液ADA、外周血T-SPOT.TB（ESAT6、CFP10孔數(shù)）以及D-D水平能早期診斷TPE，聯(lián)合診斷時敏感度、特異度均最高。此外，本研究存在一些不足，如納入的標(biāo)本量偏少，需進(jìn)一步增加樣本量進(jìn)行論證。

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[收稿日期] 2024-05-08