棉花GhGGPase2基因克隆、功能序列分析、原核表達(dá)及煙草的遺傳轉(zhuǎn)化

祿亞洲　尹秀　左曉宇

摘要：以棉花纖維組織為材料，根據(jù)NCBI棉花EST進(jìn)行同源搜索、比對和序列拼接，經(jīng)RT-PCR從陸地棉纖維組織中擴(kuò)增得到L-半乳糖磷酸化酶基因（GhGGPase2）的cDNA開放閱讀框為1 335 bp，為包含445個氨基酸的蛋白質(zhì)，分子質(zhì)量約為49 ku。利用軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)序列分析，GhGGPase2蛋白具有組氨酸三聚體（HIT）蛋白超家族的主要特性的結(jié)構(gòu)域。進(jìn)化樹分析的結(jié)果表明棉花GhGGPase2與獼猴桃AdGGPase在進(jìn)化上親緣關(guān)系上較近。構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28a-GhGGPase2并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，將重組載體pET28a-GhGGPase2導(dǎo)入大腸桿菌BL21（DE3）中通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后經(jīng)過SDS-PAGE分析，顯示成功獲得分子質(zhì)量為49 ku左右的誘導(dǎo)表達(dá)蛋白GhGGPase2。將GhGGPase2基因構(gòu)建到植物真核表達(dá)載體pCAMBIA2300中，利用農(nóng)桿菌通過葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，經(jīng)PCR分子鑒定，獲得了含GhGGPase2轉(zhuǎn)基因煙草植株。研究結(jié)果將為進(jìn)一步闡明該基因的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：棉花纖維；L-半乳糖磷酸化酶基因；原核表達(dá)；克?。贿z傳轉(zhuǎn)化

中圖分類號： S562.032 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）07-0026-05

棉花是全球重要的經(jīng)濟(jì)作物，也是我國重要的農(nóng)產(chǎn)品及紡織原料，是國民經(jīng)濟(jì)的支柱產(chǎn)業(yè)之一，具有極其重要的戰(zhàn)略地位[1]。棉花纖維品質(zhì)中最重要的參考指標(biāo)是纖維的強度和長度，而細(xì)胞的伸長或膨大發(fā)育與纖維的最終品質(zhì)密切相關(guān)[2]?？箟难崾菑V泛存在于植物組織中的一種抗氧化小分子物質(zhì)，尤其是在細(xì)胞分裂旺盛的植物組織中含量較高，不僅對植物生長發(fā)育、防衛(wèi)、分化等許多生理過程起重要作用，還與細(xì)胞伸長密切相關(guān)[3-5]。棉花纖維細(xì)胞的結(jié)構(gòu)是長而不分支的單細(xì)胞，是研究細(xì)胞生長發(fā)育與分化的理想材料。之前的研究表明：抗壞血酸代謝可能參與纖維的發(fā)育過程[6]。

目前已知的植物體內(nèi)抗壞血酸生物合成途徑中，甘露糖/L-半乳糖途徑（又稱為Smirnoff/Wheeler途徑）是主要途徑[7]。L-半乳糖磷酸化酶（GDP-L-galactose phosphorylase，GGPase）基因的表達(dá)產(chǎn)物是L-半乳糖磷酸化酶（GGP），該酶能夠?qū)DP-L-半乳糖轉(zhuǎn)化成GDP-L-半乳糖-1-磷酸，是甘露糖/L-半乳糖途徑中的重要基因，對植物抗壞血酸的合成起著重要作用。目前已在擬南芥、獼猴桃、煙草、大豆、蓖麻、柑橘、葡萄、番茄和馬鈴薯等多種植物中分離出GGPase基因。通過轉(zhuǎn)基因研究表明在多個物種中過量表達(dá)GGPase基因可提高植物體內(nèi)抗壞血酸的含量[7-15]。

對棉花GGPase2基因的克隆、功能分析、原核表達(dá)和轉(zhuǎn)化煙草，有助于解析抗壞血酸參與棉纖維發(fā)育的重要功能。從處于快速伸長發(fā)育時期的棉花纖維組織中克隆得到了抗壞血酸合成途徑中的關(guān)鍵基因（GDP-L-半乳糖磷酸化酶基因）GGPase2，并對其編碼的蛋白進(jìn)行序列功能結(jié)構(gòu)域分析，構(gòu)建原核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）進(jìn)行重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，構(gòu)建植物表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化煙草，為深入探究抗壞血酸和GGPase參與棉花纖維發(fā)育的重要功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 植物材料為陸地棉徐-142棉花纖維，由筆者所在實驗室培養(yǎng)。經(jīng)液氮速凍后于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 菌株與質(zhì)粒 大腸桿菌菌株（Escherichia coli）、Top10由本實驗室保存；克隆載體為大連寶生物pGEM-T vector；原核表達(dá)載體為pET28a，真核表達(dá)載體為pCAMBIA2300由筆者所在實驗室保存。

1.1.3 酶及生化試劑 RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaKaRa LA Taq DNA 聚合酶、T4-DNA 連接酶、EcoRⅠ、BamHⅠ、XhoⅠ、KpnⅠ和XbaⅠ等相關(guān)酶購自大連寶生物公司；DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取微量試劑盒購自TIANGEN公司；其他相關(guān)試劑均為國產(chǎn)分析純，購自上海生工生物工程公司。

1.1.4 主要儀器 高壓蒸汽滅菌鍋（HVE-50）、Eppendorf 5417 R型臺式冷凍離心機(jī)、電泳儀（Tannon Epson100型）、PCR儀（Biomotra Tpersonal）、凝膠成像系統(tǒng)、超凈工作臺（BHC-1300A/B3）、恒溫培養(yǎng)箱（HIQ-X100）、恒溫?fù)u床（HWY-100B）。

1.2 方法

1.2.1 棉花總RNA的提取 根據(jù)改良的CTAB法[16]提取棉花總RNA。所使用的研缽經(jīng)高溫烘烤數(shù)小時，其他器皿均用DEPC水處理[17]。

1.2.2 GhGGPase2基因的克隆 根據(jù)從GenBank EST數(shù)據(jù)庫中所獲得的完整cDNA ORF基因片段進(jìn)行保守性分析后，利用Primer Premier 5.0進(jìn)行引物設(shè)計（正向引物：5′-CGCGGATCCATGATGCTTAGGATTAAGAGGGTTC-3′；反向引物：5′-CCGCTCGAGCTGCAGAACAAGGCATTGTTG-3′）。設(shè)計引物在上下游引物的兩端添加BamHⅠ和XhoⅠ的酶切位點（下劃線）和保護(hù)性堿基。用Prime-ScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒以總RNA為模板合成cDNA[18]，通過PCR擴(kuò)增獲得全長的 GhGGPase2 基因。

PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s，57 ℃ 退火45 s，72 ℃延伸70 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃存放。

1.2.3 蛋白質(zhì)序列比對和結(jié)構(gòu)域分析 蛋白質(zhì)序列比對通過DNAMAN軟件和NCBI網(wǎng)站在線完成，通過MEGA軟件完成進(jìn)化樹構(gòu)建。

1.2.4 pET28a-GhGGPase2原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 將克隆得到GhGGPase2基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)過回收后連接到pGEM-T Easy載體上，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞中，菌落PCR鑒定后挑取陽性單克隆，搖菌做穿刺管后送至華大基因公司測序[18-19]。將經(jīng)測序正確的重組質(zhì)粒pGEM-T-GhGGPase2和pET28a原核表達(dá)載體同時用BamHⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，回收目的基因小片段和原核表達(dá)載體大片段，并將回收好的大小片段按一定體系用T4-DNA 連接酶16 ℃過夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞，涂布于50 mg/L卡那霉素抗性固體LB培養(yǎng)基37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)12 h，挑取單克隆進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定[19-20]。

1.2.5 GhGGPase2重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE鑒定 將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pET28a-GhGGPase2和空質(zhì)粒pET28a轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)PCR鑒定后挑取陽性單克隆菌落接種于10 mL含50 mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)過夜。各取上述過夜菌500 μL轉(zhuǎn)接入50 mL含50 mg/L卡那霉素的LB中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至D600 nm為0.4～0.6時，各取10 mL菌液記為0 h（作為對照），加入IPTG至終濃度為2 mmol/L，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，分別取加入IPTG后2、4、6 h菌液10 mL，4 ℃ 5 000 r/min離心8 min收集菌體然后加入冰預(yù)冷PBS磷酸緩沖液懸浮菌體后再加入SDS，100 ℃水浴5 min，12 000 r/min離心5 min，吸取上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳（5%濃縮膠，12%分離膠），凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色[18-19]。

1.2.6 GhGGPase2植物表達(dá)載體的構(gòu)建 將經(jīng)過測序鑒定正確的pGEM-T-GhGGPase2重組質(zhì)粒和植物表達(dá)載體pCAMBIA2300同時用KpnⅠ和Xba Ⅰ進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收純化所需的目的片段，用T4-DNA Ligase 將回收的目的基因片段與pCAMBIA2300載體大片段相連接，4 ℃過夜；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入到大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有卡那霉素（Kan）的LB平板上37 ℃培養(yǎng)過夜。篩選陽性克隆并搖菌提取重組質(zhì)粒，酶切鑒定，即構(gòu)建p35S：：GhGGPase2植物表達(dá)載體。

1.2.7 煙草的遺傳轉(zhuǎn)化 將構(gòu)建好的p35S：：GhGGPase2表達(dá)載體用電擊法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌GV3101中，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布在含有100 mg/L Rif+5 mg/L Gen 7+75 mg/L Kan的LB培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)2 d。從平板上挑取單菌落，接種到含Rif、Gen和Kan的LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃搖菌培養(yǎng)，PCR鑒定陽性克隆。采用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草[20]：將煙草葉片切成1×1 cm 大小的葉盤，放入鑒定出的農(nóng)桿菌侵染液中，侵染 10 min，吸干菌液，放入共培養(yǎng)培養(yǎng)基（MS+1 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+50 mg/L AS）上（鋪濾紙），暗培養(yǎng)2 d后轉(zhuǎn)移至篩選分化培養(yǎng)基（MS+1 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+50 mg/L Kan+400 mg/L Cef）上誘導(dǎo)再生芽，每2周換1次培養(yǎng)基。再生芽長至1～2 cm時，將不定芽切下，轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基（1/2MS+0.3 mg/L IAA+50 mg/L Kan+400 mg/L Cef）中誘導(dǎo)生根[21]。

1.2.8 轉(zhuǎn)基因煙草分子鑒定 用天根RNA simple Total RNA Kit提取煙草總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，以合成的cDNA為模板，利用正向和反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s，57 ℃退火 45 s，72 ℃延伸70 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃存放。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉花GhGGPase2基因克隆

采用改良的CTAB法提取棉花纖維組織的總量RNA，結(jié)果表明：所提取的總量RNA呈現(xiàn)28S、18S完整條帶，28S的含量約為18S的2倍，表明所提取的RNA較好，可以繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)反轉(zhuǎn)錄試驗（圖1-A）。以反轉(zhuǎn)錄獲得的棉花纖維cDNA作為模板，經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到特異性條帶，經(jīng)測序正確后獲得GhGGPase2基因的全長開放閱讀框（圖1-B），包含 1 335 個堿基對的核苷酸，編碼含有445個氨基酸的蛋白質(zhì)。

2.2 序列比對與進(jìn)化樹分析

將GhGGPase2基因的cDNA序列翻譯為氨基酸序列，將該序列與以下幾種GGPase基因的氨基酸序列進(jìn)行對比：擬南芥（AtGGPase；GenBank 登錄號為At4g26850）、番茄（SlGGPase；GenBank 登錄號為AFD54988）、馬鈴薯（StGGPase；GenBank 登錄號為AEQ64271）、獼猴桃（AdGGPase；GenBank 登錄號為ABP65665）、煙草（NtGGPase；GenBank 登錄號為ACD92981）、蓖麻（RcGGPase；GenBank 登錄號為XP_002529463）、柑橘（CuGGPase；GenBank 登錄號為ADV59925）、葡萄（VvGGPase；GenBank 登錄號為XP_002278339）。結(jié)果顯示：植物中的GhGGPase2蛋白質(zhì)在序列相似性較高，具有保守的結(jié)構(gòu)域，黑色部分為保守的氨基酸序列，灰色部分為保守性一般的序列。GhGGPase2蛋白和其他植物一樣含有1個HIT（HxHxQ）基序，是組氨酸三聯(lián)體（HIT）超家族的一員。它也是一種核定位蛋白，核定位基序為NLS（圖2）。進(jìn)化樹分析的結(jié)果表明棉花GhGGPase2與柑橘AdGGPase在進(jìn)化上親緣關(guān)系上較近（圖3）。

2.3 原核表達(dá)載體pET28a-GhGGPase的構(gòu)建與鑒定

將經(jīng)測序正確的重組質(zhì)粒pGEM-T-GhGGPase2和pET28a原核表達(dá)載體同時用BamHⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，回收目的基因小片段和原核表達(dá)載體大片段，連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化成功的菌株挑取單克隆做菌落PCR鑒定（圖4-A），PCR鑒定為陽性的菌落搖菌提取質(zhì)粒進(jìn)一步做雙酶切鑒定（圖4-B），成功構(gòu)建pET28a-GhGGPase2原核表達(dá)載體。

2.4 重組GhGGPase2蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將構(gòu)建成功的pET28a-GhGGPase2重組子轉(zhuǎn)入表達(dá)菌

株BL21（DE3）中，經(jīng)PCR篩選鑒定后（圖5），進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，利用IPTG誘導(dǎo)菌體表達(dá)，提取蛋白質(zhì)后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，獲得了49 ku左右的重組GhGGPase2蛋白（圖6）。

2.5 p35S：：GhGGPase2植物表達(dá)載體構(gòu)建

將經(jīng)測序正確的重組質(zhì)粒pMD-T-GhGGPase2和pCAMBIA2300真核表達(dá)載體同時用BamHⅠ和Xba Ⅰ進(jìn)行雙酶切，回收目的基因小片段和真核表達(dá)載體大片段。連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)。經(jīng)PCR和雙酶切鑒定均含有目的片段，表明成功植物表達(dá)載體p35S：：GhGGPase2 （圖7）。

2.6 煙草的遺傳轉(zhuǎn)化與鑒定

采用電擊法將重組質(zhì)粒p35S：：GhGGPase2轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，經(jīng)篩選和PCR鑒定，結(jié)果PCR擴(kuò)增條帶與預(yù)期大小一致，表明p35S：：GhGGPase2植物表達(dá)載體已經(jīng)成功導(dǎo)入到農(nóng)桿菌GV3101中，可用于下一步的遺傳轉(zhuǎn)化 （圖8-A）。

將已經(jīng)成功導(dǎo)入p35S：：GhGGPase2重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌GV3101采用葉盤法轉(zhuǎn)化野生型煙草，誘導(dǎo)芽再生和生根，獲取再生的轉(zhuǎn)基因煙草。提取轉(zhuǎn)基因煙草葉片總量RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以p35S：：GhGGPase2質(zhì)粒作陽性對照，非轉(zhuǎn)基因煙草作陰性對照，通過RT-PCR利用特異性引物鑒定轉(zhuǎn)基因植株，結(jié)果顯示成功獲得了轉(zhuǎn)基因煙草植株（圖8-B）。

3 討論

本研究從棉花纖維組織中克隆得到GhGGPase2基因，該基因cDNA的開放閱讀框為1 335 bp。GhGGPase2擁有保守的HxHxQ功能結(jié)構(gòu)域，是D-半乳糖-1-磷酸鳥苷酰基轉(zhuǎn)移酶（GalT）家族和組氨酸三聯(lián)體（HIT）超家族的一員，這些功能結(jié)構(gòu)可能與棉花抵御非生物脅迫的能力相關(guān)。進(jìn)化樹分析的結(jié)果表明棉花GhGGPase2與柑橘AdGGPase在進(jìn)化上親緣關(guān)系上較近。構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET28a-GhGGpase2，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，通過誘導(dǎo)表達(dá)和SDS-PAGE分析獲得了大小約為49 ku的GhGGPase2重組蛋白質(zhì)。構(gòu)建了真核表達(dá)載體p35S：：GhGGPase2，導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101，通過葉盤法轉(zhuǎn)化野生型煙草，誘導(dǎo)芽再生和生根，獲得了再生的轉(zhuǎn)基因煙草。

抗壞血酸參與一系列植物的生長發(fā)育過程，并且可以影響氧化還原反應(yīng)相關(guān)的進(jìn)程，包括病原反應(yīng)[22-23]。植物體內(nèi)抗壞血酸合成途徑中從GDP-甘露糖轉(zhuǎn)化為L-半乳糖/L-古洛糖的過程中以糖醛酸作為前體，編碼GDP-甘露糖途徑中相關(guān)酶的基因已經(jīng)被證實和鑒定。在擬南芥中AtGGPase基因編碼GDP-L-半乳糖磷酸化酶，該酶催化抗壞血酸合成過程中GDP-L-半乳糖轉(zhuǎn)化為L-半乳糖-1-磷酸的這一步反應(yīng)。GDP-甘露糖途徑是擬南芥幼苗抗壞血酸來源的主要且顯著的途徑，并且抗壞血酸是幼苗生長所必需的[24-25]。光合作用的電子傳遞鏈與擬南芥中L-半乳糖途徑中的酶相互關(guān)聯(lián)，持續(xù)光照可以使擬南芥體內(nèi)的抗壞血酸含量增加，與此同時該途徑中的的GMPase、GGPase、GPPase的表達(dá)量也上升；強光處理后擬南芥體內(nèi)的抗壞血酸含量增加，同時GGPase表達(dá)和GGPase的酶活快速升高，該途徑中的其他酶的酶活變化不是很大；擬南芥中光周期的開始階段是GGPase和VTC5的表達(dá)高峰期，并且其表達(dá)受到生物鐘的調(diào)控[14]。擬南芥中GGPase蛋白具有底物特異性，底物GDP-L-半乳糖比GDP-D-甘露糖更容易被GGPase蛋白利用，而不宜以GDP-L-葡萄糖為底物[15]。

4 結(jié)論

本試驗從棉花纖維組織中克隆獲得GhGGPase2基因是抗壞血酸生物合成中的關(guān)鍵基因，調(diào)控著植物體內(nèi)抗壞血酸的生物合成，預(yù)示著其可能通過影響抗壞血酸含量從而參與纖維細(xì)胞的發(fā)育過程。結(jié)果將為深入研究GhGGPase基因的生物學(xué)功能以及為解析棉花纖維細(xì)胞發(fā)育的分子機(jī)制提供參考，同時也為利用基因工程進(jìn)行優(yōu)質(zhì)轉(zhuǎn)基因新品種的培育奠定了一定的基礎(chǔ)。

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