PEDV、PoRVA和PDCoV TaqMan三重RT-qPCR檢測方法的建立與初步應(yīng)用

摘 要： 旨在建立一種可快速同時檢測豬流行性腹瀉病毒 （porcine epidemic diarrhea virus， PEDV）、豬A群輪狀病毒 （porcine rotavirus type A， PoRVA） 和豬丁型冠狀病毒 （porcine deltacoronavirus， PDCoV） 三重?zé)晒舛縋CR方法。針對PEDV-N、PoRVA-VP6和PDCoV-M基因設(shè)計了引物和探針，條件優(yōu)化后進(jìn)行性能評估，并與商品化試劑盒檢測對比。結(jié)果顯示：本研究建立的三重RT-qPCR方法具有良好特異性，對PRRSV、PCV2和PRV等陽性核酸不發(fā)生擴增；具有較高的敏感性，PEDV、PoRVA和PDCoV的最低檢測限均達(dá)1 copies·μL-1；重復(fù)性良好，組內(nèi)和組間變異系數(shù)均小于1%；樣本適應(yīng)性廣，檢測不同樣本類型時，變異系數(shù)均小于1%。與商品化試劑盒對比，本研究建立的方法PEDV和PoRVA的檢測符合率為92.5%和97.5%，并對PDCoV的檢測范圍更廣，對其變異毒株仍有較好的檢測效果。本研究建立的檢測方法具有特異性好、敏感性高、穩(wěn)定性強和樣本適應(yīng)性廣等優(yōu)勢，為臨床腹瀉樣本提供了一種好的檢測方法。

關(guān)鍵詞： 豬流行性腹瀉病毒；豬A群輪狀病毒；豬丁型冠狀病毒；三重RT-qPCR

中圖分類號：S858.285.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A""" 文章編號：0366-6964（2024）05-2267-06

收稿日期：2023-07-20

基金項目：湖南省重點研發(fā)計劃項目（2023NK2017）;云南省重大科技專項計劃（202202AE090032）; 湖南省教育廳重點項目（21A0125）；湖南省普通高等學(xué)?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊支持計劃資助

作者簡介：胡澤奇（2000-），男，湖南漣源人，碩士生，主要從事動物疫病診斷及防控研究，E-mail：2878815126@qq.com

*通信作者：李 榮，主要從事規(guī)?；i場管理與疫病防控，E-mail：120547112@qq.com; 葛 猛，主要從事動物疫病診斷及防控研究，E-mail：gmg02@126.com

Establishment and Preliminary Application of PEDV， PoRVA and PDCoV TaqMan Triple RT-qPCR Assay

HU" Zeqi1， LI" Runcheng1， TAN" Zuming3， XIE" Xiuyan1， WANG" Jiangping2， QIN" Lejuan2，

LI" Rong2*， GE" Meng1*

（1.College of Veterinary Medicine， Hunan Agricultural University， Changsha 410000，" China;

2.Hunan Longhua Agriculture and Animal Husbandry Development Co.， LTD， Chaling 412400，

China;

3.Chaling County Livestock and Aquatic Affairs Center， Chaling 412400，" China）

Abstract：" This paper aims to establish a triple fluorescence quantitative PCR method for the simultaneous detection of porcine epidemic diarrhea virus （PEDV）， porcine rotavirus type A （PoRVA） and porcine deltacoronavirus （PDCoV）. Primers and probes were designed for PEDV-N gene， PoRVA-VP6 gene and PDCoV-M gene， and their performance was evaluated after the conditions were optimized， and compared with commercial kits. The results showed that the triple RT-qPCR method established in this study had good specificity and did not amplify positive nucleic acids such as PRRSV， PCV2 and PRV. The detection limits of PEDV， PoRVA and PDCoV were all 1 copies·μL-1. The coefficient of variation within and between groups was less than 1%. The sample has wide adaptability， and the coefficient of variation is less than 1% when different sample types are detected. Compared with commercial kits， the detection coincidence rates of PEDV and PoRVA were 92.5% and 97.5%， and the detection range of PDCoV was wider， and the detection effect of PDCoV variant strains was still good. The detection method established in this study has the advantages of good specificity， high sensitivity， strong stability and wide sample adaptability， which provides a good detection method for clinical diarrhea samples.

Key words： porcine epidemic diarrhea virus; porcine rotavirus type A; porcine deltacoronavirus; triple RT-qPCR

*Corresponding authors：" LI Rong， E-mail： 120547112@qq.com; GE Meng， E-mail： gmg02@126.com

豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus， PEDV）、豬A群輪狀病毒 （porcine rotavirus type A， PoRVA） 和豬丁型冠狀病毒 （porcine deltacoronavirus， PDCoV） 為三種常見導(dǎo)致豬群腹瀉的病毒，臨床上癥狀極其相似，很難判斷豬群感染的病毒種類［1-3］。本研究擬建立出一種RT-qPCR檢測方法，可用于同時快速檢測豬群腹瀉的三種病毒，并為其他檢測方法的研究提供一定的參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

豬瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）疫苗毒（C株）、PEDV、豬偽狂犬病病毒 （pseudorabies virus，PRV） 等均由湖南龍華農(nóng)牧發(fā)展有限公司研發(fā)中心保存。臨床樣本均從湖南省某腹瀉養(yǎng)豬場內(nèi)采集。

1.2 主要儀器和試劑

全自動醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)（SLAN-96P）購自上海宏石醫(yī)療科技有限公司；TOROIVD Probe 1-step RT-RT-qPCR 5G kit3.0購自天羅診斷科技江蘇有限公司；MagaBio plus 病毒DNA/RNA純化試劑盒IV（BSC94S1EX-A）、BioRT Master One Step RT-PCR Kit試劑盒和全自動核酸提取純化儀均購自杭州博日科技股份有限公司。

1.3 引物探針設(shè)計與合成

在GenBank網(wǎng)站中下載PEDV-N、PoRVA-VP6和PDCoV-M基因序列。應(yīng)用Primer 5.0及Oligo7軟件設(shè)計特異性引物與探針。引物與探針均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的制備

使用表1中PCR引物擴增，純化并鑒定為目的片段后，根據(jù)說明書構(gòu)建成重組質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)入到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽性克隆菌，提取重組質(zhì)粒并測定其濃度，同時換算成拷貝數(shù)備用。

1.5 方法條件優(yōu)化及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

對引物探針濃度及退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。選取101～107 copies·μL-1的混合質(zhì)粒擴增，將拷貝數(shù)以10為底的對數(shù)與檢測的Ct值為橫縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算擴增效率和相關(guān)系數(shù)。

1.6 方法性能評估

1.6.1 特異性和敏感性試驗

用本方法對PEDV、PoRVA和PRRSV等進(jìn)行擴增，判斷該方法特異性。對稀釋的10-1～106 copies·μL-1的混合質(zhì)粒進(jìn)行擴增，每個濃度質(zhì)粒重復(fù)4個孔，參考Bustin 等［4］的研究，檢出率95%以上的最低濃度為最低檢測限，即敏感性。

1.6.2 重復(fù)性和樣本適應(yīng)性試驗

對高、中、低濃度質(zhì)粒擴增，每個濃度重復(fù)3孔，進(jìn)行組內(nèi)重復(fù)試驗；分3個不同時間段重復(fù)上述操作，進(jìn)行組間重復(fù)試驗。從拭子樣、泥土樣、飼料樣、組織樣和血清樣等幾種常見的陰性臨床樣本提取的核酸同等比例混合陽性核酸后進(jìn)行檢測并判斷樣本適應(yīng)性。

1.6.3 穩(wěn)定性試驗

于25℃（不避光）、25 ℃（避光）、4 ℃和-20 ℃各保存7 d；于-20℃和室溫凍融次數(shù)5和10次，檢測時現(xiàn)配體系為對照組。對同一質(zhì)粒進(jìn)行擴增，判斷該方法穩(wěn)定性。

1.7 與商品化試劑盒對比檢測

用本方法與單重商品化試劑盒對比檢測不同含量的PEDV、PoRVA和PDCoV的核酸，以評估該方法與商品化試劑盒的差異，每種項目各檢測40份，合計120份。

1.8 檢測方法的初步應(yīng)用

將在湖南省某規(guī)?；诎l(fā)生腹瀉的養(yǎng)豬場內(nèi)采集的40份豬群肛門拭子樣和40份欄舍環(huán)境樣進(jìn)行檢測，并統(tǒng)計各病原的陽性率及混合感染情況等。

2 結(jié) 果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的制備

測定制備成功的質(zhì)粒濃度后根據(jù)拷貝數(shù)計算公式［5］ ：DNA拷貝數(shù)=［6.02×1014×DNA濃度（ng·μL-1）］/目的基因組的分子量，目的基因組分子量=堿基數(shù)×324。計算出PEDV、PoRVA和PDCoV的拷貝數(shù)分別為6.15×1010、7.47×1010 和7.05×1010 copies·μL-1。

2.2 方法條件優(yōu)化

對PEDV、PoRVA和PDCoV的引物探針濃度、退火溫度等條件進(jìn)行優(yōu)化，確定了本方法的最佳反應(yīng)條件：2×5G RT-qPCR Buffer GB 12.5 μL；RT-qPCR Enzyme MIX UD 1. 3μL；PEDV正反向引物終濃度為0.2 μmol·L-1、探針終濃度為0.05 μmol·L-1，PoRVA正反向引物終濃度為0.4 μmol·L-1、探針終濃度為0.03 μmol·L-1，PDCoV正反向引物終濃度為0.6 μmol·L-1、探針終濃度為0.01 μmol·L-1；模板5 μL，ddH2O補充至25 μL。最佳反應(yīng)條件：37℃ 2 min；52℃ 5 min；95℃ 1 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s（此階段收集熒光），45個循環(huán)；25℃ 10 s。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

PEDV的回歸方程為y1=-3.27x+36.005（R2=0.9999，E=102.21%），PoRVA為y2=-3.442x+37.041（R2=0.999 9，E=95.21%），PDCoV為y3=-3.1445x+34.424（R2=0.9998，E=107.98%），回歸方程相關(guān)系數(shù)R2均高于0.999，擴增效率E均為90%～110%，說明建立的三重RT-qPCR方法擴增較為理想。

2.4 方法性能的評估

2.4.1 特異性和敏感性試驗

如圖1，本方法僅PEDV、PoRVA、PDCoV有特異性“S型”擴增曲線和Ct值，其他均為陰性。4個重復(fù)中，PEDV檢出率為95%以上的最低濃度為 1 copies·μL-1，因此最低檢測限為1 copies·μL-1。同理，PoRVA和PDCoV的最低檢測限均為1 copies·μL-1。說明本研究方法特異性較好，敏感性較高。

2.4.2 重復(fù)性和樣本適應(yīng)性試驗

對不同濃度的質(zhì)粒進(jìn)行擴增，并重復(fù)3孔，結(jié)果PEDV、PoRVA和PDCoV組內(nèi)變異系數(shù)為0.11%～0.43%，組間變異系數(shù)為0.12%～0.70%，均小于1%。檢測拭子、泥土、飼料等不同類型樣本，變異系數(shù)小于1%。說明本方法重復(fù)性和樣本適應(yīng)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗

將建立的三重RT-qPCR方法全混后于不同條件下進(jìn)行試驗，如表2，本方法在-20℃保存7 d及凍融5和10次均有較高的檢測水平，穩(wěn)定性較好。

2.5 與商品化試劑盒對比檢測

本方法PEDV和PoRVA與商品化試劑盒的檢測符合率為92.5%和97.5%，多檢出了3份PEDV和1份PoRVA臨界值的陽性樣本；用另一方法對本方法多檢出的5份PDCoV樣本進(jìn)行檢測，結(jié)果也為陽性且病原含量較高，說明本方法對PDCoV毒株檢測范圍更廣。

2.6 檢測方法的初步應(yīng)用

80份臨床樣本均未檢測到PDCoV。40份拭子樣，70%（28份）為PEDV陽性，17.5%（7份）為PoRVA陽性，兩種病毒混合感染占10%（4份）。40份環(huán)境樣，55%（22份）為PEDV陽性，2.5%（1份）為PoRVA陽性。說明該豬場豬群腹瀉主要是由PEDV導(dǎo)致的，同時伴隨了少量的PoRVA混合感染。

3 討 論

“預(yù)防為主”是疾病防治的合理措施，具備敏感性高、特異性好、檢測穩(wěn)定和檢測周期時間短的一種檢測方法更有利于疾病的早期診斷及預(yù)防。本研究針對在不同毒株間具有較好保守性［6-8］的PEDV N基因、PoRVA VP6基因和PDCoV M基因設(shè)計引物和探針，建立的方法敏感性較高，對PEDV、PoRVA和PDCoV的最低檢測限均達(dá)到1 copies·μL-1，相比施開創(chuàng)等［9］和高藝祥等［10］根據(jù)PEDV N基因、PoRVA VP6基因和PDCoV M基因建立的多重RT-qPCR方法敏感性有較大進(jìn)步且檢測的基因區(qū)間存在差異。同時，本研究還做了更為全面的方法評測，進(jìn)行了特異性試驗、重復(fù)性試驗、樣本適應(yīng)性試驗和穩(wěn)定性試驗，均表現(xiàn)良好。據(jù)孫博覽［11］的研究，目前國內(nèi)PDCoV的M基因在一定程度上有所變異。相比于某些早期研發(fā)的商品化試劑盒，本研究PDCoV項目保守性更強，對本次采集的變異毒株有較好的檢測水平，在一定程度上減少了PDCoV的漏檢情況，對變異毒株的檢測方法進(jìn)行了實時更進(jìn)與優(yōu)化。用本方法檢測了40份臨床腹瀉豬只的肛門拭子樣，其中PEDV陽性率為70%，PoRVA陽性率為17.5%，未檢測到PDCoV，說明目前本次臨床案例導(dǎo)致豬群腹瀉的最主要病毒性疾病為PED。在檢測的40份欄舍環(huán)境樣中，PEDV陽性率為55%，對環(huán)境進(jìn)行徹底的消毒處理，對于該病毒的防控具有非常重要的意義。

4 結(jié) 論

本研究成功建立了一種可同時快速檢測PEDV、PoRVA和PDCoV的TaqMan三重RT-qPCR方法，具有敏感性高、特異性好、穩(wěn)定性強和檢測時間短（僅需1.5 h）等優(yōu)勢，為臨床腹瀉樣本的檢測提供了一種方法，也為檢測方法的研究提供了一定的參考。

參考文獻(xiàn)（References）：

［1］ JUNG K， SAIF L J， WANG Q H. Porcine epidemic diarrhea virus （PEDV）： An update on etiology， transmission， pathogenesis， and prevention and control［J］. Virus Res， 2020， 286：198045.

［2］ WANG Y S， NIE M C， DENG H D， et al. Establishment of a reverse transcription recombinase-aided amplification detection method for porcine group a rotavirus［J］. Front Vet Sci， 2022， 9：954657.

［3］ YAN Q H， LIU X D， SUN Y W， et al. Swine enteric coronavirus： diverse pathogen-host interactions［J］. Int J Mol Sci， 2022， 23（7）：3953.

［4］ BUSTIN S A， BENES V， GARSON J A， et al. The MIQE guidelines： Minimum Information for publication of Quantitative real-time PCR Experiments［J］. Clin Chem， 2009， 55（4）：611-622.

［5］ 王華健， 張 寧， 楊 威， 等. 3種食源性致病菌TaqMan多重?zé)晒舛縋CR檢測方法的建立［J］. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報， 2022， 53（4）：1201-1209.

WANG H J， ZHANG N， YANG W， et al. Establishment of a multiplex TaqMan fluorescence quantitative PCR method for detection of three foodborne pathogens［J］. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica， 2022， 53（4）：1201-1209. （in Chinese）

［6］ 鄺燕齊， 莫梅君， 何紅玲， 等. PEDV N蛋白單克隆抗體的制備及間接免疫熒光檢測方法的建立［J］. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報， 2020， 41（5）：27-35.

KUANG Y Q， MO M J， HE H L， et al. Preparation of monoclonal antibody against N protein of porcine epidemic diarrhea virus and establishment of indirect immuno-fluorescence assay［J］. Journal of South China Agricultural University， 2020， 41（5）：27-35. （in Chinese）

［7］ 陳小飛， 嚴(yán) 楠， 張 斌， 等. 豬A群輪狀病毒熒光定量PCR檢測方法的建立及應(yīng)用［J］. 動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展， 2021， 42（2）：41-45.

CHEN X F， YAN N， ZHANG B， et al. Establishment and application of TB green real-time fluorescence quantitative RT-PCR for detection of porcine RVA［J］. Progress in Veterinary Medicine， 2021， 42（2）：41-45. （in Chinese）

［8］ 李任峰， 盧曉輝， 姜金慶， 等. 豬新發(fā)冠狀病毒研究進(jìn)展［J］. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報， 2020， 51（10）：2359-2366.

LI R F， LU X H， JIANG J Q， et al. Research advances on porcine emerging coronaviruses［J］. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica， 2020， 51（10）：2359-2366. （in Chinese）

［9］ 施開創(chuàng)， 王睿敏， 黎宗強， 等. PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV多重TaqMan熒光定量RT-PCR檢測方法的建立及應(yīng)用［J］. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報， 2019， 41（6）：595-600.

SHI K C， WANG R M， LI Z Q， et al. Establishment and application of multiplex TaqMan real-time RT-PCR for differential detection of PEDV， TGEV， PDCoV and PRoV［J］. Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine， 2019， 41（6）：595-600. （in Chinese）

［10］ 高藝祥， 王金鳳， 張 倩， 等. 同時檢測PDCoV、TGEV、PoRV和PEDV的四重實時熒光RT-PCR方法的建立及應(yīng)用［J］. 中國獸醫(yī)學(xué)報， 2023， 43（3）：448-454， 461.

GAO Y X， WANG J F， ZHANG Q， et al. Development and application of a quadruple real-time RT-PCR assay for simulta-neous detection of PDCoV， TGEV， PoRV and PEDV［J］. Chinese Journal of Veterinary Medicine， 2023， 43（3）：448-454， 461. （in Chinese）

［11］ 孫博覽. 山東省豬δ冠狀病毒的分離鑒定與遺傳進(jìn)化分析［D］. 泰安： 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2022.

SUN B L. Isolation identification and genetic evolution analysis of porcine delta coronavirus in Shandong Province［D］. Tai’an： Shandong Agricultural University， 2022. （in Chinese）

［1］ JUNG K， SAIF LJ， WANG Q. Porcine epidemic diarrhea virus （PEDV）： An update on etiology， transmission， pathogenesis， and prevention and control. Virus Res. 2020 Sep;286：198045.

［2］ WANG Y， NIE M， DENG H， et al. Establishment of a reverse transcription recombinase-aided amplification detection method for porcine group a rotavirus. Front Vet Sci. 2022 Sep 15;9：954657.

［3］ YAN Q， LIU X， SUN Y， et al. Swine Enteric Coronavirus： Diverse Pathogen-Host Interactions. Int J Mol Sci. 2022 Apr 2;23（7）：3953.

［4］ BUSTIN SA， BENES V， GARSON JA， et al. The MIQE guidelines： minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 2009 Apr;55（4）：611-22.

［5］ 王華健，張 寧，楊 威，等.3種食源性致病菌TaqMan多重?zé)晒舛縋CR檢測方法的建立［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2022，53（04）：1201-1209.

WANG H J， ZHANG N， YANG W， et al. Establishment of a Multiplex TaqMan fluorescence quantitative PCR method for detection of three foodborne pathogens［J］. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica， 2022， 53（04）： 1201-1209.（in Chinese）.

［6］ 鄺燕齊，莫梅君，何紅玲等.PEDV N蛋白單克隆抗體的制備及間接免疫熒光檢測方法的建立［J］.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2020，41（05）：27-35.

KUANG Y Q，MO M J，HE H L， et al. Preparation of monoclonal antibodies against PEDV N protein and establishment of indirect immunofluorescence detection method ［J］. Journal of South China Agricultural University， 2020，41（05）：27-35.（in Chinese）.

［7］ 陳小飛，嚴(yán) 楠，張斌等.豬A群輪狀病毒熒光定量PCR檢測方法的建立及應(yīng)用［J］.動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2021，42（02）：41-45.

CHEN X F，YAN N ZHANG B， et al. Establishment and application of fluorescent quantitative PCR for detection of porcine Group A rotavirus ［J］. Progress in Veterinary Medicine， 2021，42（02）：41-45. （in Chinese）

［8］ 李任峰，盧曉輝，姜金慶等.豬新發(fā)冠狀病毒研究進(jìn)展［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2020，51（10）：2359-2366.

LI R F， LU X H， JIANG J Q， et al. Research advances on porcine emerging coronaviruses［J］. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica， 020，51（10）：2359-2366.（in Chinese）.

［9］ 施開創(chuàng)，王睿敏，黎宗強，等.PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV多重TaqMan熒光定量RT-PCR檢測方法的建立及應(yīng)用［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2019，41（06）：595-600.

SHI K C，WANG R M，LI Z Q， et al. Establishment and application of PEDV， TGEV， PDCoV and PRoV multi-TAQMAN fluorescence quantitative RT-PCR detection method ［J］. Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine，2019，41（06）：595-600.（in Chinese）.

［10］ 高藝祥，王金鳳，張 倩，等.同時檢測PDCoV、TGEV、PoRV和PEDV的四重實時熒光RT-PCR方法的建立及應(yīng)用［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報，2023，43（03）：448-454+461.

GAO Y X，WANG J F，ZHANG Q， et al. Establishment and application of quadruple real-time fluorescent RT-PCR method for Simultaneous detection of PDCoV， TGEV， PoRV and PEDV ［J］. Chinese Journal of Veterinary Medicine， 2023，43（03）：448-454+461.（in Chinese）.

［11］ 孫博覽.山東省豬δ冠狀病毒的分離鑒定與遺傳進(jìn)化分析［D］.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2022.

SUN B L. Isolation identification and genetic evolution analysis of porcine delta coronavirus in Shandong Province ［D］. Shandong Agricultural University，2022.

（編輯 編輯白永平）