赤靈芝多糖對ETEC所致腸炎的影響及機(jī)制研究

[摘要]"目的"研究赤靈芝多糖（ganoderma"lucidum"polysaccharides，GLP）對產(chǎn)腸毒素型大腸桿菌（enterotoxigenic"Escherichia"coli，ETEC）誘導(dǎo)小鼠腸炎的作用效果及機(jī)制。方法"選用24只6～8周齡雄性SPF級昆明小鼠，利用ETEC菌液腹腔注射誘導(dǎo)建立小鼠腸炎模型。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為為正常組、ETEC感染組、ETEC感染+高劑量GLP組，ETEC感染+低劑量GLP組，每組6只。采用HE染色觀察小鼠小腸組織病理變化，采用免疫印跡法檢測各組小鼠小腸組織中C反應(yīng)蛋白（C-reactive"protein，CRP）、腫瘤壞死因子（tumour"necrosis"factor，TNF）-α和白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6蛋白的表達(dá)情況。檢測各組小鼠小腸組織中Toll-樣受體4（Toll-like"receptor４，TLR4）、核因子κB"p65亞基（nuclear"factor-κB"p65，NF-κB"p65）、髓樣分化因子88（myeloid"differentiation"factor88，MyD88）mRNA的表達(dá)水平，探查GLP通過TLR4核因子κB（nuclear"factor-κB，NF-κB）信號通路對ETEC誘導(dǎo)的小鼠腸道炎癥的調(diào)控作用。結(jié)果"與正常組比較，ETEC感染組小鼠出現(xiàn)精神萎靡，食欲減弱，小腸絨毛破損，組織中可發(fā)現(xiàn)大量的炎性浸潤，疾病活動指數(shù)（disease"activity"index，DAI）呈上升趨勢（Plt;0.05），小鼠小腸組織中TLR4、NF-κB"p65、MyD88"mRNA的相對表達(dá)量和CRP、TNF-α、IL-6的蛋白表達(dá)水平增高（Plt;0.01）。與ETEC感染組比較，ETEC感染+不同劑量組中小鼠精神狀態(tài)和食欲有所改善，小鼠小腸組織中TLR4、NF-κBp65、MyD88的mRNA相對表達(dá)量均降低（Plt;0.01）。ETEC感染+高劑量組中小鼠小腸組織CRP、TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)水平降低（Plt;0.01），ETEC感染+低劑量組降低程度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）。與ETEC感染+低劑量組比較，ETEC感染+高劑量組小鼠小腸組織TLR4、MyD88"mRNA的相對表達(dá)量和IL-6蛋白表達(dá)水平均降低（Plt;0.05）。結(jié)論"GLP可有效緩解ETEC誘導(dǎo)的小鼠腸道的炎癥，且可能通過調(diào)控TLR4/NF-κB信號通路發(fā)揮抗炎作用，其作用效果可能與濃度呈正比。

[關(guān)鍵詞]"靈芝多糖；產(chǎn)腸毒素型大腸桿菌；炎癥因子

[中圖分類號]"R285.5""""""[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]"A""""[DOI]"10.3969/j.issn.1673-9701.2024.35.015

Impact"and"mechanisms"of"ganoderma"lucidum"polysaccharide"on"ETEC-induced"enteritis

HUANG"Kexiang，"TAN"Feitong，"PAN"Tangxin，"XING"Dong，"XIAO"Ruyan，"HOU"Juan，"JIA"Wei

Jishou"University"School"of"Medicine，"Jishou"416000，"Hunan，"China

[Abstract]"Objective"To"study"on"the"effects"and"mechanisms"of"ganoderma"lucidum"polysaccharides"（GLP）"on"enteritis"induced"by"enterotoxigenic"Escherichia"coli"（ETEC）"in"mice."Methods"Twenty-four"6-"to"8-"weeks"-old"male"SPF"Kunming"mice"were"selected."A"mouse"enteritis"model"was"induced"by"intraperitoneal"injection"of"ETEC"bacterial"suspension."Mice"were"divided"into"normal"group，"ETEC"infection"group，"ETEC"infection+high-dose"GLP"group，"and"ETEC"infection+"ow-dose"GLP"group"using"a"random"number"table"method，six"mice"in"each"group."Pathological"changes"in"mice"small"intestine"tissue"werenbsp;observed"through"HE"staining.The"expression"of"C-reactive"protein"（CRP），"tumor"necrosis"factor-"（TNF）-α，"and"interleukin"（IL）"-6"proteins"in"mice"small"intestine"tissues"were"detected"by"Western"blot"method，"and"expression"levels"of"Toll-like"receptor"4"（TLR4），"nuclear"factor-κB"（NF-κB）"p65，"and"myeloid"differentiation"factor"88"（MyD88）"mRNA"in"mice"small"intestine"tissues"were"detected"by"RT-qPCR"technique"to"explore"the"regulatory"effect"of"GLP"on"ETEC-induced"mice"intestinal"inflammation"through"TLR4/NF-κB"signaling"pathway."Results"Compared"with"control"group，"mice"infected"with"ETEC"showed"lethargy，"reduced"appetite，"damaged"intestinal"villi，"significant"inflammatory"infiltration"in"tissues，"and"an"increasing"trend"in"disease"activity"index"（DAI）"scores"（Plt;0.05）."The"relative"expression"levels"of"TLR4，"NF-κB"p65，"and"MyD88"mRNA，"as"well"as"protein"expression"levels"of"CRP，"TNF-α，"and"IL-6"in"small"intestine"tissues"of"mice，"were"significantly"increased"（Plt;0.01）.Compared"with"ETEC-infected"group，"mice"in"different"dosage"groups"showed"improvements"in"mental"status"and"appetite."The"relative"expression"levels"of"TLR4，"NF-κB"p65，"and"MyD88"mRNA"in"small"intestine"tissues"of"mice"were"significantly"decreased"in"all"dosage"groups"（Plt;0.01）."In"ETEC"infection+high-dose"group，"protein"expression"levels"of"CRP，"TNF-α，"and"IL-6"in"small"intestine"tissues"of"mice"were"significantly"decreased"（Plt;0.01），"while"the"decrease"in"ETEC"infection+low-dose"group"was"not"significant"（Pgt;0.05）."Compared"with"ETEC"infection+low-dose"group，"ETEC"infection+high-dose"group"showed"significant"decreases"in"relative"expression"levels"of"TLR4"and"MyD88"mRNA，"as"well"as"in"protein"expression"level"of"IL-6"in"small"intestine"tissues"of"mice"（Plt;0.01"or"Plt;0.05）."Conclusion"GLP"can"effectively"relieve"intestinal"inflammation"induced"by"ETEC，"and"may"exert"its"anti-inflammatory"effect"through"regulating"TLR4/NF-κB"signaling"pathway，"which"may"be"proportional"to"its"concentration.

[Key"words]"Ganoderma"lucidum"polysaccharide;"Enterotoxigenic"Escherichia"coli;"Inflammatory"factor

感染性腸炎發(fā)病率逐年上升，其中產(chǎn)腸毒素型大腸桿菌（enterotoxigenic"Escherichia"coli，ETEC）是感染性腸炎的主要致病菌，兒童和旅行者為易感人群，ETEC是發(fā)展中國家嬰幼兒腹瀉常見病因[1-3]。ETEC致病率可達(dá)20%～40%，感染后可出現(xiàn)急性水樣腹瀉，并伴有發(fā)燒、嘔吐和脫水等癥狀，死亡率高達(dá)30%～50%[4]。研究表明ETEC可通過增加Toll樣受體4（Toll-like"receptor"4，TLR4）核因子κB（nucear"factor-κB，NF-κB）激活TLR4/NF-κB信號通路，從而導(dǎo)致ETEC腸炎[5]。食源性疾病暴發(fā)事件中出現(xiàn)雜交混合型菌株，這些菌株含有多種毒力基因，對人類健康的危害越來越大[6]。通常選用抗生素治療，隨著抗生素的廣泛使用，產(chǎn)生較高的耐藥率[7]。

赤靈芝是一種名貴的中藥材，性溫，氣味苦平無毒，有滋補(bǔ)強(qiáng)身、延年益壽等功效[8]。赤靈芝多糖（ganoderma"lucidum"polysaccharides，GLP）是赤靈芝的主要活性成分，具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎等作用[9]。研究表明GLP對治療癌癥、糖尿病、心血管疾病等有很好的藥用價(jià)值[10]。為進(jìn)一步挖掘GLP的藥用價(jià)值，本研究通過腹腔注射ETEC建立小鼠腸炎動物模型進(jìn)行GLP對ETEC誘導(dǎo)的小鼠腸炎作用效果及機(jī)制研究，為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。

1""材料與方法

1.1""實(shí)驗(yàn)材料

GLP（浙江養(yǎng)芝康生物科技有限公司），ETEC（環(huán)凱微生物科技有限公司）。SPF級昆明小鼠[湖南斯萊克達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SCXK（湘）2019-0017]；腫瘤壞死因子（tumour"necrosis"factor，TNF）-α兔多克隆抗體、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6兔多克隆抗體、C反應(yīng)蛋白（C-reactive"protein，CRP）兔多克隆抗體、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（碧云天有限公司）。

1.2""實(shí)驗(yàn)方法

將24只6～8周齡雄性SPF級昆明小鼠單籠喂養(yǎng)，自由飲食飲水，適應(yīng)性飲食1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、ETEC感染組、ETEC感染+高劑量GLP組、ETEC感染+低劑量GLP組，每組6只。參考文獻(xiàn)[11-12]的方法，將ETEC懸液稀釋至1×108CFU/ml。對ETEC感染組、ETEC感染+高劑量GLP組、ETEC感染+低劑量GLP組按體質(zhì)量每克腹腔注射0.02ml的ETEC稀釋液，正常組腹腔注射生理鹽水，持續(xù)1周。根據(jù)疾病活動指數(shù)（disease"activity"index，DAI）對小鼠的體質(zhì)量，糞便情況評估賦分。繪制曲線并分析，若曲線變化隨時(shí)間的改變呈上升趨勢則表明造模成功。造模完成后，將飲用水作為溶劑，GLP作為溶質(zhì)，按濃度要求配置GLP液。ETEC感染+高劑量GLP組，ETEC感染+低劑量GLP組每天分別灌胃濃度為150mg/kg、50mg/kg的GLP液，正常組和ETEC感染組灌胃飲用水，持續(xù)2周。

1.3""觀察指標(biāo)

每天觀察小鼠的精神、反應(yīng)和行動是否正常及食欲和糞便性狀是否改變，記錄體質(zhì)量。取小鼠小腸組織使用甲醛固定，進(jìn)行切片。HE染色后，于顯微鏡下觀察炎性浸潤情況和腸絨毛的完整性等變化。根據(jù)炎癥分級標(biāo)準(zhǔn)[13]進(jìn)行組織學(xué)評分：無炎癥征象（0分）；少量細(xì)胞浸潤至黏膜層（1分）；單核細(xì)胞浸潤導(dǎo)致隱窩分離、黏膜輕度增生（2分）；大量炎癥細(xì)胞浸潤，黏膜破壞，杯狀細(xì)胞脫落，黏膜增生嚴(yán)重（3分）。

1.4""RT-PCR與蛋白檢測

根據(jù)美國國家生物技術(shù)信息中心（National"Center"of"Biotechnology"Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫中小鼠的mRNA序列，委托生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)合成。取15～20mg小腸組織，置于液氮中研磨成粉末，并加入裂解液。待裂解完全后進(jìn)行純化洗脫得到純化的RNA。將純化后的RNA進(jìn)行反應(yīng)，最后經(jīng)RT-PCR檢測各基因的轉(zhuǎn)錄水平。取小鼠小腸組織，于液氮低溫研磨，提取蛋白。然后進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜封閉，并依次孵育一抗和二抗。孵育完成后進(jìn)行顯影成像，使用Image"J對其進(jìn)行分析。

1.5""統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用"GraphPad"Prism"8.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（"）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2""結(jié)果

2.1""各組小鼠基本情況比較

實(shí)驗(yàn)期間，正常組小鼠精神和食欲正常，造模后小鼠精神萎靡，食欲減弱。GLP干預(yù)后，小鼠精神和食欲有所改善。兩種劑量的GLP組間比較無差異。腹腔注射ETEC稀釋液后，小鼠的體質(zhì)量隨注射天數(shù)出現(xiàn)下降。兩種不同濃度的GLP溶液灌胃后，小鼠體質(zhì)量均有上升。造模期間，造模組小鼠的DAI評分隨天數(shù)的增長呈現(xiàn)上升趨勢，與正常組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。見圖1。

2.2""各組小鼠的病理結(jié)果比較

正常組小鼠腸黏膜層、黏膜下層及腸絨毛未見明顯異常，未有炎性浸潤。與正常組比較，ETEC感染組小鼠小腸絨毛破損，有大量炎性浸潤，組織學(xué)評分升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。ETEC感染+高劑量GLP組和ETEC感染+低劑量GLP組小鼠炎性浸潤程度少于ETEC感染組，腸絨毛損傷程度減輕，組織學(xué)評分降低，與正常組比較，有小腸絨毛破損，輕微炎性浸潤，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），見圖2。

2.3""TLR4/NF-κB信號通路關(guān)鍵mRNA的相對表達(dá)量

ETEC感染組小鼠TLR4、MyD88、NF-κBp65"mRNA的相對表達(dá)量高于正常組（Plt;0.01），ETEC感染+高劑量GLP組和ETEC感染+低劑量GLP組小鼠的TLR4、NF-κBp65、MyD88"mRNA的相對表達(dá)量低于ETEC感染組（Plt;0.01）。與ETEC感染+低劑量GLP組比較，ETEC感染+高劑量GLP組小鼠腸道組織中TLR4、MyD88"mRNA的相對表達(dá)量降低（Plt;0.01）。

2.4""各組小鼠的炎癥因子蛋白表達(dá)水平比較

ETEC感染組中CRP、TNF-α、IL-6蛋白的相對表達(dá)量均高于正常組（Plt;0.01）。ETEC感染+高劑量GLP組中小鼠小腸組織CRP、TNF-α、IL-6蛋白的相對表達(dá)量低于ETEC感染組（Plt;0.01），ETEC感染+低劑量GLP組中小鼠小腸組織CRP、TNF-α、IL-6蛋白的相對表達(dá)量低于ETEC感染組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）。ETEC感染+高劑量GLP組中小鼠小腸組織IL-6蛋白的相對表達(dá)量低于ETEC感染+低劑量GLP組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），見圖3。

3""討論

ETEC屬革蘭陰性菌，主要通過菌毛黏附定植于細(xì)胞表面引起炎癥反應(yīng)[14-18]。TLR4作為TLR4/"NF-κB信號通路關(guān)鍵部分存在于細(xì)胞表面，可特異性識別脂多糖[19]。ETEC侵襲腸道后，其表面的脂多糖與腸道上皮細(xì)胞表面的TLR4受體特異性結(jié)合，激活TLR4/NF-κB信號通路，可促使IL-6、TNF-α等炎癥因子產(chǎn)生[20-21]。CRP作為機(jī)體非特異性免疫中的一環(huán)，當(dāng)發(fā)生感染或組織損傷時(shí)，其表達(dá)可隨著炎癥程度的增高而上升，尤其細(xì)菌感染，升高更明顯[22]。造模后，小鼠體質(zhì)量下降、精神萎靡，食欲減弱，小腸組織中TLR4、NF-κBp65、MyD88"mRNA的相對表達(dá)量和CRP、TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)水平相較于正常組均明顯升高。不同劑量的GLP灌胃后，小鼠小腸組織中TLR4/NF-κB信號通路關(guān)鍵mRNA和炎性因子蛋白的表達(dá)均降低。炎性因子蛋白的變化趨勢與TLR4/NF-κB信號通路關(guān)鍵mRNA變化趨勢一致。GLP可抑制通路中某蛋白的磷酸化而破壞信號通路，其抗炎作用可能與TLR4/NF-κB信號通路下調(diào)有關(guān)。本研究結(jié)果表明GLP治療效果可能與其濃度呈正相關(guān)。GLP可促進(jìn)小腸絨毛損傷愈合，可能與GLP降低腸通透性和血清D-乳酸水平增加小腸杯狀細(xì)胞和免疫蛋白A分泌細(xì)胞的數(shù)量有關(guān)[23]。

近年來，中草藥成分研究的不斷深入和植物提取行業(yè)的發(fā)展，中草藥中有效成分的藥用價(jià)值逐漸提高；分為酸、多酚、多糖、萜類等[24]。多糖廣泛存在于多種植物中，例如黃芪多糖、南瓜多糖、白術(shù)多糖等[25-26]。與其他多糖相比，GLP在抑菌和腸道菌群調(diào)節(jié)方面效果更明顯。GLP是一種安全的生物活性成分，可提高人群免疫力，更有利于疾病的預(yù)防及減少治療過程中產(chǎn)生的不良反應(yīng)[27]。因此，相比于其他多糖具有更廣泛的應(yīng)用前景。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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