貓皰疹病毒1型的檢測(cè)及一株分離毒株的致病性

摘 要： 旨在調(diào)查成都地區(qū)的貓皰疹病毒1型（feline herpesvirus-1， FHV-1）的流行及遺傳變異情況。試驗(yàn)選取2020—2023年從成都地區(qū)采集的178份具有呼吸道癥狀貓的眼、鼻及口咽拭子進(jìn)行FHV-1核酸檢測(cè)、gE基因遺傳進(jìn)化分析、FHV-1的分離鑒定和致病性研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，成都地區(qū)FHV-1陽(yáng)性率為11.8%（21/178）；其中寵物醫(yī)院FHV-1陽(yáng)性率為6.4%（7/110），貓舍FHV-1陽(yáng)性率為20.6%（14/68），表明在貓舍中FHV-1感染率更高。FHV-1 gE基因的遺傳進(jìn)化分析結(jié)果表明，本研究擴(kuò)增出的5株gE基因和疫苗株的核苷酸同源性在99.1%～100%，并發(fā)現(xiàn)PX-9株存在3個(gè)獨(dú)特的氨基酸突變位點(diǎn)（L259Q、C294I、W295F）。通過(guò)CRFK細(xì)胞對(duì)5份陽(yáng)性樣本進(jìn)行病毒的分離培養(yǎng)，結(jié)果PX-9毒株被成功分離鑒定。對(duì)PX-9毒株進(jìn)行動(dòng)物回歸試驗(yàn)，結(jié)果表明攻毒組貓只表現(xiàn)出眼鼻分泌物增多，打噴嚏等臨床癥狀，在接毒后第4天病毒拷貝數(shù)最高，為9.05×107 copies·μL－1，且排毒期較長(zhǎng)；攻毒貓只FHV-1病毒載量檢測(cè)結(jié)果顯示，氣管及肺組織病毒拷貝數(shù)分別為1.7×107和3.5×104 copies·μg－1，其它組織核酸陰性。綜上表明，在成都地區(qū)仍然存在FHV-1流行，并且流行毒株有較強(qiáng)的致病性。

關(guān)鍵詞： FHV-1；流行情況；遺傳變異；動(dòng)物回歸試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：S852.659.1；S858.293

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A""" 文章編號(hào)：0366-6964（2024）05-2253-06

收稿日期：2023-06-15

基金項(xiàng)目：國(guó)家農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系四川獸藥創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（SCCXTD-2020-18）；西南民族大學(xué)人才支持基金項(xiàng)目（RQD2021004）

作者簡(jiǎn)介：鄧梏男（1996-），男，四川宜賓人，碩士生，主要從事動(dòng)物疫病防控研究，E-mail：1181389642@qq.com

*通信作者：張 斌，主要從事動(dòng)物病原分子生物學(xué)研究，E-mail：binovy@sina.com；賀 超，主要從事動(dòng)物疫病防控研究及獸藥監(jiān)察工作，E-mail：525069528@qq.com

Detection of Feline Herpesvirus Type 1 and Pathogenicity of an Isolated Strain

DENG" Gunan1， ZHANG" Jiaqi1， BAO" Zhipeng4， CHEN" Taoyun1， YU" Qisheng1， DING" Lu1， ZHU" Chenxi1， WANG" Yi1， REN" Yupeng1，2， HE" Chao3*， ZHANG" Bin1，2*

（1.College of Animal and Veterinary Sciences， Southwest Minzu University， Chengdu 610041，

China;

2.Key Laboratory of Qinghai-Tibetan Plateau Animal Genetic Resource Reservation

and Utilization of Ministry of Education/Sichuan Provine， Chengdu 610041，" China;

3.Sichuan Provincial Veterinary Drug Supervision Institute， Chengdu 610041，" China;

4.Yunnan Vocational and Technical College of Agriculture， Kunming 650212，" China）

Abstract：" The aim of this study was to investigate the prevalence and genetic diversity of feline herpesvirus-1 （FHV-1） in Chengdu city. From 2020 to 2023， a total of 178 conjunctiva， pharynx and nose swabs were collected from cats with respiratory symptoms in Chengdu city. The collected samples were subjected to FHV-1 PCR detection， gE gene genetic evolutionary analysis， viral isolation and identification， as well as pathogenicity. The results showed that， the FHV-1 positivity rate in Chengdu city was 11.8% （21/178）. In which the FHV-1 positivity rate of veterinary hospitals was 6.4% （7/110） and 20.6% （14/68） in catteries， suggested that the higher rate of FHV-1 infection was in catteries. The genetic evolutionary analysis of five FHV-1 gE genes showed that the nucleotide homology was 99.1%～100% to the vaccine strains，and three unique amino acid mutation sites were found in PX-9 strain （L259Q， C294I， W295F）. Five positive samples were isolated and cultured by CRFK cell， only PX-9 strain was successfully isolated and identified from CRFK cells. The results of animal regression experiment by PX-9 strain showed that all cats in the infected group exhibited clinical symptoms， such as increased ocular， nasal secretions and sneezing. The highest viral load was found on the 4th day after inoculation （9.05×107 copies·μL－1）， and the detoxification period is relatively long. The results of FHV-1 viral load were 1.7×107 and 3.5×104 copies·μg－1 in trachea and lungs of infected group， respectively. The other tissues were negative for FHV-1 DNA. The results of this study indicated that FHV-1 was still prevalent in Chengdu and the prevalent strains had highly pathogenicity.

Key words： FHV-1; prevalence; genetic variation; animal regression experiment

*Corresponding authors： ZHANG Bin，E-mail：binovy@sina.com; HE Chao， E-mail：525069528@qq.com

貓皰疹病毒1型（feline herpesvirus-1，F(xiàn)HV-1）是引起貓上呼吸道疾病的主要病原［1］。感染該疾病主要表現(xiàn)為眼鼻分泌物增多、打噴嚏等，呈典型的上呼吸道感染癥狀；有的患貓還會(huì)出現(xiàn)舌和硬腭潰瘍、呼吸困難等癥狀［2］。

FHV-1屬于皰疹病毒科、α皰疹病毒亞科、水痘病毒屬成員。病毒粒子直徑為120～180 nm，呈20面體，由囊膜、核芯、衣殼組成，為線性雙鏈DNA基因組［3］。FHV-1基因組長(zhǎng)度約為126～134 kb， G+C含量約為50%，并由獨(dú)特長(zhǎng)區(qū)（UL）和獨(dú)特短區(qū)（US）組成。整個(gè)基因組編碼了多種主要的囊膜糖蛋白以及非結(jié)構(gòu)蛋白，其中g(shù)E基因位于US區(qū)，屬于結(jié)構(gòu)蛋白，通常被認(rèn)為是輔助蛋白，但是在自然感染中也是必不可少的［4］。在以前的研究中，F(xiàn)HV-1 gE基因和毒力相關(guān)，強(qiáng)弱毒株之間存在gE基因的差異，缺失gE基因會(huì)導(dǎo)致FHV-1的病毒毒力降低，但保持有良好的免疫原性［5］。另有研究證據(jù)表明，F(xiàn)HV-1 gE基因具有影響組織趨向、趨化病毒向組織轉(zhuǎn)移的特性［6］。

本研究采集成都地區(qū)部分寵物醫(yī)院及貓舍中具有呼吸道癥狀貓的眼、鼻及口腔拭子，分析成都地區(qū)FHV-1的流行及gE基因的遺傳變異情況；對(duì)分離出的FHV-1毒株進(jìn)行動(dòng)物回歸試驗(yàn)，以期豐富FHV-1的流行病學(xué)資料，為防控FHV-1提供有力支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本采集

2020—2023年從成都地區(qū)寵物醫(yī)院以及貓舍采集具有呼吸道癥狀（咳嗽、流鼻涕）貓的眼、鼻及口腔拭子樣本，記錄貓的采樣來(lái)源、年齡等信息。

1.1.2 細(xì)胞與試驗(yàn)動(dòng)物

貓腎細(xì)胞（crandell reese feline kidney，CRFK）為本實(shí)驗(yàn)室保存；試驗(yàn)動(dòng)物為6只8～12周齡田園貓（FHV、FPV、FCV病毒核酸均為陰性）。

1.1.3 主要試劑與儀器

Quick Taq Hs DyeMix購(gòu)自東洋紡（上海）生物科技有限公司；STE緩沖液、蛋白激酶K、DL2000 DNA Marker購(gòu)自TaKaRa生物技術(shù)有限公司；E. coli DH5α購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；PCR核酸擴(kuò)增儀購(gòu)自杭州博日科技有限公司；電泳儀、紫外凝膠成像分析儀購(gòu)自上海天能有限公司。

1.1.4 引物

參考文獻(xiàn)［3］及GenBank中FHV-1 gE基因序列設(shè)計(jì)引物對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增（登錄號(hào)：MH070347.1、MH070347.1），引物序列信息見(jiàn)表1。

1.2 方法

1.2.1 FHV-1檢測(cè)及gE基因的擴(kuò)增

采用酚-氯仿法提取貓樣本總DNA，使用表1中的引物對(duì)樣本的FHV-1進(jìn)行檢測(cè)和gE基因的擴(kuò)增。

1.2.2 FHV-1 gE基因遺傳進(jìn)化分析

將本研究獲得的FHV-1 gE基因全長(zhǎng)序列與GenBank中已發(fā)表的FHV-1 gE基因利用MEGA7.0序列分析軟件，采用鄰近法（Bootstrap自舉值選擇1 000次）構(gòu)建系統(tǒng)遺傳發(fā)育樹(shù)。

1.2.3 FHV-1分離培養(yǎng)及純化鑒定

將陽(yáng)性樣本接種于CRFK細(xì)胞，每日觀察細(xì)胞病變情況，盲傳三代后利用特異性引物進(jìn)行PCR檢測(cè)；鑒定正確后采用空斑純化方法進(jìn)行純化，并根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算TCID50；同時(shí)使用本實(shí)驗(yàn)室保存的兔源FHV-1陽(yáng)性血清作為一抗進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）鑒定。

1.2.4 FHV-1動(dòng)物回歸試驗(yàn)

將6只8～12周齡的中華田園貓隨機(jī)分為2組，每組3只，對(duì)攻毒組進(jìn)行滴鼻500 μL分離純化毒株病毒液（107.2 TCID50·mL－1），對(duì)照組接種等量的生理鹽水，隔天采集眼、鼻、口腔拭子保存，攻毒后第9天將對(duì)照組貓只安樂(lè)死，采用SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR方法［7］檢測(cè)內(nèi)臟組織中FHV-1的分布并計(jì)算病毒拷貝數(shù)，同時(shí)運(yùn)用GraphPad Prism軟件進(jìn)行分析，Plt;0.05或lt;0.01，則認(rèn)為數(shù)值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性或高度顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 PCR檢測(cè)結(jié)果與分析

對(duì)178份成都地區(qū)貓的眼、鼻及口腔拭子進(jìn)行病毒核酸檢測(cè)，結(jié)果共檢測(cè)出21份FHV-1陽(yáng)性，陽(yáng)性率為11.8%（CI=7.5%～17.5%）；寵物醫(yī)院中的陽(yáng)性率為6.4%（CI=2.6%～12.7%）；貓舍中的陽(yáng)性率為20.6%（CI=11.7%～32.1%）；幼齡貓（≤6月齡）陽(yáng)性率為22.2%（CI=10.0%～39.2%），成年貓（＞6月齡）陽(yáng)性率為11.7%（CI=4.4%～23.9%）；結(jié)果顯示FHV-1的感染情況在采樣地點(diǎn)間具有顯著差異（P=0.004），年齡間沒(méi)有顯著差異（P=0.195），表明FHV-1在貓舍等貓群聚集的地方傳播性較強(qiáng)，并且FHV-1在成年貓和幼年貓中都會(huì)造成感染。

2.2 FHV-1 gE基因的遺傳進(jìn)化及同源性分析

本文所分離的5株FHV-1 gE基因全長(zhǎng)序列（登錄號(hào)：OR105893-OR105897）大小為1 599 bp，經(jīng)過(guò)序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果表明其中1株（下文命名為PX-9）gE基因與疫苗株 Companion（GenBank No.KR381803）相比，存在L259Q、C294I和W295F氨基酸位點(diǎn)突變。5株分離株均處于同一分支，其gE基因核苷酸同源性為99.7%～100%，與疫苗株Companion同源性為99.1%～100%。（圖1A）。

2.3 FHV-1的分離培養(yǎng)和鑒定

接種眼、鼻、口腔拭子處理液的CRFK細(xì)胞在24 h左右出現(xiàn)細(xì)胞聚集、圓縮，成“葡萄串樣”，正常細(xì)胞無(wú)病變情況，對(duì)其空斑純化后進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果有單一的目的條帶，IFA結(jié)果表明感染FHV-1的CRFK細(xì)胞有特異性熒光綠，對(duì)照則無(wú)（圖1B～圖1F），表明該病毒為FHV-1，并命名為PX-9毒株；采用Reed-Muench法計(jì)算其TCID50為107.2 TCID50·mL-1。

2.4 FHV-1致病性試驗(yàn)

攻毒組貓?jiān)诘?天開(kāi)始出現(xiàn)打噴嚏、分泌膿性鼻液（圖2A）等癥狀；第9天將對(duì)照組貓安樂(lè)死后觀察內(nèi)臟組織病變情況。結(jié)果顯示，攻毒組貓肺出現(xiàn)明顯的淤血現(xiàn)象，伴隨出血斑點(diǎn)，對(duì)照組貓肺則無(wú)病變現(xiàn)象（圖2B～2C）。熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，在攻毒組貓的氣管和肺檢出核酸陽(yáng)性，其病毒拷貝數(shù)分別為1.7×107和3.5×104 copies·μg－1；經(jīng)過(guò)GraphPad Prism軟件分析，氣管的病毒載量極顯著高于肺組織的病毒載量（Plt;0.000 1，圖2D），口、鼻、眼拭子樣品經(jīng)檢測(cè)，第4天攻毒組貓只的平均病毒載量極顯著高于第2、6和8天攻毒組貓只（Plt;0.000 1、P=0.000 2、Plt;0.000 1），第4天病毒載量最高，為9.05×107 copies·μL－1（圖2E）。

3 討 論

FHV-1是在美國(guó)由Crandell和Maurer從患有呼吸道疾病的幼貓中首次分離出來(lái)，國(guó)內(nèi)則是在2010年首次分離出FHV-1［8］。FHV-1作為引起貓呼吸道疾病的主要傳染病原之一，嚴(yán)重威脅著貓的健康，并且貓?jiān)陔[性感染時(shí)和感染康復(fù)后都會(huì)長(zhǎng)期排毒，成為一個(gè)潛在的傳染源［9］，且有研究表明，貓?jiān)诿庖吡ο陆档臅r(shí)候容易造成二次感染［10］。

全球FHV-1的陽(yáng)性率在7%～63%之間，感染差異較大［11-16］，在我國(guó)FHV-1的陽(yáng)性率為16.3%［17］，本研究中，成都地區(qū)FHV-1的陽(yáng)性率僅為11.8%，相比我國(guó)華東部分地區(qū)的陽(yáng)性率較低（57.8%）［18］，但是高于我國(guó)華南部分地區(qū)FHV-1的陽(yáng)性率（9.8%）［19］；本研究發(fā)現(xiàn)，貓舍的FHV-1陽(yáng)性率相比寵物醫(yī)院高，分析由于在寵物醫(yī)院的采樣群體中，較多進(jìn)行疫苗注射，具有抗體保護(hù)，并且寵物貓的生活環(huán)境大多為獨(dú)居環(huán)境，感染的幾率較低；而貓舍的貓生活環(huán)境多為群居生活，當(dāng)健康貓?jiān)诮佑|到被FHV-1污染的飼料、水源、用具及在相互接觸的同時(shí)容易被感染［20］，因此檢測(cè)出的陽(yáng)性率較高。

本研究通過(guò)CRFK病毒分離及空斑純化，成功分離出1株能穩(wěn)定傳代的FHV-1毒株，命名為PX-9。該毒株與疫苗株Companion相比有3個(gè)氨基酸位點(diǎn)的突變，通過(guò)動(dòng)物回歸試驗(yàn)表明，感染該毒株的貓會(huì)出現(xiàn)打噴嚏、眼鼻分泌物增多等情況，這與黃明［21］報(bào)道相符合；同時(shí)具有較長(zhǎng)時(shí)間的排毒期［22］，此外PX-9毒株會(huì)在呼吸道造成感染，并且具有較強(qiáng)的致病性，可用于當(dāng)下疫苗保護(hù)效果評(píng)價(jià)以及開(kāi)發(fā)新疫苗提供備選毒株。

4 結(jié) 論

本研究調(diào)查了2020—2023年成都地區(qū)FHV-1的流行率，分析了FHV-1 gE基因的遺傳變異情況，并且成功分離出1株FHV-1毒株，命名為PX-9，進(jìn)行動(dòng)物回歸試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PX-9毒株會(huì)造成嚴(yán)重的呼吸道感染。

參考文獻(xiàn)（References）：

［1］ 吳振華，宋立剛，劉殿波.貓上呼吸道感染的診斷與治療［J］.山東畜牧獸醫(yī)，2017，38（2）：26-27.

WU Z H，SONG L G，LIU D B.Diagnosis and treatment of upper respiratory tract infection in cats［J］.Shandong Journal of Animal Science and Veterinary Medicine，2017，38（2）：26-27.（in Chinese）

［2］ 郭嘉寧，謝旻晉，周華波，等.一例貓皰疹病毒感染的病例報(bào)告［J］.云南畜牧獸醫(yī)，2021（6）：27-29.

GUO J N，XIE M J，ZHOU H B，et al.A case report of feline herpes virus infection［J］.Yunnan Journal of Animal Science and Veterinary Medicine，2021（6）：27-29.（in Chinese）

［3］ 孫春艷，錢 鵬，王 潔，等.貓皰疹病毒1型的分離鑒定及gD基因序列分析［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2020，41（3）：30-35.

SUN C Y，QIAN P，WANG J，et al.Isolation and identification of cat Herpesvirus type 1 and sequence analysis of gD gene［J］.Progress in Veterinary Medicine，2020，41（3）：30-35.（in Chinese）

［4］ ROWAN-NASH A D，KORRY B J，MYLONAKIS E，et al.Cross-domain and viral interactions in the microbiome［J］.Microbiol Mol Biol Rev，2019，83（1）：e00044-18.

［5］ KRUGER J M，SUSSMAN M D，MAES R K.Glycoproteins gI and gE of feline herpesvirus-1 are virulence genes：safety and efficacy of a gI-gE- deletion mutant in the natural host［J］.Virology，1996，220（2）：299-308.

［6］ MAEDA K，KAWAGUCHI Y，ONO M，et al.Comparisons among feline Herpesvirus type 1 isolates by immunoblot analysis［J］.J Vet Med Sci，1995，57（1）：147-150.

［7］ 李麗景.西南部分地區(qū)貓皰疹病毒Ⅰ型和貓杯狀病毒感染的分子流行病學(xué)調(diào)查［D］.成都：西南民族大學(xué)，2021.

LI L J.Molecular epidemiological investigation of feline Herpesvirus type I and feline calicivirus infection in parts of southwest China［D］.Chengdu：Southwest Minzu University，2021.（in Chinese）

［8］ 許鑫燕，鄭亞婷，劉 迪，等.一株貓皰疹病毒Ⅰ型的分離與鑒定［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2023，54（4）：1713-1720.

XU X Y，ZHENG Y T，LIU D，et al.Isolation and identification of a feline Herpesvirus-1 strain［J］.Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，2023，54（4）：1713-1720.（in Chinese）

［9］ GASKELL R，DAWSON S，RADFORD A，et al.Feline herpesvirus［J］.Vet Res，2007，38（2）：337-354.

［10］ THIRY E，ADDIE D，BELK S，et al.Feline Herpesvirus infection：ABCD guidelines on prevention and management［J］.J Feline Med Surg，2009，11（7）：547-555.

［11］ RAMPAZZO A，APPINO S，PREGEL P，et al.Prevalence of Chlamydophila felis and feline Herpesvirus 1 in cats with conjunctivitis in northern Italy［J］.J Vet Intern Med，2003，17（6）：799-807.

［12］ WALTER J，F(xiàn)OLEY P，YASON C，et al.Prevalence of feline herpesvirus-1，feline calicivirus，Chlamydia felis，and Bordetella bronchiseptica in a population of shelter cats on Prince Edward Island［J］.Can J Vet Res，2020，84（3）：181-188.

［13］ KANG B T，PARK H M.Prevalence of feline Herpesvirus 1，feline calicivirus and Chlamydophila felis in clinically normal cats at a Korean animal shelter［J］.J Vet Sci，2008，9（2）：207-209.

［14］ CAI Y，F(xiàn)UKUSHI H，KOYASU S，et al.An etiological investigation of domestic cats with conjunctivitis and upper respiratory tract disease in Japan［J］.J Vet Med Sci，2002，64（3）：215-219.

［15］ MAAZI N，JAMSHIDI S，KAYHANI P，et al.Occurrence of Chlamydophila felis，feline Herpesvirus 1 and calcivirus in domestic cats of Iran［J］.Iran J Microbiol，2016，8（5）：312-315.

［16］ NGUYEN D，BARRS V R，KELMAN M，et al.Feline upper respiratory tract infection and disease in Australia［J］.J Feline Med Surg，2019，21（10）：973-978.

［17］ LIU C H，LIU Y X，QIAN P，et al.Molecular and serological investigation of cat viral infectious diseases in China from 2016 to 2019［J］.Transbound Emerg Dis，2020，67（6）：2329-2335.

［18］ 謝畫畫.上海地區(qū)貓皰疹病毒和杯狀病毒感染病例的流行病學(xué)調(diào)查及治療效果評(píng)價(jià)［D］.銀川：寧夏大學(xué)，2021.

XIE H H.Epidemiological investigation and therapeutic effect estimation of feline Herpesvirus and calicivirus infection cases in Shanghai［D］.Yinchuan：Ningxia University，2021.（in Chinese）

［19］ 鐘 雪.廣東地區(qū)貓皰疹病毒感染情況調(diào)查［D］.廣州：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2020.

ZHONG X.Investigation on the infection of feline herpes virus in Guangdong［D］.Guangzhou：South China Agricultural University，2020.（in Chinese）

［20］ 張國(guó)軍，任洪林，楊 舉，等.貓皰疹病毒Ⅰ型HB株的分離鑒定及其免疫原性初步評(píng)價(jià)［J］.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2022，42（5）：879-882，905.

ZHANG G J，REN H L，YANG J，et al.Isolation and identification of type 1 HB strain of feline Herpesvirus and preliminary evaluation of its immunogenicity［J］.Chinese Journal of Veterinary Science，2022，42（5）：879-882，905.（in Chinese）

［21］ 黃 明.貓傳染性鼻氣管炎研究進(jìn)展［J］.山東畜牧獸醫(yī)，2013，34（9）：80-82.

HUANG M.Research Progress of infectious rhinotracheitis in cats［J］.Shandong Journal of Animal Science and Veterinary Medicine，2013，34（9）：80-82.（in Chinese）

［22］ 張 麗，馮向輝，孫 明.貓病毒性鼻氣管炎研究進(jìn)展［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2013（13）：22-24.

ZHANG L，F(xiàn)ENG X H，SUN M.Advances in viral rhinotracheitis in cats［J］.Heilongjiang Animal Science and Veterinary Medicine，2013（13）：22-24.（in Chinese）

（編輯 范子娟）