PCV4 Cap抗體ELISA檢測方法的建立及血清流行病學調查

摘 要： 旨在建立一種豬圓環(huán)病毒4（porcine circovirus type 4， PCV4）Cap蛋白間接ELISA抗體檢測方法，對豬群中PCV4抗體進行檢測，并與以往的關于PCV4血清流行病學的調查結果進行對比研究，從而更全面地了解PCV4在豬群中的感染和流行情況。本研究利用原核表達系統(tǒng)成功表達PCV4 Cap蛋白，對反應條件進行優(yōu)化，建立了基于PCV4 Cap蛋白的間接ELISA方法。采用建立的ELISA方法對中國18個省份的不同階段的2 298份豬血清樣本進行檢測，以調查中國豬群中PCV4的血清學流行情況。同時將Cap-ELISA檢測方法與之前建立的Rep-ELISA進行對比，平行檢測845份血清樣本。結果顯示，在18個省份中，17個省的血清樣本中檢測到PCV4抗體。PCV4總血清陽性率為34.94%，母豬和育肥豬陽性率分別為59.95%和31.64%，仔豬陽性率為21.14%，保育豬中檢出的陽性率最低，為4.20%。兩種方法共同檢測845份血清樣本，符合率為82.84%，其中Cap-ELISA檢測總陽性率為31.83%，Rep-ELISA檢測總陽性率為35.03%。研究表明，PCV4在中國廣泛傳播，不同年齡階段的豬只均能感染。Cap-ELISA和Rep-ELISA兩種方法一致性高，從抗體消長規(guī)律來分析，兩種方法都說明豬群感染PCV4主要在育肥豬和母豬階段。本研究提供了中國PCV4的最新血清流行病學特征和PCV4在不同階段豬群中的感染情況，進一步證實了PCV4在我國豬群中有一定的感染率，其危害值得進一步研究和關注。

關鍵詞： 豬圓環(huán)病毒4；原核表達；間接ELISA；血清流行病學調查

中圖分類號： S852.659.2

文獻標志碼：A""" 文章編號：0366-6964（2024）05-2072-08

收稿日期：2023-08-15

基金項目：國家自然科學基金面上項目（32072871）；湖南省重點研發(fā)計劃項目（2023NK2017）；云南省重大科技專項計劃（202202AE090032）

作者簡介：宋曉晴（1999-），女，湖南瀏陽人，碩士生，主要從事動物傳染病流行病學研究，E-mail：2459653794@qq.com

*通信作者：董 偉，主要從事獸藥新制劑研發(fā)及動物傳染病防控研究，E-mail：dongwei@hunau.edu.cn；葛 猛，主要從事動物傳染病診斷及防控研究，E-mail：gmg02@126.com

Establishment of ELISA for Detection of PCV4-Cap Antibody and Sero-epidemiological

Survey

SONG" Xiaoqing1， DENG" Ruide1， LI" Xin1， LI" Jiao2， LI" Runcheng1， DU" Lifei3， DONG" Wei1*，

GE" Meng1*

（1.College of Veterinary Medicine， Hunan Agricultural University， Changsha 410128，" China;

2.Hunan Meishen Breeding Co.， Ltd， Zhuzhou 412000，" China;

3.Hunan Animal and Veterinary Science， Changsha 410131，" China）

Abstract：" The present study aimed to develop an indirect ELISA to detect antibodies against the Cap protein of porcine circovirus type 4 （PCV4）， and to detect PCV4 antibodies in pigs， then compare the results with previous investigations on PCV4 seroepidemiology， so as to understand the prevalence and infection of PCV4 in swine populations more comprehensively. PCV4 Cap protein was successfully expressed in a prokaryotic expression system. By optimizing the reaction conditions， an indirect ELISA method based on PCV4 Cap protein was established. To investigate the serological prevalence of PCV4 in Chinese pig herds， 2 298 serum samples from pigs at different growth stages from 18 provinces in China were analyzed using the established ELISA method. Concurrently， the Cap-ELISA method was compared with Rep-ELISA， and 845 serum samples were tested in parallel. The results showed that PCV4 antibodies were detected in serum samples from 17 out of the 18 provinces. The total seroprevalence of PCV4 was 34.94%， and the positive rates of sows and finishing pigs were 59.95% and 31.64%， respectively. The positive rate of piglets was 21.14%， while nursery pigs had the lowest positive rate at 4.20%. A total of 845 serum samples were tested using both methods， and the coincidence rate was 82.84%. The Cap-ELISA test yielded an overall positive rate of 31.83%， while the Rep-ELISA test had an overall positive rate of 35.03%. Studies have demonstrated the widespread prevalence of PCV4 across the country and its ability to infect pigs of all ages. The Cap-ELISA and Rep-ELISA techniques exhibited a high degree of concordance， and based on the antibody growth and decline trends， both methods indicated that PCV4 infection primarily occurs in finishing pigs and sows. The present study provides the most recent data on the seroepidemiological characteristics of PCV4 in China and PCV4 infection prevalence in pigs at different growth stages， which could facilitate further research on PCV4 and its management.

Key words： PCV4; prokaryotic expression; indirect ELISA; seroepidemiological survey

*Corresponding authors：" DONG Wei， E-mail： dongwei@hunau.edu.cn; GE Meng， E-mail： gmg02@126.com

豬圓環(huán)病毒 4（porcine circovirus 4，PCV4）是2019年首次報道的圓環(huán)病毒科，圓環(huán)病毒屬成員，是由二十面體衣殼內的環(huán)狀單鏈基因組DNA組成的小型球形無包膜病毒［1-2］，全基因包含12個開放閱讀框（open reading frame，ORF），ORF1和ORF2是兩個主要的開放閱讀框，分別編碼復制酶蛋白（replicase protein，Rep）和衣殼蛋白（capsid protein，Cap）。在這之前，已經報道的豬圓環(huán)病毒有三種，分別為豬圓環(huán)病毒1（PCV1）、豬圓環(huán)病毒2（PCV2）和豬圓環(huán)病毒3（PCV3）。其中PCV1無致病性［2-5］。PCV2和PCV3具有致病性，PCV2可導致斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）和豬皮炎腎病綜合征（porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS）［4-5］，PCV3則與PDNS和繁殖障礙的產生有關［6-7］。其中PCV2、PCV3對豬的感染均主要集中在淋巴結、脾、扁桃體等免疫器官［8-9］。

PCV4在全球的流行越來越廣泛，目前PCV4已經在中國、韓國和泰國等多個國家被檢測到［1，10-11］，同時，多篇報道表明PCV4呈現(xiàn)跨物種傳播的特征，不僅在豬群中檢測到，在其他物種，包括犬類、奶牛和毛皮動物的臨床樣本中均發(fā)現(xiàn)PCV4的感染［12-15］。2019年首次在湖南省發(fā)現(xiàn)的感染PCV4的豬群中，大多數豬具有嚴重的臨床體征，包括呼吸道疾病、腸炎和PDNS等［1］。多篇報道表明PCV4主要在感染了其它PCVs的豬樣本中被檢測到［16-18］，推測PCV4可能對疾病的產生具有協(xié)同作用或一定的致病性。在最近的報道中，Niu等［19］將PCV4從感染性克隆中拯救出來，接種仔豬后雖未產生明顯的臨床癥狀，但仔豬的肺、脾、腎、肝和淋巴結均出現(xiàn)不同程度的病理變化。這進一步表明了PCV4可能具有致病性，因此控制PCV4的傳播顯得極為重要，需要對PCV4的分子流行病學和血清學進行更多的調查。

目前，關于PCV4在中國各省份的分子流行病學調查已有多篇報道，而血清學調查相對較少。在課題組之前的研究中建立了基于PCV4 Rep蛋白的ELISA方法，并對中國17個省的1 790份血清樣本進行了PCV4的血清流行病學調查，總陽性率為43.97%［20］。2021年Lian等［21］建立了基于PCV4-Cap蛋白的ELISA方法，對江蘇省2018—2021年采集的1 048份血清樣本進行了PCV4血清學調查，陽性率為3.44%。2022年Hu等［22］建立了分別以Cap和Rep蛋白為包被抗原的PCV4間接ELISA，并應用于江西省507份血清的 PCV4 血清流行病學調查，陽性率分別為3.35%和7.10%。這幾份血清流行病學調查之間存在較大差異，可能是采集樣本的數量和樣本覆蓋范圍不同或者樣本的年齡階段不同導致的。因此，為了進一步調查PCV4在中國的流行率，并且驗證課題組之前利用Rep-ELISA進行血清流行病學調查的結論［20］，本研究建立了一種基于PCV4 Cap蛋白的間接ELISA方法，用于檢測PCV4抗體，隨后采用建立的ELISA方法對中國18個省的不同年齡階段的2 298份血清進行了PCV4血清學調查，以了解PCV4的感染情況，從而為控制PCV4的傳播提供更加清楚、可靠的信息。

1 材料與方法

1.1 血清

PCV2、PCV3、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）豬偽狂犬病病毒（porcine pseudorabies virus， PRV）、豬瘟病毒（classical swine fever virus， CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus， PRRSV）

陽性血清由本實驗室保存。PCV4陰性血清和陽性血清為經定量PCR和PCV4 Rep-ELISA檢測，PCV4核酸和抗體均為陰性或陽性的臨床血清樣本。2 298份臨床豬血清樣本采自安徽、福建、廣西、廣東、貴州、河北、湖北、湖南、河南、江蘇、江西、吉林、內蒙古、山東、山西、四川、新疆和云南共18個省份，其中母豬血清824份、仔豬血清629份、保育豬血清333份、育肥豬血清512份。

1.2 主要試劑和材料

96孔酶標板購自Costar公司；Ni-NTA親和層析樹脂購自QIAGEN公司；辣根過氧化物酶標記的兔抗豬IgG、TMB顯色液均購自KPL公司。

1.3 原核表達質粒的構建

根據PCV4-AHG-2019基因組序列（GenBank登錄號：MK986820），對其進行密碼子優(yōu)化，分別在優(yōu)化后的序列的5′和3′端加入NdeⅠ和BamHⅠ兩種酶切位點，合成PCV4 Cap基因全序列。將人工合成的PCV4 Cap全長序列與載體 pET28a（+）分別用限制性內切酶NdeⅠ和BamHⅠ進行酶切，回收酶切產物后進行連接，并轉化入大腸桿菌DH5α。用PCR篩選陽性克隆，對其增菌培養(yǎng)后提取質粒進行雙酶切鑒定，最終獲得重組質粒pET28a-PCV4Cap。

1.4 重組蛋白的表達與純化

根據生產商說明將重組質粒pET28a-PCV4Cap轉化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，挑取陽性菌落，在LB培養(yǎng)基（含50 μg·mL-1卡那霉素）中培養(yǎng)至OD600 nm為0.6，加入終濃度為0.5 mmol·L-1的 IPTG，并在37℃、180 r·min-1下表達5h，離心收集細菌進行超聲破碎。將重組蛋白通過 Ni-NTA 親和層析柱進行純化，用SDS-PAGE蛋白電泳對純化后的PCV4 Cap重組蛋白進行驗證。

1.5 PCV4 Cap蛋白抗體間接ELISA方法的建立與優(yōu)化

參照之前研究建立的ELISA方法中的孵育條件［20］，使用方陣法確定抗原包被濃度和血清稀釋倍數。將純化的PCV4 Cap重組蛋白從3μg·mL-1倍比稀釋至0.375μg·mL-1包被96孔酶標板，同時按1∶50、1∶100和1∶200稀釋之前建立的PCV4 Rep間接ELISA方法檢測的陰、陽性血清。根據陽性血清OD450 nm值/陰性血清OD450 nm值的比值（P/N值），以P/N值最大的條件作為最佳反應條件。確定最佳抗原包被濃度及血清稀釋倍數后，將酶標二抗進行1∶250、1∶500和1∶1 000稀釋，選取P/N值最大的酶標二抗?jié)舛葹樽罴逊磻獫舛取?/p>

1.6 臨界值的確定

為確定ELISA的臨界值，取89份經定量PCR和PCV4 Rep-ELISA檢測均為陰性的保育豬血清作為陰性血清樣品，與陽性對照血清同時進行ELISA檢測，計算陰性血清平均S/P值（陰性血清樣品OD450 nm值 /陽性對照OD450 nm值）和標準偏差（s）。臨界值=陰性血清平均S/P值+3 s。

1.7 交叉反應分析

采用建立的PCV4 Cap-ELISA方法對PCV2、PCV3、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）的陽性血清進行檢測，以評估ELISA的特異性。

1.8 重復性試驗

為了評估PCV4 Cap-ELISA的批內重復性，取4份不同抗體水平的陽性血清和4份陰性血清用同一批次制備的蛋白包被板在3個不同的時間點分別進行檢測。為了評估PCV4 Cap-ELISA的批間重復性，取4份不同抗體水平的陽性血清和4份陰性血清用三塊不同的抗原包被板進行檢測。分別計算每份血清樣品平均OD450 nm值（x-）和標準偏差（s），變異系數（CV）=（s／x-）×100%。

1.9 與Rep-ELISA的結果對比分析

本文中建立的Cap-ELISA方法與之前建立的Rep-ELISA方法共同檢測血清845份，其中母豬352份，仔豬149份，保育豬125份，育肥豬219份。將Cap-ELISA方法與Rep-ELISA方法檢測結果進行對比分析，以評定兩種方法的符合率。

2 結 果

2.1 原核表達質粒的鑒定

使用限制性內切酶NdeⅠ和BamHⅠ對pET28a-PCV4Cap重組質粒進行雙酶切鑒定，獲得690 bp的目的片段和5 327 bp的pET-28a載體片段（圖1）。說明重組表達質粒pET28a-PCV4Cap構建成功。

2.2 重組蛋白的表達與純化

SDS-PAGE結果顯示（圖2），PCV4 Cap重組蛋白在大腸桿菌表達系統(tǒng)中為可溶性表達，在約32 ku處出現(xiàn)特異性條帶。

2.3 PCV4 Cap蛋白抗體間接ELISA方法的優(yōu)化

使用方陣法確定抗原包被濃度和血清稀釋倍數。結果顯示，當抗原以1.5 μg·mL-1進行包被，血清樣本100倍稀釋時得到最大P/N值。以此為條件，當酶標二抗以1∶250、1∶500和1∶1 000稀釋時P/N值分別為26.467、18.459和9.698，因此選用1∶250作為最佳二抗稀釋倍數。將上述條件作為臨床血清樣本檢測的最終條件。

2.4 臨界值的確定

采用本研究建立的Cap-ELISA方法對89份陰性血清樣品進行檢測，計算得出其平均S/P值為0.16，標準偏差為0.031 5。因此將Cap-ELISA臨界值設為0.25。即當S/P值≥0.25時判定為陽性，S/P值＜0.25時判定為陰性。

2.5 交叉反應分析

采用建立的PCV4 Cap-ELISA方法同時檢測PCV4和PCV2、PCV3、CSFV、PRV、PRRSV的陽性血清，結果顯示，除PCV4陽性血清外，所有血清S/P值均小于臨界值0.25，表明本抗原與其他常見豬病毒陽性血清無交叉反應，具有良好的特異性。

2.6 重復性試驗

用建立的Cap-ELISA方法對4份不同抗體水平的陽性血清和4份陰性血清分別進行批內和批間重復性試驗。結果表明，批內變異系數為2.91%～6.26%，批間變異系數為3.90%～8.33%，均小于10%，證明本研究建立的Cap-ELISA方法具有良好的重復性。

2.7 臨床血清樣品

我國18個省區(qū)中有17個省區(qū)的豬群可檢測到PCV4抗體（表1），PCV4總陽性率為34.94%。母豬血清陽性率為59.95%，育肥豬陽性率為31.64%，仔豬和保育豬陽性率分別為21.14%和4.20%（圖3）。

2.8 與Rep-ELISA的結果對比分析

在Rep-ELISA和Cap-ELISA共同檢測的845份血清樣本中（表2），PCV4 Cap蛋白檢測陽性的血清共269份，總陽性率為31.83%，平均S/P值為0.586；PCV4 Rep蛋白檢測為陽性的血清共296份，總陽性率為35.03%，平均S/P值為0.462。以 PCV4 Rep抗體檢測試劑盒檢測結果為標準計算，結果一致的血清樣本有700份，兩種檢測方式總符合率為82.84%。其中母豬符合率為81.25%，育肥豬75.34%，仔豬85.91%，保育豬最高，為96.80%（圖4）。

3 討 論

基于本研究建立的PCV4 Cap間接ELISA方法對我國18個省份進行了PCV4血清學調查，其中有17個省檢測出PCV4抗體。山西省采集的59份血清樣本來自同一豬場，其中包括30份母豬血清和29份仔豬血清。推測山西省未檢出PCV4陽性樣本的原因是采集的樣本數量較少或來源局限，此檢測結果也與課題組之前報道的PCV4 Rep間接ELISA檢測結果完全符合。本研究調查的中國2298份血清樣本中，PCV4總陽性率為34.94%，PCV4抗體可在多個階段的豬群中檢測到，其中母豬血清陽性率為59.95%，育肥豬陽性率為31.64%，仔豬和保育豬陽性率分別為21.14%和4.20%。在各階段豬群中，仔豬陽性率較高可能是因為母源抗體的存在。保育豬PCV4抗體陽性率大幅降低，僅為4.20%，這可能是仔豬階段高水平的母源抗體在保育階段大幅下降，導致其低陽性率。母豬和育肥豬的高陽性率表明PCV4感染可能主要發(fā)生在育肥豬中，隨著日齡的增長，在母豬階段大幅增加。

本研究建立的PCV4 Cap-ELISA方法與之前建立的PCV4 Rep-ELISA方法［20］共同檢測845份血清，其中Cap蛋白檢測總陽性率為31.83%，Rep蛋白檢測總陽性率為35.03%。檢測結果一致的血清樣本占82.84%。這表明我們建立的兩種方法一致性高，具有較強的可信度。兩種方法檢測PCV4在各階段豬群中的陽性率變化規(guī)律一致，呈現(xiàn)從仔豬到保育豬階段逐漸降低，隨后在育肥豬階段開始上升，母豬階段達到最高。從抗體消長規(guī)律來分析，兩種方法都說明豬群感染PCV4主要在育肥豬和母豬階段。研究表明Cap蛋白抗體陽性率與Rep蛋白抗體陽性率相當，少量陽性樣本檢測結果不一致的樣品主要集中在育肥豬階段，這也是豬群感染PCV4的初期。Rep-ELISA比Cap-ELISA檢測此階段樣品的陽性率更高，分別為33.33%和23.29%，推測豬群感染PCV4后，機體針對Rep蛋白產生抗體時間更早，這可能與病毒感染早期復制相關的Rep蛋白的表達量更高有關。兩種方法共同檢測845份血清樣本，Cap蛋白抗體陽性的血清共269份，平均S/P值為0.586，其中S/P值1.0以上的血清30份且平均S/P值為2.094；Rep蛋白抗體陽性的血清共296份，平均S/P值為0.462，其中S/P值1.0以上的血清15份且平均S/P值為1.558。Cap蛋白抗體在陽性率更低的情況下，S/P值1.0以上的血清數及其平均抗體S/P值反而明顯高于Rep蛋白抗體，推測機體對Cap蛋白產生的體液免疫反應更強，這可能與Cap蛋白是病毒表面結構蛋白從而具有更強的抗原性有關?；谶@些分析可以解釋為何Cap蛋白檢測與Rep蛋白出現(xiàn)少量結果不一致的情況?？偠灾徽撌钦n題組之前研究中建立的PCV4 Rep間接ELISA方法，還是本研究建立的PCV4 Cap間接ELISA方法，其PCV4血清學調查的陽性率都遠高于之前Lian等［21］和Hu 等［22］對江蘇省和江西省的PCV4血清學調查，這可能是由于采集樣本的年齡階段不同導致的，在本研究中，采用建立的方法檢測保育豬陽性率僅為4.20%。同時本研究采集樣本的范圍更廣，樣本量更多，這些因素也可能導致陽性率有較大差異。

隨著PCV4在全球的流行越來越廣泛，并且呈現(xiàn)跨物種傳播和混合感染的特征，又有研究表明PCV4可能具有致病性［19］，因此迫切的需要建立一種PCV4的檢測方法。ELISA是一種高通量的、快速的、低成本的檢測方法，目前，還未有商品化的試劑盒用于檢測PCV4抗體。本研究建立了PCV4 Cap間接ELISA方法，并采用建立的ELISA方法對中國18個省份的不同階段的豬群進行了血清流行病學調查。該方法特異性高，重復性好，與之前建立的PCV4 Rep間接ELISA方法具有較高的符合率，對PCV4的ELISA商品化試劑盒的開發(fā)具有很大的參考意義。同時，本研究有助于更深入的了解目前PCV4在我國的流行情況以及在豬群中的感染和免疫應答規(guī)律，從而為應對其潛在的疫病風險和建立有效的防控方案提供理論依據。

4 結 論

成功建立了PCV4 Cap蛋白抗體間接ELISA檢測方法，利用該方法對中國18個省份的豬群進行PCV4血清流行病學調查，結果表明PCV4在豬群中感染普遍，且主要感染階段為育肥豬和母豬。本研究進一步提供了PCV4在我國的最新血清流行病學信息，有助于了解其感染規(guī)律和應對其潛在的疫病風險。

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（編輯 "白永平）