妊娠期奶牛黃體細(xì)胞的分離鑒定及培養(yǎng)特性

摘 要： 旨在研究妊娠期奶牛黃體細(xì)胞的分離、純化、鑒定及體外培養(yǎng)生物學(xué)特性。本研究通過采集健康荷斯坦奶牛的妊娠期黃體組織，利用Ⅱ型與Ⅳ型膠原酶聯(lián)合消化法分離奶牛黃體細(xì)胞（bovine luteal cells， BLCs），通過Percoll不連續(xù)密度梯度離心法純化獲得高純度的BLCs。運(yùn)用3β-HSD活細(xì)胞染色法、油紅O脂滴染色法鑒定BLCs的純度，借助免疫組織化學(xué)染色法、免疫熒光染色檢測BLCs特異性標(biāo)志物催產(chǎn)素和突觸素。ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中孕酮；G顯帶核型分析BLCs染色體、CCK-8法測定BLC生長曲線和血清依賴性結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分析BLCs的體外培養(yǎng)特性。結(jié)果表明，1）利用膠原酶消化法和Percoll不連續(xù)密度梯度離心法可一次性分離純化獲得大量高純度的BLCs；2）3β-HSD染色、油紅O染色結(jié)果顯示，分離純化所得BLCs細(xì)胞類型均勻，其形態(tài)呈不規(guī)則多邊形的典型上皮細(xì)胞樣，胞核大，胞質(zhì)豐富，有小脂滴彌散分布；3）免疫熒光結(jié)果表明，BLCs可表達(dá)催產(chǎn)素和突觸素等黃體細(xì)胞的特異性標(biāo)志物；4）BLCs培養(yǎng)上清中孕酮的濃度呈時(shí)間依賴性；5）核型分析結(jié)果顯示，黃體細(xì)胞由30對染色體組成，包括29對常染色體和一對XX性染色體，CCK-8及流式結(jié)果顯示，BLCs在體外培養(yǎng)過程中具有穩(wěn)定的增殖活性。綜上所述，本研究成功分離純化獲得具有典型生物學(xué)特性的高純度BLCs，并提供了一套完善的BLCs分離、純化、鑒定及體外培養(yǎng)的方法，可為體外研究黃體的發(fā)育、退化及其功能調(diào)控提供穩(wěn)定的細(xì)胞模型和技術(shù)參考。

關(guān)鍵詞： 奶牛；黃體細(xì)胞；分離培養(yǎng)；生物學(xué)特性

中圖分類號： S852.61

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A""" 文章編號：0366-6964（2024）05-2214-12

收稿日期：2023-08-24

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（32172811；32002242）

作者簡介：費(fèi)國慶（1998-），男，甘肅隴西人，碩士生，主要從事基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)研究，E-mail：fgq10016615@163.com

*通信作者：陳樹林，主要從事基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)研究，E-mail：csl_1359@163.com；陳 鴻， 主要從事基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)研究，E-mail：1356178675@qq.com

Isolation， Identification of Luteal Cells from Cows during Pregnancy and Investigation of Their Culture Characteristics

FEI" Guoqing， NING" Zhiyuan， ZHAO" Zefang， LIU" Yanqiu， LIU" Tengfei， LI" Xian， CONG" Rihua，

CHEN" Hong*， CHEN" Shulin*

（College of Veterinary Medicine， Northwest Agriculture and Forestry University， Yangling 712100，

China）

Abstract：" The aim was to study the isolation， purification， characterization and in vitro culture biological properties of luteal cells from cows during pregnancy. In this study， luteal tissues of healthy Holstein cows during pregnancy were collected， and bovine luteal cells （BLCs） were isolated by type II and type IV collagenase digestion. High-purity BLCs were purified by Percoll discontinuous density gradient centrifugation. The purity of BLCs was identified by 3β-HSD live cell staining and oil red O lipid droplet staining. The specific marker proteins of BLCs， oxytocin and synaptophysin， were detected by immunohistochemical staining and immunofluorescence staining. Progesterone in cell culture supernatant was detected by ELISA. G-banding karyotype analysis of BLCs chromosomes， CCK-8 assay of BLC growth curve and serum-dependent flow cytometry to detect cell cycle analysis of BLCs in vitro culture characteristics. The results showed that： 1） A large number of high-purity BLCs could be obtained by one-time separation and purification using collagenase digestion and Percoll discontinuous density gradient centrifugation. 2） The results of 3β-HSD staining and oil red O staining showed that the isolated and purified BLCs had uniform cell types， and their morphology was typical epithelial cell-like cells with irregular polygons. The nucleus was large， the cytoplasm was rich， and small lipid droplets were dispersed. 3） Immunofluorescence results showed that BLCs could express specific markers of luteal cells such as oxytocin and synaptophysin; 4） The concentration of progesterone in the culture supernatant of BLCs was time-dependent. 5） Karyotype analysis showed that luteal cells were composed of 30 pairs of chromosomes， including 29 pairs of autosomes and a pair of XX sex chromosomes. CCK-8 and flow cytometry results showed that BLCs had stable proliferation activity during in vitro culture. In summary， this study successfully isolated and purified high-purity BLCs with typical biological characteristics， and sorted out a set of scientific and perfect methods for the separation， purification， identification and in vitro culture of BLCs， which can provide a stable cell model and technical reference for the study of luteal development， degeneration and functional regulation in vitro.

Key words： cow; luteal cells; isolation and culture; biological characterization

*Corresponding authors：" CHEN Shulin， E-mail： csl_1359@163.com; CHEN Hong， E-mail： 1356178675@qq.com

黃體（corpus luteum， CL）是雌性哺乳動(dòng)物排卵后由顆粒細(xì)胞、內(nèi)膜細(xì)胞及周圍血管共同形成的一個(gè)動(dòng)態(tài)的暫時(shí)性內(nèi)分泌組織。其主要生理功能由黃體細(xì)胞（luteal cells，LCs）承擔(dān)，通過合成并分泌孕酮（progesterone， P4）、雌激素、不飽和脂肪酸和多肽類激素等，在調(diào)控雌性動(dòng)物發(fā)情、受精卵著床以及妊娠維持等生殖活動(dòng)中發(fā)揮直接作用［1］；在家畜繁殖性能改良，生殖疾病機(jī)理研究等方面有著重要的研究價(jià)值［2］。此外，在體外胚胎生產(chǎn)過程中LCs可作為滋養(yǎng)層細(xì)胞［3］。在牛體外胚胎生產(chǎn)過程中，存在可用胚胎數(shù)量少、發(fā)育率低、妊娠率低等問題［4］。但在牛黃體細(xì)胞（bovine luteal cells， BLCs）與早期胚胎共培養(yǎng)的研究中發(fā)現(xiàn)，BLCs可增強(qiáng)早期胚胎活力，提高胚胎分化率［5］。因此完善且經(jīng)濟(jì)的黃體細(xì)胞分離培養(yǎng)方法或可為優(yōu)化體外胚胎生產(chǎn)提供穩(wěn)定的細(xì)胞模型［6］。但CL中除了LCs外，還包括紅細(xì)胞、成纖維樣細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等多種類型的細(xì)胞［7］，雖然國內(nèi)外有BLCs體外培養(yǎng)成功的案例［8-9］，但缺少系統(tǒng)的BLCs分離純化及鑒定方法為體外研究黃體功能調(diào)控提供高純度均一細(xì)胞群模型［10-11］。

對于體外分離培養(yǎng)原代細(xì)胞，其分離純化方法的簡潔高效，便捷經(jīng)濟(jì)是其應(yīng)用普及的重要因素［12，13］。Percoll是一種適用性廣且操作靈活簡單的低密度梯度分離液，可用來分離細(xì)胞、亞細(xì)胞顆粒，可實(shí)現(xiàn)受損細(xì)胞及其碎片與完整活細(xì)胞的分離［14-15］。優(yōu)化Percoll密度梯度離心法BLCs純化條件可為高效分離純化BLCs，獲得高活力、高純度的BLCs提供重要技術(shù)參考［16-17］。

在LCs鑒定方面，通常將其類固醇合成特性作為鑒定依據(jù)，但大黃體細(xì)胞（large corpus luteum cells， LLCS）、小黃體細(xì)胞（small corpus luteum cells， SLCS）均具有類固醇合成功能，3β-羥基類固醇脫氫酶（3β-hydroxysteroid dehydrogenase， 3β-HSD）染色均為陽性；因此，將能否合成類固醇作為LCs鑒定依據(jù)并不準(zhǔn)確［16］。在先前的研究中發(fā)現(xiàn)，LCs屬于彌散神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞（diffuse neuroendocrine cell， DNES cell）可特異性的表達(dá)OT和SYP，可作為其特異性的鑒定標(biāo)志物［17-18］。

因此，本研究通過探究BLCs體外分離、純化、鑒定及體外培養(yǎng)特性，擬建立一套系統(tǒng)完善的BLCs培養(yǎng)方法。獲得生物學(xué)特征穩(wěn)定、純度高、適用于體外試驗(yàn)研究的BLCs，為CL功能相關(guān)體外研究提供穩(wěn)定的細(xì)胞模型和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞

CL采自西安某奶牛屠宰場，妊娠期的健康荷斯坦奶牛。

1.2 主要試劑及儀器

催產(chǎn)素、突觸素、波形蛋白抗體購自Abcam公司；山羊抗兔594熒光標(biāo)記二抗、山羊抗鼠488熒光標(biāo)記二抗購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；胎牛血清（FBS）、DMEM/F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶均購自Gibco公司；牛孕酮（PROG）ELISA檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；細(xì)胞增殖毒性檢測試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）購自Biosharp公司；RNA提取試劑盒（MicroElute Total RNA Kit）購自O(shè)mega公司；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；油紅O染色試劑盒（細(xì)胞專用）購自索萊寶生物科技有限公司；去氫表雄酮購自賽默飛世爾（中國）有限公司。生物安全柜、CO2培養(yǎng)箱和CountessⅡ自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀均購自Thermo Scientific公司；倒置熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡購自日本Nikon公司；核酸蛋白分析儀購自賽默飛世爾（中國）有限公司；熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司；流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。

1.3 BLCs的分離純化

1.3.1 原代BLCs的分離

屠宰場采集妊娠期荷斯坦奶牛的卵巢組織，預(yù)冷的含2%雙抗的PBS沖洗三次后，保存在預(yù)冷的PBS中，盡快帶回實(shí)驗(yàn)室。在75%乙醇溶液中浸泡1 min，用含雙抗的PBS沖洗3次后轉(zhuǎn)移至超凈臺操作；將組織置于無菌小皿內(nèi)，剝離表面被膜，暴露CL，將CL從卵巢上剝離，取部分組織充分剪碎（組織塊體積≤1 mm3），用含雙抗的PBS清洗至上清澄清。將剪碎的組織轉(zhuǎn)移到15 mL無菌離心管中，用完全培養(yǎng)基配制含2 mg·mL-1 Ⅱ型膠原酶溶液和0.5 mg·mL-1 Ⅳ型膠原酶的組織消化液；V（消化液）∶V（組織）=10∶1，在37 ℃條件下消化1 h。待組織分散后用200 目細(xì)胞濾網(wǎng)過濾，收集細(xì)胞懸液于新的離心管中，1 000 r·min-1離心5 min，收集細(xì)胞沉淀，用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，用于下一步細(xì)胞純化。

1.3.2 BLCs的純化

制備不同密度的 Percoll 分離液（20%、30%、35%、37.5%、40%共5個(gè)密度），按密度由高到低的次序，依次向15mL離心管中加入Percoll分離液各2mL，在最上層加入2 mL細(xì)胞懸液后，1 000 r·min-1離心30 min。離心后可見細(xì)胞分層，收集各液相間的細(xì)胞懸液于新的離心管中，加入10倍體積的完全培養(yǎng)基，混勻后，1 000 r·min-1離心5min，棄去上清，重復(fù)上述步驟2次。加入適量完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106·mL-1，接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，在37 ℃，5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后更換培養(yǎng)液。

1.4 BLCs的鑒定

1.4.1 3β-HSD活細(xì)胞染色

取P3代BLCs接種到35 mm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞密度約80%時(shí)，除去細(xì)胞培養(yǎng)液，用 PBS 漂洗2次，加入 1 mL 3β-HSD染液（3β-HSD 活性染液：1.0 mg·mL-1 氯化硝基藍(lán)四唑150 μL，3.0 mg·mL-1 NAD 120 μL，10 mmol 去氫表雄酮50 μL，1.6 mg·mL-1 煙酰胺100 μL，0.01 mol·L-1 PBS 580 μL（pH=7.4）緩沖液，配制為1 mL溶液），置于培養(yǎng)箱中孵育4 h后，棄去染液，PBS清洗2 次后，加入1 mL 4%的多聚甲醛固定 20 min，用 PBS 清洗兩次，倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.4.2 油紅O脂滴染色

BLCs接種于35 mm培養(yǎng)皿，細(xì)胞密度達(dá)到 80%時(shí)，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用 PBS 緩沖液清洗 3 次，加 4%的多聚甲醛固定20 min，PBS 洗3次；異丙醇脫水5 min；油紅 O 染色30 min；異丙醇脫色30 s，PBS 漂洗2次，倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.4.3 P4合成相關(guān)基因引物合成及q-PCR檢測

參照NCBI數(shù)據(jù)庫中公布的STAR、3β-HSD、CYP11A1、PTGFR、FGG和GAPDH基因序列，利用NCBI系統(tǒng)Primer 引物設(shè)計(jì)程序設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，以GAPDH為內(nèi)參基因，引物序列見表1。引物均由北京擎科生物科技有限公司合成。

首先使用 RNA提取試劑盒提取細(xì)胞的總RNA，接著利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成對應(yīng)cDNA，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于-20 ℃保存?zhèn)溆?。以反轉(zhuǎn)的cDNA為模板，在q-PCR管中依次加入cDNA模板2 μＬ、2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix 5 μＬ、上下游引物各0.25 μＬ，用ddH2O補(bǔ)齊為10 μL反應(yīng)體系。在q-PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃ 預(yù)變性30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，最后95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。試驗(yàn)重復(fù) 3 次，用2-ΔΔCt法計(jì)算 STAR、3β-HSD、CYP11A1、PTGFR、FGG基因的相對表達(dá)量。

1.4.4 BLCs中OT、SYP表達(dá)與定位

免疫組織化學(xué)檢測CL組織中催產(chǎn)素（oxytocin， OT）、突觸素（synaptophysin， SYP）表達(dá)。黃體組織石蠟切片經(jīng)二甲苯Ⅰ脫蠟處理5 min、二甲苯Ⅱ處理5 min；無水乙醇Ⅰ處理2 min、無水乙醇Ⅱ處理5 min，依次在95%、85%、75%的乙醇和雙蒸水處理2 min；3% H2O2處理3 min，ddH2O清洗3 次，每次2 min；加入0.01 mol·mL-1檸檬酸鈉緩沖液修復(fù)10 min，PBS液洗滌5 min，清洗2 次；室溫下用0.3% Triton-X-100處理15 min，同上用PBS清洗2次；在室溫下用5% BSA封閉30 min，擦干多余水分孵育抗體；分別加入OT和SYP抗體于組織上，于濕盒內(nèi)4 ℃孵育12 h，用PBS充分洗滌3 次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，PBS洗滌3次；DAB顯色后，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，切片重新脫水封片，在顯微鏡下觀察CL組織中OT、SYP蛋白表達(dá)情況。陰性對照組用PBS緩沖液代替一抗，其余操作步驟同試驗(yàn)組一致。

免疫熒光檢測BLCs中OT、SYP表達(dá)。用激光共聚焦小皿培養(yǎng)BLCs，細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)，棄掉舊培養(yǎng)液，PBS漂洗2 遍，1mL多聚甲醛固定15 min，用PBS液清洗3次，每次5 min；加入0.3% Triton-x-100通透細(xì)胞膜30 min，用PBS清洗3次；加5% BSA 室溫下封閉1 h，用吸水紙吸干，加入OT和SYP抗體，4 ℃孵育過夜；孵育結(jié)束后，用PBS清洗3 遍，黑暗條件下加入熒光二抗孵育1 h，同上操作PBS清洗，DAPI染核5 min，PBS清洗殘留染液。激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞中OT和SYP蛋白的表達(dá)情況。

1.5 BLCs體外培養(yǎng)特性

1.5.1 ELISA測定細(xì)胞上清中P4含量

BLCs接種24 孔板培養(yǎng)，在細(xì)胞匯合度約為60%時(shí)更換培養(yǎng)液，定時(shí)收集上清，每個(gè)時(shí)間設(shè)置3 個(gè)重復(fù)孔，3 000 r·min-1離心10 min，0.45 μm的濾器過濾后，收集上清，按照上海酶聯(lián)生物有限公司的（PROG）ELISA檢測盒說明書要求測定不同時(shí)間段培養(yǎng)上清中P4的濃度。

1.5.2 Gmisa-染色體核型分析

消化重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106·mL-1接種至60 mm培養(yǎng)皿中，24 h后，加入含有0.1 μg·mL-1秋水仙素堿的完全培養(yǎng)液，處理6h后。將細(xì)胞收集到15 mL EP離心管中，用預(yù)熱過的0.075 mol·L-1 氯化鉀吹打重懸，放入37℃靜置30 min。棄去氯化鉀，加入1 mL固定液（V（甲醇）∶V（乙酸）=3∶1，現(xiàn)用現(xiàn)配），1 500 r·min-1離心5 min。棄上清液，緩慢加入固定液邊加入邊震蕩，1 500 r·min-1離心5min。棄上清液，緩慢加入固定液邊加入邊震蕩，靜置15 min，1 500 r·min-1離心5 min，棄上清液。加固定液重懸細(xì)胞后，將玻片從冰水浴中拿出，吸取重懸液從50 cm高處滴下一滴，在酒精燈上過火烤片。待玻片晾干后，使用10 g·L-1的Giemsa染液染色15 min，蒸餾水沖洗至無浮色，甘油明膠封片后顯微鏡下觀察。

1.5.3 CCK-8 法測定BLCs生長曲線和血清依賴性

BLCs消化重懸，調(diào)整細(xì)胞密度，以1×104·孔-1接種于 96 孔板，每組5 個(gè)重復(fù)孔，預(yù)培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)液，同時(shí)每孔加入10 μL CCK-8增強(qiáng)型溶液，培養(yǎng)箱孵育，每隔24 h用酶標(biāo)儀測定一次OD450 nm值，連續(xù)監(jiān)測8 d，繪制生長曲線。

BLCs消化重懸，調(diào)整細(xì)胞密度，以1×104·孔-1接種于96孔板，每組5個(gè)重復(fù)孔，設(shè)置兩個(gè)重復(fù)組，預(yù)培養(yǎng)24 h后，更換培養(yǎng)液為DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基，饑餓處理6 h后，將培養(yǎng)液更換為含不同濃度FBS的完全培養(yǎng)基（0、5%、10%、15%、20%），培養(yǎng)24 h后測定OD450 nm值。

1.5.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期

P1與P5代BLCs消化重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度約1×105·mL-1，接種6孔細(xì)胞培養(yǎng)板48h后，消化收集細(xì)胞，PBS 洗滌2 次，徹底棄去上清，緩慢加入1 mL DNA Staining solution和10 μL PI染液，振蕩混勻后避光染色30 min，200 目細(xì)胞篩過濾，流式細(xì)胞儀在 488 nm 激發(fā)波長下計(jì)數(shù)15 000個(gè)細(xì)胞，流式數(shù)據(jù)分析。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用 SPSS 9.0 軟件的單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，用t檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較，使用GraphPad Prism 9.0 軟件繪圖；通過 FlowJo 10.8.1 軟件分析流式數(shù)據(jù)；數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x-±s）”表示，Plt;0.05 表示差異顯著；Plt;0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 BLCs分選及形態(tài)特征

牛的妊娠期CL明顯突出于卵巢表面，約占卵巢整體的3/4，外觀呈紅褐色，有大量血管分布；正中剖開可見，黃體組織呈橘紅色，有結(jié)締組織穿插其中，從中心向周圍輻射（圖1a）。組織切片觀察可見，妊娠期CL主要由LCs和大量的血管與結(jié)締組織構(gòu)成，主要的功能細(xì)胞群以LLCs占比最多；LCs具有體積大，顏色淡，胞核高度分化和細(xì)胞質(zhì)豐富的典型特征（圖1b）。

Percoll不連續(xù)密度梯度離心純化后，可在各液相層富集到不同類型的細(xì)胞群，0～20%液相層主要富集紅細(xì)胞及消化的組織間質(zhì)（圖2a）；20%～30%液相層以碎裂的細(xì)胞及其胞核為主（圖2b）；30%～35%液相層以小黃體細(xì)胞為主（圖2c）；35%～37.5%間摻雜有大量的成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞（圖2d）；37.5%～40%的液相層主要富集高純度的黃體細(xì)胞，在顯微鏡下可見相較于其他細(xì)胞體積明顯偏大的球形細(xì)胞（圖2e），而管底沉淀以黏連細(xì)胞碎片和percoll中的雜質(zhì)為主（圖2f）。

分離所得BLCs在培養(yǎng)48 h時(shí)細(xì)胞已經(jīng)貼壁伸展（圖3b），72h后細(xì)胞狀態(tài)良好，鏡下可見BLCs呈不規(guī)則多邊形或梭形的典型上皮細(xì)胞形態(tài)，胞核大，胞漿豐富（圖3c）；培養(yǎng)至第5天時(shí)細(xì)胞單層分布，鋪滿瓶底（圖3d）。

2.2 BLCs的鑒定

2.2.1 3β-HSD在BLCs中的分布

3β-HSD是類固醇細(xì)胞的標(biāo)志物，通常附著于滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，與染液結(jié)合后呈現(xiàn)藍(lán)紫色。對分離的BLCs進(jìn)行活細(xì)胞染色，鏡下觀察可見，細(xì)胞核未染色呈透明，藍(lán)色" 主要富集于細(xì)胞的核周胞質(zhì)；分離所得BLCs形態(tài)均一，陽性細(xì)胞率約95%（圖4a）。

2.2.2 脂滴在BLCs中的分布

脂滴在類固醇合成的細(xì)胞中參與多種生物學(xué)過程，是類固醇生成細(xì)胞的標(biāo)志物之一。油紅O染色結(jié)果顯示，脂滴在BLCs中主要分布于細(xì)胞質(zhì)中，呈彌散性細(xì)小顆粒狀，數(shù)量豐富（圖4b）。

2.2.3 OT和SYP在BLCs中的分布

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，OT和SYP在黃體組織中其表達(dá)與分布具有特異性，主要分布在大LCs中，可作為體外培養(yǎng)BLCs的鑒定依據(jù)（圖5）。免疫熒光結(jié)果表明，OT和SYP在BLCs中均有表達(dá)，OT主要分布在細(xì)胞膜和核周胞質(zhì)，穿插于細(xì)胞骨架間，但表達(dá)量較低；而SYP分布在細(xì)胞核周胞質(zhì)和胞膜上（圖6）。

2.3 BLCs體外培養(yǎng)特性

2.3.1 BLCs體外培養(yǎng)過程中P4合成能力的測定

ELISA檢測結(jié)果顯示，BLCs在體外培養(yǎng)過程中可以持續(xù)穩(wěn)定的分泌P4，且上清中P4濃度具有時(shí)間依賴性。在更換培養(yǎng)基后的9 h內(nèi)細(xì)胞P4分泌旺盛，之后維持在相對穩(wěn)定的一個(gè)水平，BLCs的P4分泌能力，即是鑒定依據(jù)，但更是其體外培養(yǎng)的關(guān)鍵功能指標(biāo)（圖7a）。

q-PCR檢測P1和P5代BLCs中P4合成過程中的關(guān)鍵基因：STAR、3β-HSD、CYP11A1、PTGFR、FGG在BLCs內(nèi)的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，在P1和P5代BLCs中可檢測到P4合成關(guān)鍵基因的特異性檢測片段，且表達(dá)水平無差異；即在體外培養(yǎng)過程中，BLCs可穩(wěn)定合成P4，其主要生物學(xué)特性并不因離體培養(yǎng)而受到影響（圖7b）。

2.3.2 BLCs生長曲線、細(xì)胞周期及血清依賴性

連續(xù)監(jiān)測記錄BLCs的生長曲線，在接種24 h后細(xì)胞增殖速度較快，呈線性增長，細(xì)胞處于對數(shù)生長期，第7天后細(xì)胞生長曲線平緩，生長進(jìn)入平臺期（圖8a）。

流式細(xì)胞術(shù)檢測P1與P5代BLCs的細(xì)胞周期，在相同處理?xiàng)l件下P1與P5代細(xì)胞相比較，P5代細(xì)胞處于G1、 G2期細(xì)胞數(shù)少，更多的處于S期。（圖8b、c）。

BLCs在體外時(shí)，需要FBS的營養(yǎng)支持，呈濃度依賴性。不同濃度FBS條件下，與無血清組相比較5%、10%、15%、20%均可顯著提高細(xì)胞活力（Plt;0.01）;而15%與20%的血清間細(xì)胞活性無差異（Pgt;0.05）（圖8d）。

2.3.3 BLCs的核型分析

將分裂中期的BLCs固定，分析其染色體核型。結(jié)果顯示，BLCs有30對染色體，由29對常染色體和一對XX性染色體構(gòu)成，核型與正常奶牛細(xì)胞核型一致（圖8e）。

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，妊娠CL比周期CL體積更大，P4分泌能力更強(qiáng)；體外培養(yǎng)的妊娠期黃體細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖能力［19］。因此本研究選取妊娠期健康中國荷斯坦奶牛，采集其CL組織用于BLCs的體外分離培養(yǎng)。

細(xì)胞的分離方法主要有組織塊培養(yǎng)法和酶消化法，兩者各有其優(yōu)缺點(diǎn)［20］。組織塊培養(yǎng)法操作簡單但耗時(shí)長、效率低，酶消化培養(yǎng)法則是利用膠原酶消化掉細(xì)胞周圍基質(zhì)分離出細(xì)胞，可以一次獲得數(shù)量較多、雜質(zhì)較少的細(xì)胞，有利于后續(xù)研究［21］。BLCs作為終末分化細(xì)胞，敏感性高且損傷修復(fù)能力差，相較于胰酶，膠原酶消化法對細(xì)胞的損傷更小是分離BLCs的更優(yōu)選擇［22-24］。已有研究證明膠原酶Ⅱ型對間質(zhì)細(xì)胞分離效果明顯，膠原酶Ⅳ型對上皮樣細(xì)胞分離效果更顯著［25］。本研究在細(xì)胞的分離過程中嘗試了組織塊培養(yǎng)法、胰蛋白酶冷消化法、及Ⅱ型和Ⅳ型膠原酶混合消化法，結(jié)合呂嘉順等［22］研究發(fā)現(xiàn)，Ⅱ型和Ⅳ型膠原酶混合消化可在最短時(shí)間內(nèi)獲得更多高活力的原代BLCs［26］。

CL組織中除了LCs外，還有多種其他類型的細(xì)胞。因此，選擇恰當(dāng)?shù)募?xì)胞純化方法，可提供均一的細(xì)胞類型［27］?，F(xiàn)用于純化LCs的方法主要有淘洗法、自然沉降法和密度梯度離心法［28］，此外還有免疫磁珠法、差速貼壁法和差速消化排除法等新興技術(shù)［29］。淘洗法和免疫磁珠法雖然能得到數(shù)量較多、純度較高的黃體細(xì)胞，但需要特殊的儀器設(shè)備操作［30］；自然沉降法對設(shè)備要求低，但耗時(shí)長；至于差速貼壁法和消化排除法對操作人員水平要求高，耗時(shí)長，目前還沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，純化的細(xì)胞效果各異［31］；而Percoll密度梯度離心法無設(shè)備要求、省時(shí)、省力，并且Percoll作為離心基質(zhì)材料無毒害性易形成比色帶，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞分離純化研究中［31］。本試驗(yàn)通過結(jié)合先前的研究，比較各液相層間的細(xì)胞群，發(fā)現(xiàn)BLCs主要分布于37.5%～40.0%Percoll分離液層間，而其他的雜細(xì)胞及細(xì)胞碎片則分布于其他的液相中；可簡便高效純化到活力較好的BLCs。

細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)和生物學(xué)特征常作為細(xì)胞的鑒定依據(jù)。但由于體外培養(yǎng)時(shí)貼壁生長的細(xì)胞完全伸展，且易受到外界因素影響，很難維持典型的細(xì)胞特征性形態(tài)，因此通過分子生物學(xué)手段鑒定細(xì)胞內(nèi)特異基因、蛋白的表達(dá)情況成為常用的細(xì)胞鑒定方式［32］。

膽固醇是合成類固醇激素的前體物質(zhì)，定位于滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的3β-HSD能夠催化膽固醇轉(zhuǎn)化為P4，在整個(gè)黃體化過程中穩(wěn)定表達(dá)［28］，是用于鑒定LCs的一種經(jīng)典標(biāo)志物。但盧習(xí)［16］用q-PCR檢測山羊黃體細(xì)胞、卵巢顆粒細(xì)胞和卵巢間質(zhì)細(xì)胞中3β-HSD的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，3β-HSD mRNA在3種細(xì)胞中有著不同程度的表達(dá)，由此可見僅依靠3β-HSD鑒定BLCs并不可靠，需要從多維度對BLCs進(jìn)行鑒定［33］。同時(shí)，LLCs和SLCs含有不同程度的脂滴，由于維持妊娠需要較高濃度的P4，LCs合成分泌功能旺盛，不斷將膽固醇轉(zhuǎn)化為類固醇激素，所以在妊娠前期LCs中脂滴數(shù)量較少，隨著妊娠時(shí)間增長，LCs中的脂滴數(shù)量增加，功能不斷增強(qiáng)［29］。利用油紅O脂肪染色法檢測細(xì)胞中的脂滴，依據(jù)脂滴的含量及形態(tài)可對LCs的類固醇合成功能進(jìn)行評估［30］。

現(xiàn)有研究已證實(shí)BLCs屬于DNES細(xì)胞，能夠合成4種經(jīng)典神經(jīng)內(nèi)分泌物質(zhì)［31-32］。通過免疫組化雙重酶標(biāo)染色對牛周期CL中的OT免疫反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行定位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CL中的OT主要由大黃體細(xì)胞產(chǎn)生，同下丘腦產(chǎn)生的OT共同調(diào)節(jié)子宮和CL組織的活動(dòng)［15，34］。因此，本研究發(fā)現(xiàn)對OT和SYP的免疫定位，可作為一種較準(zhǔn)確的區(qū)分BLCs與其他細(xì)胞的方法。

CL的主要生理功能是合成P4調(diào)控生殖周期［33］；在妊娠期，CL會合成分泌大量P4以維持妊娠狀態(tài)、保障受精卵成功附植并正常生長發(fā)育，因此P4的合成分泌能力是評估BLCs的關(guān)鍵功能指標(biāo)［35-36］。本研究發(fā)現(xiàn)，妊娠期BLCs在體外培養(yǎng)過程中可高效分泌P4，并隨著時(shí)間的推移，培養(yǎng)基中的P4濃度趨向于維持在相對恒定的水平。但其體外的增殖能力隨著體外培養(yǎng)代數(shù)的增加，而逐漸減弱，很難將其在體外培養(yǎng)超過10代。唐駿啟［37］在體外分離培養(yǎng)BLCs和大鼠LCs過程中發(fā)現(xiàn)，BLCs的增殖能力明顯弱于大鼠LCs，且BLCS無端粒酶活性，這可能是BLCs體外增殖能力較弱的重要原因。另外，在牛細(xì)胞高效永生化的研究中發(fā)現(xiàn)，不同物種的同種細(xì)胞的端粒長度不同，增殖能力也存在明顯差異。這提示LCs的體外增殖能力存在物種間的差異［38-39］。

4 結(jié) 論

本研究利用Ⅱ型和Ⅳ型膠原酶聯(lián)合消化法結(jié)合Percoll不連續(xù)密度梯度離心，成功分離純化獲得純度較高的BLCs；利用3β-HSD染色、油紅O染色及免疫熒光染色觀察BLCs細(xì)胞形態(tài)及特征性標(biāo)志物OT、SYP的表達(dá)與分布；檢測BLCs 的P4合成分泌能力；并對BLCs體外培養(yǎng)條件進(jìn)行補(bǔ)充完善；建立了一套科學(xué)系統(tǒng)、便捷經(jīng)濟(jì)的BLCs分離純化、鑒定培養(yǎng)的方法。

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（編輯 白永平）