SOCS2對(duì)山羊鼻甲骨細(xì)胞增殖、周期及凋亡的影響

摘 要： 細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子2 （suppressor of cytokine signaling 2，SOCS2）在動(dòng)物體內(nèi)參與調(diào)節(jié)多種生理和病理過(guò)程，如細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、腫瘤和炎癥反應(yīng)等。本研究在首次克隆山羊SOCS2基因的基礎(chǔ)上，研究過(guò)表達(dá)和干擾SOCS2表達(dá)對(duì)山羊鼻甲骨細(xì)胞增殖、周期及凋亡的影響。以1周歲的健康簡(jiǎn)州大耳羊（6只）的心、肝、脾、肺、腎、瘤胃、大腸、小腸和山羊鼻甲骨細(xì)胞共9個(gè)樣本為模板，采用反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)克隆山羊SOCS2基因CDS區(qū)序列，并進(jìn)行序列分析。利用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)SOCS2基因在不同組織中的表達(dá)。將克隆得到的SOCS2基因CDS區(qū)連接載體構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1-SOCS2。根據(jù)山羊SOCS2基因序列設(shè)計(jì)合成并篩選有效siRNA。利用LipofectamineTM 3000試劑將pcDNA3.1-SOCS2和siRNA片段分別轉(zhuǎn)染至鼻甲骨細(xì)胞，采用蛋白免疫印跡技術(shù)檢測(cè) SOCS2蛋白表達(dá)，MTT法檢測(cè)SOCS2對(duì)細(xì)胞增殖的影響，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SOCS2對(duì)細(xì)胞周期和凋亡的影響，并利用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)基因p21、CDK2和凋亡相關(guān)基因 Caspase3、Caspase7、PARP1、p53、Bax、BCL2L11 和Bcl-2的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，成功擴(kuò)增山羊SOCS2 基因序列，總長(zhǎng)為1 065 bp，CDS 區(qū)長(zhǎng)為597 bp，編碼198 個(gè)氨基酸殘基。SOCS2基因在肝中表達(dá)水平最高；SOCS2可以抑制細(xì)胞增殖。成功構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1-SOCS2，且該基因在鼻甲骨細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)。SOCS2過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致G2/M+S期細(xì)胞數(shù)量顯著增加，且下調(diào)CDK2和p21基因的mRNA表達(dá)；促進(jìn)細(xì)胞凋亡，且上調(diào)Caspase3、Caspase7、Bax、p53、BCL2L11、Bcl-2 基因的mRNA表達(dá)，PARP1表達(dá)水平無(wú)顯著變化。而干擾SOCS2表達(dá)后，G0/G1 期細(xì)胞數(shù)量顯著升高，且CDK2和p21基因的mRNA表達(dá)上調(diào)；細(xì)胞凋亡被抑制，且Caspase3、Bax、p53、PARP1基因的mRNA表達(dá)下調(diào)，Caspase7、BCL2L11、Bcl-2基因表達(dá)水平無(wú)顯著變化。綜上所述，SOCS2可將細(xì)胞周期阻滯在G2/M+S期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖。研究結(jié)果為全面揭示山羊SOCS2功能提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞： 山羊；SOCS2；細(xì)胞增殖；細(xì)胞周期；細(xì)胞凋亡

中圖分類(lèi)號(hào)：S852.21

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A""" 文章編號(hào)：0366-6964（2024）05-2226-15

收稿日期：2023-08-28

基金項(xiàng)目：西南民族大學(xué)研究生創(chuàng)新型科研項(xiàng)目（YB2023338）；四川省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2023YFN0043）；四川省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2022NSFSC0082）；四川省科技計(jì)劃項(xiàng)目（23ZDYF3070）；四川省畜禽育種攻關(guān)項(xiàng)目（2021YFYZ0003）；浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2022C04017）

作者簡(jiǎn)介：李秋云（2000-），女，四川自貢人，碩士，主要從事畜禽傳染病研究，E-mail：428403258@qq.com

*通信作者：向 華，主要從事畜禽傳染病研究，E-mail：xianghua2008411@163.com；朱江江，主要從事畜禽傳染病研究，E-mail：zhujiang4656@hotmail.com

Effects of SOCS2 on Proliferation， Cycle and Apoptosis of Turbinate Bone Cells in Goats

LI" Qiuyun1， TIAN" Xinyuan1， LIAO" Wensheng1， ZHANG" Huanrong1， REN" Yupeng1， YANG" Falong

1， ZHU" Jiangjiang2*， XIANG" Hua1*

（1.Key Laboratory of Animal Medicine at Southwest Minzu University of Sichuan Province，

Chengdu

610041，" China;

2.Qinghai-Tibetan Plateau Animal Genetic Resource

Reservation and Utilization

Key Laboratory of Sichuan Province， Chengdu 610041，" China）

Abstract：" Suppressor of cytokine signaling 2 （SOCS2） is involved in regulating various physiological and pathological processes in animals， such as cell apoptosis， proliferation， cell cycle， tumor， and inflammatory response. In this study， based on the first cloned SOCS2 gene from goats， the effects of overexpression and interference SOCS2 expression on proliferation， cycle and apoptosis of goat turbinate bone cells were studied. A total of 9 samples of heart， liver， spleen， lung， kidney， rumen， large intestine， small intestine and goat turbinate bone cells of healthy Jianzhou goats （6 animals） were used as samples， and the sequence of the CDS region of the goat SOCS2 gene was cloned by reverse transcription PCR and analyzed the sequence. RT-qPCR was used to detect the expression of SOCS2 gene in different tissues. The cloned SOCS2 gene CDS region ligation vector was constructed as a eukaryotic expression vector pcDNA3.1-SOCS2. Design， synthesis and screen effective siRNAs based on goat SOCS2 gene sequences. After transfecting pcDNA3.1-SOCS2 and siRNAs to turbinate osteocytes with LipofectamineTM 3000 reagent， SOCS2 protein expression was detected with Western blot mothed， the MTT method detects the effect of SOCS2 on cell proliferation， flow cytometry to detect the effect of SOCS2 on cell cycle and apoptosis and RT-qPCR was used to detect the transcription levels of cell cycle-related genes p21， CDK2 and apoptosis-related genes Caspase3， Caspase7， PARP1， p53， Bax， BCL2L11 and Bcl-2. The results showed that the total length of goat SOCS2 gene was 1 065 bp， and the CDS zone length was 597 bp， encoding 198 amino acid residues. SOCS2 gene is expressed at the highest levels in the liver tissue; SOCS2 can inhibit cell proliferation. The eukaryotic expression vector pcDNA3.1-SOCS2 was successfully constructed， and the gene was successfully expressed in turbinate bone cells. SOCS2 overexpression can lead to a significant increase in the number of cells in the G2/M+S phase and down-regulation of mRNA expression in CDK2 and p21 genes. It promoted apoptosis and upregulated the mRNA expression of Caspase3， Caspase7， Bax， p53， BCL2L11， and Bcl-2 genes， but there was no significant change in PARP1 expression level. However， after interference the expression of SOCS2， the number of cells in G0/G1 stage increased significantly， and the mRNA expression of CDK2 and p21 genes was upregulated. The apoptosis was inhibited and the mRNA expression of Caspase3， Bax， p53 and PARP1 genes was downregulated， while the expression levels of Caspase7， BCL2L11 and Bcl-2 did not change significantly. In summary， SOCS2 can block cells in the G2/M+S phase， promote apoptosis， and inhibit cell proliferation. The results of this study accumulate experimental data for a comprehensive reveal of the function of goat SOCS2.

Key words： goat; SOCS2; cell proliferation; cell cycle; apoptosis

*Corresponding authors：" XIANG Hua， E-mail：xianghua2008411@163.com; ZHU Jiangjiang， E-mail：zhujiang4656@hotmail.com

細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子（suppressor of cytokine signaling，SOCS）是一類(lèi)由細(xì)胞產(chǎn)生并反饋性阻斷細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程的免疫調(diào)控因子［1］。SOCS家族作為炎癥因子轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子，可通過(guò)抑制炎癥相關(guān)信號(hào)通路的核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）和絲裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）的過(guò)度激活而發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子的過(guò)量釋放，進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)［2-3］。

同時(shí)，SOCS蛋白對(duì)先天性免疫和適應(yīng)性免疫起著重要的生理調(diào)節(jié)作用［4］。SOCS2作為SOCS家族中的成員，該基因在部分動(dòng)物中，可參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子依賴(lài)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活蛋白（janus kinase-signal transducer and activator of transcription，JAK-STAT）的信號(hào)通路［5］；進(jìn)而調(diào)控機(jī)體的生理和病理過(guò)程，包括細(xì)胞凋亡［6］、細(xì)胞增殖［7］、細(xì)胞周期［8］、腫瘤［9］和炎癥反應(yīng)［10］等。在代謝方面，研究發(fā)現(xiàn)在脂肪肝組織和正常肝組織中，SOCS2的表達(dá)模式存在差異［11］。在豬脂肪原代細(xì)胞中過(guò)表達(dá)SOCS2基因能夠抑制生長(zhǎng)激素（growth hormone，GH）誘導(dǎo)的脂解作用［12］。在腫瘤方面，大量的研究表明，SOCS2基因的表達(dá)水平變化與腫瘤的發(fā)生有顯著相關(guān)性［13-14］。在肝癌患者中發(fā)現(xiàn)其癌組織中SOCS2表達(dá)水平顯著下降，且SOCS2基因表達(dá)下降的肝癌患者的無(wú)病生存期顯著縮短，前列腺癌患者組織中SOCS2表達(dá)水平顯著上調(diào)［15］。而且，肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）外泌體可以通過(guò)SOCS2和JAK3/STAT761信號(hào)通路激活成纖維細(xì)胞（fibroblasts，NFs），從而影響腫瘤微環(huán)境［16］。在免疫方面，有研究發(fā)現(xiàn)SOCS2基因可調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）等炎性細(xì)胞因子的水平，說(shuō)明SOCS2有可能與炎癥反應(yīng)和炎性因子轉(zhuǎn)錄有關(guān)，從而減少炎性細(xì)胞的數(shù)目［17］。

同時(shí)，SOCS被認(rèn)為是STATs的靶基因，可以直接作用于JAK/STAT信號(hào)通路抑制STATs活化，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等過(guò)程［18-19］。解云菲［20］研究發(fā)現(xiàn)，SOCS3可以通過(guò)調(diào)控STAT3 蛋白磷酸化激活 JAK2/STAT3 通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)該通路下游凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，最終抑制 TNF-α 誘導(dǎo)的前體脂肪細(xì)胞凋亡。Duan等［21］研究發(fā)現(xiàn)，毛花苷C（lanatoside C）可通過(guò)調(diào)控JAK2/STAT6/SOCS2信號(hào)通路，降低線(xiàn)粒體膜電位來(lái)觸發(fā)細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞周期停滯在S期和G2/M期。SOCS2是STAT5a、STAT5b下游靶基因，在催乳素作用下，SOCS2表達(dá)顯著升高，繼而調(diào)節(jié)牛乳腺細(xì)胞的增殖與泌乳［22］。SOCS2還可以抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號(hào)通路激活，從而抑制細(xì)胞凋亡［23］。然而，對(duì)于SOCS2調(diào)控細(xì)胞周期及凋亡方面的具體機(jī)制尚不清楚，目前，尚無(wú)山羊SOCS2基因序列以及其對(duì)細(xì)胞周期和凋亡調(diào)控作用的研究報(bào)道。本研究選用簡(jiǎn)州大耳山羊作為材料，采用RT-PCR技術(shù)對(duì)山羊SOCS2的基因序列進(jìn)行了克隆和序列分析；在構(gòu)建 pcDNA3.1-SOCS2真核表達(dá)載體的基礎(chǔ)上，將其轉(zhuǎn)染山羊鼻甲骨細(xì)胞，研究 SOCS2對(duì)細(xì)胞周期、凋亡、增殖以及周期和凋亡相關(guān)基因的影響；同時(shí)干擾SOCS2的表達(dá)，探究其對(duì)細(xì)胞周期、凋亡、增殖及周期和凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響，為進(jìn)一步全面揭示SOCS2功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集、總RNA提取及細(xì)胞

本試驗(yàn)在2022年于西南民族大學(xué)完成。6只1周歲健康簡(jiǎn)州大耳山羊購(gòu)于四川簡(jiǎn)陽(yáng)大哥大牧業(yè)有限公司。將山羊空腹屠宰后，采集每只山羊心、肝、脾、肺、腎、瘤胃、大腸和小腸組織8個(gè)組織樣本，然后用無(wú)菌DEPC水沖洗干凈，用錫箔紙包好后快速放入液氮保存待用。采用Trizol法進(jìn)行組織和山羊鼻甲骨細(xì)胞總RNA的提取，質(zhì)量檢測(cè)合格后將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。山羊鼻甲骨細(xì)胞由西南民族大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。pcDNA3.1（+）真核表達(dá)載體由西南民族大學(xué)青藏高原研究院惠贈(zèng)。

1.2 主要儀器與試劑

多功能免染蛋白印記系統(tǒng)購(gòu)自日本Cytiva公司；高速離心機(jī)5804購(gòu)自Eppendorf公司；PCR儀、CO2恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自ThermoFisher Scientific公司；凝膠成像儀、半干轉(zhuǎn)移電泳槽購(gòu)自Tanon公司；熒光倒置顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯公司。

BamHⅠ 限制性?xún)?nèi)切酶、T4 連接酶、Premix TaqTM、TB Green Premix Ex TaqTMⅡ、XbaⅠ限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自TaKaRa公司；PrimeScriptTM reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）購(gòu)自北京索萊寶公司；Trizol、LipoGeneTM 3000 轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自ThermoFisher Science 公司產(chǎn)品；胎牛血清（FBS）購(gòu)自北京全式金公司；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒、Annexin V-FITC/PI Kit 凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京四正柏生物公司；ECL 化學(xué)發(fā)光底物購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；鼠 anti-Flag 單抗（sc-166355）、HRP 標(biāo)記山羊抗鼠 IgG購(gòu)自Abmart 公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 山羊 SOCS2基因克隆及序列分析

根據(jù)GenBank中山羊SOCS2基因預(yù)測(cè)序列（XM_027967202.1）設(shè)計(jì)克隆山羊SOCS2的特異性引物（表1）。以山羊肝組織cDNA 為SOCS2 基因PCR擴(kuò)增模板，并通過(guò) 1.5%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)無(wú)誤后膠回收，產(chǎn)物與pMD19-T Simple載體連接后轉(zhuǎn)化，陽(yáng)性菌落 PCR 檢測(cè)和測(cè)序確定無(wú)誤后，將重組質(zhì)粒命名為 pMD19-SOCS2。參考王憲軍等［24］方法對(duì)山羊SOCS2基因進(jìn)行序列分析。

1.3.2 真核表達(dá)載體 pcDNA3.1-SOCS2 構(gòu)建及siRNA的合成

以SOCS2的CDS區(qū)序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)亞克隆引物，序列見(jiàn)表 1。上、下游引物劃線(xiàn)部分分別為 BamHⅠ和XbaⅠ酶切位點(diǎn)，斜體部分為 Kozak 序列，劃線(xiàn)加粗部分為 Flag 標(biāo)簽。使用BamHⅠ和XbaⅠ酶對(duì)載體 pcDNA3.1（+）和亞克隆獲得的SOCS2的CDS區(qū)序列進(jìn)行雙酶切，隨后用 T4 連接酶對(duì)回收純化產(chǎn)物進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確后的真核表達(dá)載體命名為 pcDNA3.1-SOCS2。使用BamH Ⅰ和XbaⅠ酶對(duì)pcDNA3.1-SOCS2質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。將“ 1.3.1 ”克隆獲得的 SOCS2基因的 CDS 區(qū)序列送上海吉瑪基因股份有限公司合成 2 條 siRNA 干擾片段和一條陰性對(duì)照序列（表2）。

1.3.3 山羊SOCS2基因的組織表達(dá)差異檢測(cè)

以“1.1”中反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，表1中SOCS2基因克隆引物采用RT-qPCR檢測(cè)SOCS2基因在不同組織中的表達(dá)差異。以泛素表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子（ubiquitously-expressed transcript，UXT）基因作為內(nèi)參基因，序列見(jiàn)表1。每個(gè)待測(cè)樣本設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。

1.3.4 山羊鼻甲骨細(xì)胞的復(fù)蘇培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

本試驗(yàn)所用鼻甲骨細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)室前期分離和純化獲得［25］。復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)室凍存的鼻甲骨細(xì)胞，即細(xì)胞接種于含體積分?jǐn)?shù)為15% FBS和1% 雙抗的DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。待第6代細(xì)胞生長(zhǎng)到70%～80%時(shí)，根據(jù)LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，操作程序參考文獻(xiàn)［26］。山羊SOCS2過(guò)表達(dá)組設(shè)置pcDNA3.1-SOCS2組和pcDNA3.1（+）陰性對(duì)照組。山羊SOCS2干擾組設(shè)置SOCS2-siRNA1、SOCS2-siRNA2和陰性對(duì)照組（Negative control，NC）。轉(zhuǎn)染 48 h 后，提取細(xì)胞的總 RNA 并反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，RT-qPCR 技術(shù)檢測(cè) SOCS2基因的 mRNA 表達(dá)水平，篩選出有效的 siRNA 干擾片段。每組試驗(yàn)設(shè)置生物學(xué)重復(fù)3次。

1.3.5 檢測(cè)SOCS2蛋白在山羊鼻甲骨細(xì)胞中的表達(dá)

按照“1.3.4”方式進(jìn)行山羊SOCS2過(guò)表達(dá)組的轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后，收集蛋白樣品。經(jīng) SDS-PAGE 電泳后，轉(zhuǎn)入聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上并進(jìn)行封閉過(guò)夜。隨后分別添加鼠源 Flag 單克隆抗體和兔源 β-Actin，4℃孵育過(guò)夜。然后再分別添加HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠 IgG 和山羊抗兔 IgG，室溫?fù)u床孵育 2 h，最后使用 ECL 試劑顯色，成像。

1.3.6 SOCS2對(duì)山羊鼻甲骨細(xì)胞增殖的影響

參照“1.3.4”方式進(jìn)行轉(zhuǎn)染，待96 孔培養(yǎng)板內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%時(shí)，將真核表達(dá)載體 pcDNA3.1-SOCS2和 pcDNA3.1（+）分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，分別培養(yǎng)24、48、72和96 h。按照 MTT試劑說(shuō)明書(shū)測(cè)定不同時(shí)間段562 nm波長(zhǎng)處各孔光吸收OD值并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)。同樣，將干擾效率 70%以上的干擾片段和陰性對(duì)照組分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，培養(yǎng)24、48、72和96 h，按照類(lèi)似的步驟檢測(cè)干擾SOCS2表達(dá)后對(duì)細(xì)胞增殖的影響。每組設(shè)置5個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.7 SOCS2對(duì)山羊鼻甲骨細(xì)胞周期及周期相關(guān)基因表達(dá)的影響

參照“1.3.4”方式進(jìn)行轉(zhuǎn)染，待12孔培養(yǎng)板內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80% 時(shí)，將真核表達(dá)載體 pcDNA3.1-SOCS2和 pcDNA3.1（+）分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h 后，按細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒操作步驟收樣，流式細(xì)胞儀檢測(cè)SOCS2過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞周期的影響。同樣，將干擾效率 70%以上的干擾片段和陰性對(duì)照組分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h 后，按照類(lèi)似的步驟檢測(cè)干擾SOCS2表達(dá)后對(duì)細(xì)胞周期的影響。同時(shí)以UXT作為內(nèi)參基因，參照王憲軍等［27］設(shè)計(jì)的檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)的引物（表1），采用RT-qPCR 測(cè)定SOCS2對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)基因mRNA 表達(dá)水平的影響。每組設(shè)3 個(gè)重復(fù)孔，試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.8 SOCS2 對(duì)山羊鼻甲骨細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

參考“1.3.4”方式進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h 后，根據(jù)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)收樣，使用流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)SOCS2過(guò)表達(dá)和干擾對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。同時(shí)，參照但一昕等［28］設(shè)計(jì)的檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的引物 （表1）。以UXT作為內(nèi)參基因，采用RT-qPCR 測(cè)定SOCS2過(guò)表達(dá)和干擾對(duì)細(xì)胞凋亡有關(guān)基因 mRNA 表達(dá)水平的影響。每組設(shè)3 個(gè)重復(fù)孔，試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

以UXT為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt方法對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。使用 SPSS20.0 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.01 為差異極顯著，P＜0.05為差異顯著，P＞0.05 為差異不顯著。

2 結(jié) 果

2.1 山羊SOCS2基因 CDS 區(qū)的克隆及序列分析

膠回收產(chǎn)物克隆轉(zhuǎn)化后，經(jīng)測(cè)序得到SOCS2基因序列長(zhǎng)度為1 065 bp，其中，CDS區(qū)長(zhǎng)597 bp，共編碼198個(gè)氨基酸（圖1A）。SOCS2 蛋白分子式為C990H1562N270O297S8，分子質(zhì)量為22.258 475 ku，為親水蛋白（圖1B），主要分布在核內(nèi)，不存在信號(hào)肽（圖1C），無(wú)跨膜區(qū)（圖2A）。SOCS2共有24個(gè)磷酸化位點(diǎn)，包括10個(gè)蘇氨酸（Thr）、10個(gè)絲氨酸（Ser）、4個(gè)酪氨酸（Tyr）磷酸化位點(diǎn)（圖2B）。提交NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)得到山羊SOCS2基因的GenBank登錄號(hào)為MZ_055377。SOCS2二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)α螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈分別占27.78%、52.02%和18.69%（圖2C），SOCS2的三級(jí)結(jié)構(gòu)如圖2D。從STRING數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到與SOCS2蛋白可能存在互作的蛋白包括JAK1、JAK2、STAT5A、STAT5B、SOCS1、LCK、GHR、CUL5、TCEB1、TCEB2（圖2E）。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示，山羊SOCS2基因與綿羊親緣關(guān)系最近，然后是牦牛、牛、豬、人、馬、小鼠，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)的是大鼠（圖2F）。

2.2 山羊SOCS2基因的組織表達(dá)差異分析

由圖3可知，在山羊的心、脾、肝、腎、肺、瘤胃、大腸和小腸8個(gè)組織樣本以及鼻甲骨細(xì)胞中都能檢測(cè)到SOCS2基因的mRNA表達(dá)，然而肝中的SOCS2基因mRNA表達(dá)水平顯著高于其他組織，其次是大腸，最低的是脾和瘤胃。

2.3 真核表達(dá)載體 pcDNA3.1-SOCS2的構(gòu)建及鑒定

對(duì)純化后的質(zhì)粒 pcDNA3.1-SOCS2 進(jìn)行 BamHⅠ和 XbaⅠ雙酶切，得到 5 400 和 600 bp 左右長(zhǎng)度片段（圖4A）。測(cè)序結(jié)果與預(yù)期相同，表明真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.4 SOCS2的過(guò)表達(dá)和干擾效率檢測(cè)

以β-Actin為內(nèi)參基因，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1-SOCS2重組質(zhì)粒的細(xì)胞中檢測(cè)到了標(biāo)簽蛋白Flag的表達(dá)（22.258 475 ku），而轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1（+）的細(xì)胞內(nèi)無(wú) Flag 蛋白的表達(dá)，表明SOCS2在鼻甲骨細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)，可用于該蛋白的功能研究（圖4B）。RT-qPCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，干擾SOCS2（SOCS2-siRNA 1 和SOCS2-siRNA 2）后其相對(duì)表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組，其中SOCS2-siRNA2干擾效果最好，可降低SOCS2基因 mRNA 表達(dá)水平達(dá) 70%，達(dá)到了極顯著水平（Plt;0.01） （圖4C），可作為后續(xù)試驗(yàn)材料。

2.5 SOCS2 對(duì)山羊鼻甲骨細(xì)胞增殖的影響

試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5。與對(duì)照細(xì)胞組相比，轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1-SOCS2 組山羊鼻甲骨細(xì)胞增殖受到了一定程度的抑制（Plt;0.05），但是隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，其抑制作用減弱。相反，轉(zhuǎn)染 SOCS2-siRNA2促進(jìn)了山羊鼻甲骨細(xì)胞增殖（Plt;0.05），且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，其促進(jìn)作用減弱。

2.6 SOCS2 對(duì)山羊鼻甲骨細(xì)胞周期及周期相關(guān)基因表達(dá)的影響

與空載體pcDNA3.1（+）（41.73%±0.40%）相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-SOCS2組G0/G1期細(xì)胞數(shù)（28.54%±0.22%）極顯著降低；而與空載體（48.27%±0.31%）相比較，pcDNA3.1-SOCS2組的G2/M+S期占比約為（61.46%±0.50%），細(xì)胞數(shù)上升極顯著（圖6 A）。與陰性對(duì)照組（93.61%±0.25%）相比較，轉(zhuǎn)染SOCS2-siRNA2組的 G0/G1 期細(xì)胞數(shù)（105.36%±0.14%）顯著增加；而與陰性對(duì)照組（10.96%±0.58%）相比較，SOCS2-siRNA2 組G2/M+S 期細(xì)胞占比約為（4.63%±0.15%），細(xì)胞數(shù)減少極顯著（圖6 B）?？梢?jiàn)，SOCS2可以將細(xì)胞阻滯于G2/M+S期。周期相關(guān)基因的檢測(cè)結(jié)果顯示，與pcDNA3.1（+）空載體組相比，pcDNA3.1-SOCS2 轉(zhuǎn)染組CDK2和p21基因的mRNA表達(dá)水平下調(diào)（Plt;0.01）（圖6 C）。而與陰性對(duì)照組相比，干擾SOCS2表達(dá)可上調(diào)CDK2和p21基因的mRNA表達(dá) （Plt;0.01）（圖6 D）。

2.7 SOCS2 對(duì)山羊鼻甲骨細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1（+）組的細(xì)胞早期凋亡率為9.89%±0.09%、晚期凋亡率為3.90%±0.20%；pcDNA3.1-SOCS2轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的早期凋亡率為33.77%±0.12%、晚期凋亡率24.34%±0.11%。轉(zhuǎn)染Negative Control 片段組細(xì)胞的早期凋亡率為4.34%±0.11%、晚期凋亡率1.62%±0.07%；SOCS2-siRNA2轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的早期凋亡率為2.24%±0.04%，晚期凋亡率為0.68%±0.06%?？梢?jiàn)，SOCS2促進(jìn)了山羊鼻甲骨細(xì)胞的凋亡作用（圖7）。細(xì)胞凋亡相關(guān)基因檢測(cè)結(jié)果顯示，與空載體pcDNA3.1（+）組相比，SOCS2過(guò)表達(dá)可極顯著上調(diào)細(xì)胞內(nèi)促凋亡基因Caspase3、Caspase7、Bax、 p53、BCL2L11 和抗凋亡基因 Bcl-2 mRNA的表達(dá)（Plt;0.01），但對(duì)PARP1 無(wú)顯著作用。敲低 SOCS2 基因表達(dá)可極顯著下調(diào)Caspase3、Bax mRNA水平（Plt;0.01），顯著下調(diào)p53 和 PARP1水平（Plt;0.05），對(duì)Caspase7、BCL2L11、Bcl-2 mRNA表達(dá)無(wú)顯著影響（圖8）。

3 討 論

目前，關(guān)于SOCS2功能的研究主要集中于人［29］、牛［30］、鼠［31］等，但尚未有關(guān)SOCS2基因功能的研究報(bào)道。同時(shí)，山羊鼻甲骨原代細(xì)胞常被用于山羊宿主細(xì)胞蛋白功能研究以及羊口瘡病毒的增殖和致病機(jī)制研究的理想細(xì)胞類(lèi)型之一［25，32-33］。本研究的對(duì)象為簡(jiǎn)州大耳山羊，通過(guò)克隆得到山羊SOCS2基因序列，總長(zhǎng)為1 065 bp，CDS 區(qū)長(zhǎng)為597 bp，編碼198個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析顯示，SOCS2蛋白無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域且不存在信號(hào)肽結(jié)構(gòu)，二級(jí)結(jié)構(gòu)中以無(wú)規(guī)則卷曲最多，其次是α螺旋，推測(cè)SOCS2蛋白為非分泌型Mixed樣蛋白且該蛋白可能不在生物膜上行使功能。JAK2、STAT5A、STAT5B、SOCS1等蛋白常被報(bào)道參與細(xì)胞增殖、凋亡及機(jī)體炎癥反應(yīng)等。如，馬濤等［34］研究發(fā)現(xiàn)，阿曼托雙黃酮（amentoflavone，AF）可通過(guò)抑制SW579細(xì)胞中JAK2-STAT3通路活化及其下游基因的表達(dá)進(jìn)而抑制SW579細(xì)胞的增殖同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。施姮和舒芳芳［35］研究發(fā)現(xiàn)，干擾SOCS1基因的表達(dá)后，連翹苷的作用被抑制，促進(jìn)了肺泡上皮細(xì)胞的凋亡、周期和氧化應(yīng)激。Xiao等［36］研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)RNF7后可以通過(guò)泛素化SOCS1激活JAK/STAT3信號(hào)通路，從而抑制腎癌細(xì)胞的凋亡。結(jié)合本研究互作蛋白的預(yù)測(cè)結(jié)果，推斷SOCS2蛋白與這幾種互作蛋白可能存在聯(lián)系，從而一起調(diào)控細(xì)胞的凋亡和增殖。

細(xì)胞周期的運(yùn)轉(zhuǎn)受到許多不同種類(lèi)的蛋白質(zhì)、復(fù)合物以及細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)等復(fù)雜物質(zhì)的參與，這些物質(zhì)之間相互影響、相互作用，共同協(xié)調(diào)和控制著細(xì)胞周期的運(yùn)轉(zhuǎn)，以確保細(xì)胞能夠正常地分化、生長(zhǎng)和凋亡［37］。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞的DNA受到損害時(shí)，細(xì)胞會(huì)利用其周期蛋白協(xié)同調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程，以便將細(xì)胞周期阻滯在某個(gè)特定的階段，從而為DNA修復(fù)損傷提供充足的時(shí)間［38］。同時(shí)，當(dāng)細(xì)胞DNA受到輕微損傷時(shí)，細(xì)胞更容易停滯在G0/G1期，相反則容易停滯在G2/M期，從而有助于細(xì)胞的生存［39］。本研究結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)SOCS2后可將細(xì)胞周期阻滯于G2/M+S期，同時(shí)下調(diào)p21 mRNA表達(dá)抑制細(xì)胞的增殖，而干擾SOCS2表達(dá)后的結(jié)果相反。由此推測(cè)這種現(xiàn)象的發(fā)生可能是，當(dāng)SOCS2表達(dá)發(fā)生變化時(shí)影響細(xì)胞的增殖以及CDK和p21基因的表達(dá)，從而調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程，為DNA的損傷修復(fù)贏取時(shí)間。這相比彭勝建等［40］的研究，更進(jìn)一步的研究了增殖與周期之間的關(guān)系。除此之外，細(xì)胞周期進(jìn)程還受細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶（cyclin dependent kinase，CDK）、p21、內(nèi)源性CDK抑制劑（cycin-dependent kinase inhibitors，CK）的影響［41-43］。細(xì)胞周期蛋白K（cyclin K，CCNK）作為細(xì)胞周期蛋白家族成員之一，可以調(diào)節(jié)前復(fù)合體的組裝，且表達(dá)量與細(xì)胞增殖呈正相關(guān)［44］。在本研究中，SOCS2過(guò)表達(dá)后可抑制細(xì)胞的增殖，且下調(diào)CDK的mRNA表達(dá)，此結(jié)果與上述報(bào)道一致。作者從干擾SOCS2表達(dá)后對(duì)細(xì)胞的影響再次證實(shí)上述結(jié)果。

在細(xì)胞凋亡信號(hào)傳遞過(guò)程中，有多種不同的信號(hào)傳遞系統(tǒng)參與其中，這些系統(tǒng)會(huì)觸發(fā)細(xì)胞凋亡程序，其中包括Bcl-2、Casepases、P53、BCL2L11和PARP1等多種蛋白的調(diào)節(jié)［45-46］。這些蛋白中Bcl-2家族（Bcl-2，BCL2L11）又在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用，它可以通過(guò)降低線(xiàn)粒體釋放的細(xì)胞色素C來(lái)調(diào)控細(xì)胞凋亡的過(guò)程［47］。本研究結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)SOCS2后可促進(jìn)山羊鼻甲骨細(xì)胞的凋亡并上調(diào)細(xì)胞內(nèi)促凋亡基因Caspase3、Caspase7、Bax、p53、BCL2L11 mRNA的表達(dá)。同時(shí)，參考Hirunagi等［48］的方法，設(shè)計(jì)、篩選到有效的干擾片段SOCS2-siRNA2，并將其轉(zhuǎn)染細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)干擾SOCS2表達(dá)后可抑制細(xì)胞凋亡并且下調(diào)Caspase3、Bax、p53和PARP1 mRNA水平。進(jìn)而從相反方向證實(shí)了SOCS2的功能，這與Li等［23］、Shi等［49］報(bào)道的結(jié)果相符合。已有研究顯示，Bcl-2/Bax的比值被認(rèn)為是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的開(kāi)關(guān)，對(duì)細(xì)胞的存活有很大影響，其比值下降預(yù)示細(xì)胞凋亡增加，其比值上升預(yù)示細(xì)胞凋亡減少［50］。干擾SOCS2表達(dá)后，Bcl-2雖未有明顯變化，但Bcl-2/Bax比值顯著上升，表明細(xì)胞凋亡被抑制了。同時(shí)，在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)SOCS2基因后，

Bcl-2/Bax比值同樣也出現(xiàn)了上升現(xiàn)象，作者推測(cè)在SOCS2基因調(diào)控的細(xì)胞凋亡信號(hào)通路中，可能還存在其他因子共同參與調(diào)控Bcl-2、Bax基因的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，SOCS2過(guò)表達(dá)可上調(diào)細(xì)胞內(nèi)促凋亡基因Caspase7、BCL2L11 mRNA表達(dá)，PARP1無(wú)顯著變化；而干擾SOCS2表達(dá)可下調(diào)PARP1水平，Caspase7、BCL2L11無(wú)顯著變化。據(jù)此可以推斷PARP1、Caspase7和Bcl-2家族在表達(dá)上可能存在一定的相互作用，但具體作用尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

山羊SOCS2基因總長(zhǎng)1 065 bp其CDS區(qū)長(zhǎng)597 bp，從ATG開(kāi)始，到TAA結(jié)束，共編碼198個(gè)氨基酸殘基，與綿羊的SOCS2基因同源性最近，與大鼠小鼠同源性最遠(yuǎn)，SOCS2在山羊肝中表達(dá)最高，脾中表達(dá)最低。SOCS2可顯著促進(jìn)山羊鼻甲骨細(xì)胞凋亡，抑制增殖，增加G2/M期和S期細(xì)胞數(shù)量。這些結(jié)果為進(jìn)一步探究山羊SOCS2功能奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)（References）：

［1］ 趙心愉， 劉 娟， 鄒曙明. 利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除團(tuán)頭魴SOCS1重復(fù)基因［J］. 水產(chǎn)學(xué)報(bào)， 2020， 44（12）：1937-1947.

ZHAO X Y， LIU J， ZOU S M. Knock-out analysis of duplicated socs1 using CRISPR/Cas9 in Megalobrama amblycephala［J］. Journal of Fisheries of China， 2020， 44（12）：1937-1947. （in Chinese）

［2］ ZHANG B G， HU L， ZANG M D， et al. Helicobacter pylori CagA induces tumor suppressor gene hypermethylation by upregulating DNMT1 via AKT-NFκB pathway in gastric cancer development［J］. Oncotarget， 2016， 7（9）：9788-9800.

［3］ WAN J， CHE Y， KANG N N， et al. SOCS3 blocks HIF-1α expression to inhibit proliferation and angiogenesis of human small cell lung cancer by downregulating activation of Akt， but not STAT3［J］. Mol Med Rep， 2015， 12（1）：83-92.

［4］ QIN H W， HOLDBROOKS A T， LIU Y D， et al. SOCS3 deficiency promotes M1 macrophage polarization and inflammation［J］. J Immunol， 2012， 189（7）：3439-3448.

［5］ 周月宏， 田 堅(jiān)， 沈靜雪， 等. SOCS2基因轉(zhuǎn)染對(duì)人腎小球系膜細(xì)胞TGF-β、Ⅳ型膠原蛋白、纖維連接蛋白表達(dá)的影響［J］. 山東醫(yī)藥， 2016， 56（3）：17-19.

ZHOU Y H， TIAN J， SHEN J X， et al. Effect of SOCS2 gene transfection on expression of TGF-β， collagen Ⅳ and FN in human glomerular mesangial cells［J］. Shandong Medical Journal， 2016， 56（3）：17-19. （in Chinese）

［6］ WANG S N， CAI Y L， BU R S， et al. PPARγ regulates macrophage polarization by inhibiting the JAK/STAT pathway and attenuates myocardial ischemia/reperfusion injury in vivo［J］. Cell Biochem Biophys， 2023， 81（2）：349-358.

［7］ 劉 旭， 王海龍， 陳洪濤， 等. MiR-467b調(diào)控JAK/STAT信號(hào)通路在脂多糖誘導(dǎo)ATDC5細(xì)胞增殖及炎癥反應(yīng)中的作用［J］. 臨床與病理雜志， 2021， 41（3）：503-509.

LIU X， WANG H L， CHEN H T， et al. Role of miR-467b in regulating JAK/STAT signaling pathway in LPS induced proliferation and inflammatory response of ATDC5 cells［J］. Journal of Clinical and Pathological Research， 2021， 41（3）：503-509. （in Chinese）

［8］ 廉政君， 常 煒. 漢黃芩素調(diào)節(jié)JAK/STAT信號(hào)通路并誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞凋亡及周期阻滯的作用及機(jī)制研究［J］. 臨床肺科雜志， 2021， 26（2）：270-274， 279.

LIAN Z J， CHANG W. Effect and mechanism of wogonin on regulating JAK/STAT signal pathway and inducing apoptosis and cell cycle arrest in lung cancer A549 cells［J］. Journal of Clinical Pulmonary Medicine， 2021， 26（2）：270-274， 279. （in Chinese）

［9］ TANG Y J， WU W， CHEN Q Q， et al. miR-29b-3p suppresses the malignant biological behaviors of AML cells via inhibiting NF-κB and JAK/STAT signaling pathways by targeting HuR［J］. BMC Cancer， 2022， 22（1）：909.

［10］ 袁宇晴， 婁 余， 龍 丹， 等. 潰結(jié)寧膏調(diào)控microRNA-155介導(dǎo)JAK/STAT通路對(duì)HT-29細(xì)胞炎癥模型的影響及作用機(jī)制研究［J］. 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合消化雜志， 2023， 31（4）：285-292.

YUAN Y Q， LOU Y， LONG D， et al. Mechanism of Kuijiening Plaster on inflammation model of HT-29 cells by regulating microRNA-155 mediated JAK/STAT pathway［J］. Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine on Digestion， 2023， 31（4）：285-292. （in Chinese）

［11］ ZADJALI F， SANTANA-FARRE R， VESTERLUND M， et al. SOCS2 deletion protects against hepatic steatosis but worsens insulin resistance in high-fat-diet-fed mice［J］. FASEB J， 2012， 26（8）：3282-3291.

［12］ YANG H L， YAN J， FENG M， et al. Construction of suppressor of cytokine signaling 2 （SOCS2） adenoviral overexpression vector and its impact on growth-hormone-induced lipolysis in swine primary adipocytes［J］. Genet Mol Res， GMR， 2013， 12（2）：1283-1293.

［13］ 成 誠(chéng)， 王佩雯， 楊 益， 等. 腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在吸煙促進(jìn)肺癌發(fā)展中作用及表觀遺傳機(jī)制［C］//中國(guó)毒理學(xué)會(huì)第十次全國(guó)毒理學(xué)大會(huì)論文集. 珠海：中國(guó)毒理學(xué)會(huì)， 2023：549-550.

CHENG C， WANG P W， YANG Y， et al. Role and epigenetic mechanism of tumor-associated macrophages in promoting the development of lung cancer through smoking［C］//Proceedings of the 10th National Toxicology Conference of the Chinese Society of Toxicology. Zhuhai：Chinese Society of Toxicology， 2023：549-550. （in Chinese）

［14］ TU Y H， MEI F. miR-3648 promotes lung adenocarcinoma-genesis by inhibiting SOCS2 （suppressor of cytokine signaling 2）［J］. Bioengineered， 2022， 13（2）：3044-3056.

［15］ 戴奇山， 朱建國(guó)， 江福能， 等. SOCS2在良性前列腺增生癥與前列腺癌中的表達(dá)及其意義［J］. 中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志， 2013， 23（34）：11-15.

DAI Q S， ZHU J G， JIANG F N， et al. Expression and significances of SOCS2 in prostate cancer tissues and benign prostate hyperplasia tissues［J］. China Journal of Modern Medicine， 2013， 23（34）：11-15. （in Chinese）

［16］ ZHOU X H， XU H， XU C， et al. Hepatocellular carcinoma-derived exosomal miRNA-761 regulates the tumor microenvironment by targeting the SOCS2/JAK2/STAT3 pathway［J］. World J Emerg Med， 2022， 13（5）：379-385.

［17］ 李曉艷， 莫立穩(wěn)， 程 瑩， 等. 白果內(nèi)酯調(diào)控細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子2抑制高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞中炎癥與纖維化成分的表達(dá)［J］. 河北醫(yī)學(xué)， 2022， 28（12）：2007-2012.

LI X Y， MO L W， CHENG Y， et al. Bilobalide regulates SOCS2 to inhibit the expression of inflammatory fibrotic components in high glucose-induced glomerular mesangial cells［J］. Hebei Medicine， 2022， 28（12）：2007-2012. （in Chinese）

［18］ LINOSSI E M， CALLEJA D J， NICHOLSON S W. Understanding SOCS protein specificity［J］. Growth Factors， 2018， 36（3-4）：104-117.

［19］ DURHAM G A， WILLIAMS J J L， NASIM M T， et al. Targeting SOCS proteins to control JAK-STAT signalling in disease［J］. Trends Pharmacol Sci， 2019， 40（5）：298-308.

［20］ 解蕓菲. siRNA干擾SOCS3表達(dá)對(duì)TNF-α誘導(dǎo)前體脂肪細(xì)胞凋亡的影響［D］. 楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)， 2011.

XIE Y F. Effects of Silencing SOCS3 expression by SIRNA on TNF-α induced preadipocytes apoptosis［D］. Yangling：Northwest Aamp;F University， 2011. （in Chinese）

［21］ DUAN Y C， CHEN L， SHAO J， et al. Lanatoside C inhibits human cervical cancer cell proliferation and induces cell apoptosis by a reduction of the JAK2/STAT6/SOCS2 signaling pathway［J］. Oncol Lett， 2021， 22（4）：740.

［22］ 李 勝. STAT5對(duì)水牛乳腺上皮細(xì)胞增殖和乳蛋白基因表達(dá)的調(diào)控作用及乳腺組織的定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究［D］. 南寧：廣西大學(xué)， 2019.

LI S. Studies related to actions of stat5 in proliferation of mammary epithielal cells and expression of genes related to milk proteins and quantitative proteomics of buffalo mammary gland［D］. Nanning：Guangxi University， 2019. （in Chinese）

［23］ LI S， HAN S， JIN K P， et al. SOCS2 suppresses inflammation and apoptosis during NASH progression through limiting NF-κB activation in macrophages［J］. Int J Biol Sci， 2021， 17（15）：4165-4175.

［24］ 王憲軍， 向 華， 張煥容， 等. 山羊HABP4基因的克隆、序列分析及功能預(yù)測(cè)［J］. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)， 2021， 52（12）：3426-3438.

WANG X J， XIANG H， ZHANG H R， et al. Cloning， sequence analysis and function prediction of HABP4 gene in goat［J］. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica， 2021， 52（12）：3426-3438. （in Chinese）

［25］ 徐頌為， 向 華， 張煥容， 等. 干擾SERBP1表達(dá)對(duì)山羊鼻甲骨原代細(xì)胞增殖、周期及凋亡的作用［J］. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)， 2022， 53（8）：2708-2720.

XU S W， XIANG H， ZHANG H R， et al. Effects of interfering SERBP1 on the cell proliferation， cell cycle and apoptosis in goat turbinate bone primary cells［J］. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica， 2022， 53（8）：2708-2720. （in Chinese）

［26］ 王江林， 王 永， 池永東， 等. KLF11抑制山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分化［J］. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)， 2020， 51（5）：976-986.

WANG J L， WANG Y， CHI Y D， et al. KLF11 inhibits the differentiation of goat intramuscular preadipocyte［J］. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica， 2020， 51（5）：976-986. （in Chinese）

［27］ 王憲軍， 向 華， 張旭梅， 等. 羊口瘡病毒ORFV118蛋白對(duì)山羊睪丸支持細(xì)胞周期、凋亡及免疫細(xì)胞因子的影響［J］. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)， 2022， 37（1）：222-231.

WANG X J， XIANG H， ZHANG X M， et al. Effects of ORFV118 on cell cycle， apoptosis and the immune-related cytokines in goat testicular sertoli cells［J］. Acta Agriculturae Boreali-Sinica， 2022， 37（1）：222-231. （in Chinese）

［28］ 但一昕， 楊 璐， 向 華， 等. BIRC5對(duì)山羊睪丸細(xì)胞周期、凋亡的影響［J］. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)， 2023， 54（4）：1511-1524.

DAN Y X， YANG L， XIANG H， et al. Effects of BIRC5 on the cycle and apoptosis of goat testis cells［J］. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica， 2023， 54（4）：1511-1524. （in Chinese）

［29］ 劉海濤， 羅 慶， 范 立， 等. 細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)負(fù)調(diào)控蛋白2在變應(yīng)性鼻炎中的表達(dá)及臨床意義［J］. 中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)， 2019， 16（33）：19-22.

LIU H T， LUO Q， FAN L， et al. Expression and clinical significance of negative regulatory protein 2 of cytokine signal transduction in allergic rhinitis［J］. China Medical Herald， 2019， 16（33）：19-22. （in Chinese）

［30］ 董寶霞， 楊玉瑩， 荊海霞， 等. 瘦素對(duì)牦牛MEC中SOCS2 mRNA及蛋白水平的表達(dá)影響［J］. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2022， 57（4）：10-16， 26.

DONG B X， YANG Y Y， JING H X， et al. Effect of leptin on SOCS2 mRNA and protein expression in MEC of yak［J］. Journal of Gansu Agricultural University， 2022， 57（4）：10-16， 26. （in Chinese）

［31］ 賈 超， 李樹(shù)崗， 范秋玉， 等. LncRNA Gm15621通過(guò)調(diào)控miR-133a/SOCS2軸抑制類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞炎癥［J］. 免疫學(xué)雜志， 2021， 37（3）：263-269.

JIA C， LI S G， FAN Q Y， et al. LncRNA Gm15621 inhibits fibroblast-like synoviocytes inflammation by regulating miR-133a/SOCS2 axis in rheumatoid arthritis［J］. Immunological Journal， 2021， 37（3）：263-269. （in Chinese）

［32］ DIEL D G， LUO S， DELHON G， et al. Orf virus ORFV121 encodes a novel inhibitor of NF-κB that contributes to virus virulence［J］. J Virol， 2011， 85（5）：2037-2049.

［33］ WANG X J， XIANG H， ZHANG H R， et al. HABP4 overexpression promotes apoptosis in goat turbinate bone cells［J］. Anim Biotechnol， 2022， doi：10.1080/10495398.2022.2062601.

［34］ 馬 濤， 王紅梅， 趙 婷， 等. 阿曼托雙黃酮通過(guò)JAK2-STAT3通路影響甲狀腺癌SW579細(xì)胞的增殖和凋亡［J］. 中國(guó)腫瘤生物治療雜志， 2023， 30（3）：211-216.

MA T， WANG H M， ZHAO T， et al. Amentoflavone induces apoptosis and suppresses proliferation of thyroid carcinoma SW579 cells by inhibiting the activation of JAK2-STAT3 pathway［J］. Chinese Journal of Cancer Biotherapy， 2023， 30（3）：211-216. （in Chinese）

［35］ 施 姮， 舒芳芳. 連翹苷調(diào)控細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子1對(duì)肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激的影響［J］. 中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志， 2023， 39（8）：1142-1146.

SHI H， SHU F F. Effects of phillyrin on alveolar epithelial cell apoptosis and oxidative stress induced by Streptococcus pneumoniae by regulating suppressor of cytokine signaling 1［J］. The Chinese Journal of Clinical Pharmacology， 2023， 39（8）：1142-1146. （in Chinese）

［36］ XIAO C W， ZHANG W， HUA M M， et al. RNF7 inhibits apoptosis and sunitinib sensitivity and promotes glycolysis in renal cell carcinoma via the SOCS1/JAK/STAT3 feedback loop［J］. Cell Mol Biol Lett， 2022， 27（1）：36.

［37］ 譚慧心， 董彥宏， 關(guān)文輝， 等. 細(xì)胞周期調(diào)控與腫瘤發(fā)生和治療的關(guān)系研究［J］. 哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2015， 31（6）：667-670.

TAN H X， DONG Y H， GUAN W H， et al. Relation of cell cycle regulation with occurrence and treatment of tumor［J］. Journal of Harbin University of Commerce （Natural Sciences Edition）， 2015， 31（6）：667-670. （in Chinese）

［38］ KIM M Y， PARK S J， SHIM J W， et al. Naphthazarin enhances ionizing radiation-induced cell cycle arrest and apoptosis in human breast cancer cells［J］. Int J Oncol， 2015， 46（4）：1659-1666.

［39］ CHEN S H， LUO T W， YU Q， et al. Isoorientin plays an important role in alleviating cadmium-induced DNA damage and G0/G1 cell cycle arrest［J］. Ecotoxicol Environ Saf， 2020， 187：109851.

［40］ 彭勝建， 丁美勝， 趙世明， 等. 過(guò)表達(dá)細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子2調(diào)控JAK2/STAT3通路抑制直腸癌細(xì)胞活性和移植瘤生長(zhǎng)［J］. 重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)， 2023， 48（1）：37-42.

PENG S J， DING M S， ZHAO S M， et al. Overexpression of SOCS2 on inhibition of rectal cancer cell growth activity and xenograft tumor growth by JAK2/STAT3 pathway［J］. Journal of Chongqing Medical University， 2023， 48（1）：37-42. （in Chinese）

［41］ 謝娜娜， 閆書(shū)平， 張崇昊， 等. 植物雌激素大豆黃酮對(duì)牛乳腺上皮細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響［J］. 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)， 2022， 34（4）：2645-2653.

XIE N N， YAN S P， ZHANG C H， et al. Effects of phytoestrogen daidzein on proliferation and cell cycle of bovine mammary epithelial cells［J］. Chinese Journal of Animal Nutrition， 2022， 34（4）：2645-2653. （in Chinese）

［42］ 潘劍鋒， 尚方正， 馬 榮， 等. 周期蛋白和周期蛋白依賴(lài)性激酶及相關(guān)激酶抑制劑在細(xì)胞周期進(jìn)程中的調(diào)控機(jī)制研究進(jìn)展［J］. 生物工程學(xué)報(bào)， 2023， 39（4）：1525-1547.

PAN J F， SHANG F Z， MA R， et al. Advances of the regulatory mechanism of cyclin， cyclin- dependent kinases and related kinase inhibitors in cell cycle progression［J］. Chinese Journal of Biotechnology， 2023， 39（4）：1525-1547. （in Chinese）

［43］ 范金柱， 郭云山， 任小宇， 等. AUF1負(fù)向調(diào)控p21對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響［J］. 西部醫(yī)學(xué)， 2023， 35（4）：480-484， 489.

FAN J Z， GUO Y S， REN X Y， et al. The effect of AUF1 negatively regulating p21 on the proliferation and apoptosis of osteosarcoma cells［J］. Medical Journal of West China， 2023， 35（4）：480-484， 489. （in Chinese）

［44］ LEI T J， ZHANG P X， ZHANG X D， et al. Cyclin K regulates prereplicative complex assembly to promote mammalian cell proliferation［J］. Nat Commun， 2018， 9（1）：1876.

［45］ LI M， GAO P， ZHANG J P. Crosstalk between autophagy and apoptosis： potential and emerging therapeutic targets for cardiac diseases［J］. Int J Mol Sci， 2016， 17（3）：332.

［46］ OUYANG C H， YOU J Y， XIE Z L. The interplay between autophagy and apoptosis in the diabetic heart［J］. J Mol Cell Cardiol， 2014， 71：71-80.

［47］ MARQUEZ R T， XU L. Bcl-2： Beclin 1 complex： multiple， mechanisms regulating autophagy/apoptosis toggle switch［J］. Am J Cancer Res， 2012， 2（2）：214-221.

［48］ HIRUNAGI T， SAHASHI K， TACHIKAWA K， et al. Selective suppression of polyglutamine-expanded protein by lipid nanoparticle-delivered siRNA targeting CAG expansions in the mouse CNS［J］. Mol Ther-Nucl Acids， 2021， 24：1-10.

［49］ SHI L， HU H B， SUN P X， et al. RPL38 knockdown inhibits the inflammation and apoptosis in chondrocytes through regulating METTL3-mediated SOCS2 m6A modification in osteoarthritis［J］. Inflamm Res， 2022， 71（7-8）：977-989.

［50］ LALIER L， CARTRON P F， JUIN P， et al. Bax activation and mitochondrial insertion during apoptosis［J］. Apoptosis， 2007， 12（5）：887-896.

（編輯 白永平）