RNA熒光適配體在生物傳感與成像中的應(yīng)用研究進(jìn)展

關(guān)鍵詞 熒光適配體；RNA；生物傳感；生物成像；評(píng)述

蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子及其它小分子在時(shí)間、空間上的動(dòng)態(tài)變化與其功能和狀態(tài)密切相關(guān)[1] 。熒光蛋白的出現(xiàn)為活細(xì)胞內(nèi)生物大分子蛋白質(zhì)的檢測與成像提供了可能，對(duì)于探索蛋白質(zhì)功能及其與細(xì)胞異常和疾病的關(guān)系具有重要意義[2-3]。

目前，利用綠色熒光蛋白（GFP）已可實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞內(nèi)小分子及生物大分子的檢測及成像[4-5]，然而，這些方法對(duì)于RNA 的檢測仍存在局限性。與蛋白質(zhì)相比， RNA 種類多，并且多類結(jié)構(gòu)和功能未被闡明，因此，研究RNA 產(chǎn)生和表達(dá)的過程具有重要的生物學(xué)意義[6]。目前尚未發(fā)現(xiàn)具有天然熒光的RNA，所以利用類似熒光蛋白的原理，通過基因編碼實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞中RNA 的可視化研究仍是一個(gè)挑戰(zhàn)。

研究人員一直在致力于尋找類似GFP 的RNA 熒光蛋白模擬物。RNA 熒光適配體是一段能夠特異性結(jié)合熒光團(tuán)等小分子物質(zhì)，誘導(dǎo)和增強(qiáng)其發(fā)光的RNA 序列[7]， RNA 熒光適配體較熒光蛋白更易編輯，具有信噪比高、細(xì)胞毒性低、特異性強(qiáng)以及光穩(wěn)定性好等優(yōu)勢(shì)[8-9]，為胞外和活細(xì)胞內(nèi)功能性物質(zhì)的可視化研究提供了新的有效工具。本文綜述了近年來RNA 熒光適配體在細(xì)胞外檢測和細(xì)胞成像方面的研究和應(yīng)用進(jìn)展，分析了其存在的問題和挑戰(zhàn)，并對(duì)其未來的發(fā)展前景進(jìn)行了展望。

1 RNA熒光適配體的發(fā)展

RNA熒光適配體是通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（Systematic evolution of ligands by exponentialenrichment， SELEX）[10]在體外篩選出的能夠增強(qiáng)小分子熒光團(tuán)熒光的RNA 序列[11]；也可利用熒光激活細(xì)胞分選（Fluorescence-activated cell sorting， FACS）和微流控平臺(tái)篩選熒光強(qiáng)度更高、親和力更好的RNA 熒光適配體[12-13]。小分子熒光團(tuán)在自由狀態(tài)下可通過非輻射振動(dòng)弛豫途徑耗散能量，因此不發(fā)射熒光。RNA 熒光適配體增強(qiáng)小分子熒光團(tuán)發(fā)光的主要原理是：當(dāng)小分子熒光團(tuán)與RNA 適配體結(jié)合后，自由旋轉(zhuǎn)介導(dǎo)的能量耗散途徑被限制，表現(xiàn)為熒光增強(qiáng)，從而發(fā)射熒光。因此RNA 熒光適配體-熒光團(tuán)復(fù)合物通常具有較高的熒光發(fā)射效率[14-15]。最早的孔雀石綠（Malachite green ， MG）[16-17]RNA 熒光適配體及后來的Spinach[18]、Broccoli[19]、Pepper[20]、Mango[21]和Corn[22]適配體都是基于此發(fā)光原理。

圖1 為按時(shí)間順序列出的RNA 適配體發(fā)展歷程及其對(duì)應(yīng)的熒光小分子的結(jié)構(gòu)和發(fā)光范圍，以下具體介紹MG[16]、Pepper[20]、Mango[21]、Corn[22]、Broccoli[19，23]以及Spinach 家族[18，24]等相關(guān)的RNA 適配體的結(jié)構(gòu)（圖2）及其特性。

1.1 孔雀石綠適配體（Malachite green aptamer， MGA）

MGA是錢永健研究組[25]于2003 年報(bào)道的首個(gè)結(jié)合小分子熒光團(tuán)（三苯甲烷染料-孔雀綠， MG）后可發(fā)出熒光的RNA 序列，含有38 個(gè)堿基。MGA 與MG特異性結(jié)合后，發(fā)射強(qiáng)度增強(qiáng)2000 倍的熒光，其激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為630 和660 nm[17]。MGA 的發(fā)現(xiàn)為RNA 的熒光可視化提供了新思路，可以通過合成類似于熒光蛋白的熒光團(tuán)，并通過體外篩選得到與之結(jié)合的RNA 適配體。但是，在熒光照射過程中，MG染料會(huì)生成活性氧自由基，從而產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒性，不利于其在生命系統(tǒng)RNA成像中的廣泛使用。

1.2 Spinach家族

2011年，康奈爾大學(xué)的Jaffrey研究組[18]篩選出一種RNA 適配體，與不發(fā)光的GFP 生色團(tuán)小分子3，5-二氟-4-羥基亞芐基咪唑啉酮（DFHBI）特異性結(jié)合后，可發(fā)出類似GFP 的綠色熒光，該適配體最終以蔬菜名字命名為Spanish， Spinach-DFHBI 的激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為469 和501 nm。但是， Spinach適配體熱穩(wěn)定性較差且折疊效率有限，研究者經(jīng)過進(jìn)一步改進(jìn)和篩選，陸續(xù)開發(fā)了Spinach 2[24]、BabySpinach[26-27]和iSpinach[13，28]，在一定程度上解決了Spinach 的折疊效率低、K+依賴性和與DFHBI 親和力弱的問題。目前， Spinach 適配體家族已被廣泛應(yīng)用于構(gòu)建細(xì)菌和細(xì)胞內(nèi)熒光傳感器。

1.3 Broccoli家族

為了更有效地篩選RNA 適配體， Jaffrey 研究組[12]結(jié)合SELEX 和FACS 技術(shù)，同時(shí)考慮到細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的環(huán)境，篩選出更短（49 nt）但與DFHBI 或DFHBI 改良版本DFHBI-1T 結(jié)合后能發(fā)出更強(qiáng)熒光的Broccoli適配體。雖然Broccoli 與Spinach 和Spinach 2 在某段序列結(jié)構(gòu)上相似，但與DFHBI 或DFHBI-1T 結(jié)合時(shí)表現(xiàn)出更強(qiáng)的綠色熒光，同時(shí)熱穩(wěn)定性更好， Tm 值高達(dá)48 ℃，并且不需要tRNA 支架輔助其有效折疊，更適用于活細(xì)胞成像[11]。此外，由兩個(gè)Broccoli 組成的dBroccoli 適配體結(jié)合DFHBI-1T 的復(fù)合物熒光強(qiáng)度是單個(gè)Broccoli 結(jié)合DFHBI-1T 熒光強(qiáng)度的2 倍，無需額外添加Mg2+即可實(shí)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)RNA 的標(biāo)記。Broccoli 與Spinach 都是用DFHBI 通過SELEX 技術(shù)篩選的RNA 熒光適配體，結(jié)合DFHBI 后，都會(huì)發(fā)射綠色熒光（500～560 nm）。但是，細(xì)胞本身的綠色背景容易干擾成像效果。同時(shí)，在光照下， DFHBI極易發(fā)生從順式向反式異構(gòu)的轉(zhuǎn)化，使得Spinach 家族以及Broccoli 結(jié)合DFHBI 后光穩(wěn)定性差。針對(duì)此問題， Jaffrey 研究組[29]利用苯丙咪唑基團(tuán)取代DFHBI-1T 中的三氟甲基開發(fā)出一種新的DFHBI 衍生物，即苯并咪唑-3，5-二氟-4-羥基亞芐基咪唑啉酮（BI）， BI 與Broccoli 具有更高的親和力， Broccoli-BI 復(fù)合物在細(xì)胞中的亮度和光穩(wěn)定性顯著提高，其體外的光異構(gòu)化速率為0.008 s?1， 比Broccoli-DFHBI-1T 復(fù)合物的光異構(gòu)化速率（0.041 s?1）慢約5 倍。BI 的開發(fā)使在活體哺乳動(dòng)物細(xì)胞中對(duì)單個(gè)Broccoli 標(biāo)記的mRNA成像成為可能。

1.4 Mango

Mango適配體含有39個(gè)堿基，其熒光團(tuán)是噻唑橙（Thiazole orange， TO）衍生的熒光團(tuán)，如TO-生物素?zé)晒鈭F(tuán)（TO1-biotin）。Mango 與TO1-biotin的解離常數(shù)較低，表現(xiàn)出較高的親和力（Kd=3.2 nm）， 兩者結(jié)合后，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)達(dá)1100 倍[21]。Mango 還可與TO1-biotin 衍生物（TO3-biotin）結(jié)合，使其激發(fā)波長和發(fā)射波長分別紅移到637 和658 nm。此外， Mango-TO1 復(fù)合物具有很高的熒光強(qiáng)度，相同濃度下， Mango-TO1 比Spinach-DHFBI復(fù)合物的熒光強(qiáng)度高2倍以上[30]。雖然Mango的親和力強(qiáng)、亮度高，有利于應(yīng)用于活細(xì)胞中RNA的成像，但由于Mango分子本身可與G-四鏈體非特異性結(jié)合，在細(xì)胞成像中的背景響應(yīng)較高[31]。

1.5 Corn

Corn是一種黃色熒光蛋白模擬RNA，只含有28 個(gè)堿基[22]， Corn 與3，5-二氟-4-羥基亞芐基咪唑啉酮-2-肟（DFHO）特異性結(jié)合后，體系熒光可增強(qiáng)1000 倍以上[22]，并且Corn-DFHO 結(jié)合后形成一種黃色熒光復(fù)合物，細(xì)胞成像背景低。光照10 s 后仍然具有很強(qiáng)的熒光強(qiáng)度，具有較好的光穩(wěn)定性，并且無明顯的細(xì)胞毒性，可用于活細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄效率的定量分析[22]。相比之下， Spinach 或Broccoli-DFHBI 復(fù)合物在200 ms 光照下的熒光損失已經(jīng)超過50%。此外， Spinach 或Broccoli 與DFHBI 或DFHBI-1T 以1∶1 的比例結(jié)合，而Corn 與DFHO 以2∶1 的比例結(jié)合， DFHO 恰可夾在兩個(gè)同形G-四鏈體中間，形成頭對(duì)頭的結(jié)構(gòu)，從而增強(qiáng)DFHO 的熒光強(qiáng)度[32]。雖然Corn-DFHO 的光穩(wěn)定性好，能初步用于定量檢測RNA 水平，但Corn 的二聚化結(jié)構(gòu)不便于細(xì)胞中mRNA 的標(biāo)記和成像，這也在一定程度上限制了其進(jìn)一步應(yīng)用。

1.6 Pepper

Pepper適配體是通過SELEX 技術(shù)體外篩選得到的46 個(gè)堿基的RNA 序列，其特異性熒光團(tuán)為（（4-（（2-羥乙基）（甲基）氨基）-亞芐基）-氰基苯乙腈）（HBC），激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為485 和530 nm[20]，HBC的系列衍生物與Pepper 結(jié)合后可發(fā)射多種波長的熒光（其發(fā)射波長可從485 nm 調(diào)至620 nm， 顏色從青色到紅色），強(qiáng)度高，光學(xué)性能穩(wěn)定。此外，細(xì)胞中存在天然識(shí)別G-四鏈體的核酸降解酶，在一定程度上會(huì)影響基于G-四鏈體折疊的RNA 示蹤，與大多數(shù)RNA 適配體（Mango、Spinach 和Broccoli 等）不同， Pepper 的三級(jí)結(jié)構(gòu)中不包含G-四鏈體，而是采用了一種全新的RNA 折疊構(gòu)象，這為功能性RNA 示蹤帶來更多的可能[33]。Pepper 熒光適配體結(jié)合相應(yīng)的熒光團(tuán)亮度高且穩(wěn)定，無論是在體外檢測還是活細(xì)胞內(nèi)成像方面均具有出色的表現(xiàn)，可用于不同豐度的功能性RNA 的示蹤研究，而不影響其空間分布和動(dòng)態(tài)變化。

1.7 其它適配體

除了基于熒光團(tuán)的RNA 熒光適配體之外，還有另一種類型適配體，即主要基于熒光團(tuán)-猝滅劑的復(fù)合物。熒光團(tuán)與猝滅劑相距較近時(shí)，熒光猝滅，但當(dāng)熒光團(tuán)或猝滅劑與其相應(yīng)的RNA 適配體結(jié)合時(shí)抑制了接觸猝滅，從而使熒光團(tuán)的熒光恢復(fù)。例如，二硝基苯胺（Dinitroaniline， DN）是一種常用的猝滅劑，而硫酸羅丹明B（Sulfate Rhodamine B， SRB 2）和四甲基羅丹明（Tetramethyl Rhodamine， TMR）可作為DN 的相應(yīng)熒光團(tuán)。DN-SR 復(fù)合物在溶液中游離時(shí)熒光顯著降低，當(dāng)在體系中加入SRB 2 的RNA 適配體后，適配體與SRB 2 結(jié)合，抑制了DN 對(duì)SRB 2 的接觸淬滅，從而可使體系的熒光恢復(fù)[34]。此外，也可利用類似原理，將DN 與不同的熒光團(tuán)，如德克薩斯紅（Texas red， TR）、羅丹明綠（Rhodamine green， RG）和四甲基羅丹明（Tetramethyl-Rhodamine， TMR）偶聯(lián)，通過DN 與相應(yīng)的RNA 適配體結(jié)合，實(shí)現(xiàn)熒光團(tuán)的熒光恢復(fù)，可用于多目標(biāo)物的多色成像[35]。

2 RNA熒光適配體的應(yīng)用

由于具有高信背比和易于編程的特點(diǎn)， RNA 熒光適配體被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞外檢測以及生物成像。本節(jié)主要介紹RNA 熒光適配體在細(xì)胞外檢測及細(xì)胞成像方面的應(yīng)用研究進(jìn)展。

2.1 RNA熒光適配體在體外檢測中的應(yīng)用

2.1.1 核酸的檢測

基于RNA熒光適配體檢測核酸的傳感器檢測原理主要包括：（1）目標(biāo)RNA 與相應(yīng)的核酸探針互補(bǔ)配對(duì)后，產(chǎn)生發(fā)射熒光信號(hào)的RNA 適配體；（2）靶分子引發(fā)的核酸反應(yīng)形成RNA 適配體結(jié)構(gòu)，與相應(yīng)的熒光團(tuán)結(jié)合形成適配體-熒光團(tuán)復(fù)合物，從而產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光信號(hào)。

MiRNAs 可作為疾病診斷的生物標(biāo)志物用于基因治療或藥物治療[36-37]。Ying 等[38]開發(fā)了基于RNA熒光適配體的多目標(biāo)物檢測傳感器（圖3A），首先分別設(shè)計(jì)兩個(gè)與目標(biāo)miRNA 序列部分互補(bǔ)的DNA探針，其中一個(gè)探針含有與T7 啟動(dòng)子序列雜交的序列，而第二個(gè)探針作為RNA 轉(zhuǎn)錄的模板，可以體外轉(zhuǎn)錄合并不同長度的RNA 適配體互補(bǔ)序列。目標(biāo)miRNA 存在時(shí)，兩個(gè)探針與目標(biāo)物結(jié)合，在DNA 連接酶和T7 RNA 聚合酶的作用下，發(fā)生體外轉(zhuǎn)錄形成大量的RNA 適配體，隨后結(jié)合相應(yīng)的小分子生色團(tuán)并增強(qiáng)其熒光，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的信號(hào)放大。此外，通過設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)錄不同的適配體-熒光團(tuán)，如Brocoli-DFHBI 和MGA-MG，也可實(shí)現(xiàn)miR-21 和miR-141 的同時(shí)檢測。

李景虹研究組[ 39]開發(fā)了一種基于熒光RNA 適配體的級(jí)聯(lián)轉(zhuǎn)錄放大傳感器，用于特異性檢測miRNA。如圖3B 所示， miRNA 與模板1 結(jié)合，在聚合酶的作用下發(fā)生聚合反應(yīng)，形成雙鏈DNA-RNA 結(jié)構(gòu)，通過切割酶特異性識(shí)別和切割，釋放大量單鏈DNA，該單鏈DNA 與模板2 中的T7 啟動(dòng)子序列雜交，觸發(fā)體外轉(zhuǎn)錄并形成串聯(lián)的Spinach 序列。同時(shí)，釋放單鏈DNA 后的雙鏈DNA-RNA 結(jié)構(gòu)可進(jìn)一步聚合，剪切并釋放更多的單鏈DNA，繼續(xù)結(jié)合模板2 并轉(zhuǎn)錄形成Spinach 適配體，增強(qiáng)小分子熒光團(tuán)DFHBI熒光強(qiáng)度，從而實(shí)現(xiàn)miRNA 的高靈敏分析。RNA 熒光適配體還可應(yīng)用于病毒核酸的檢測， Yoon 等[40]開發(fā)了基于Mango 適配體和分開的T7 啟動(dòng)子介導(dǎo)的等溫轉(zhuǎn)錄放大技術(shù)，通過一步法，即可在30 min 內(nèi)檢測新冠病毒（SARS-CoV-2）及其變種（圖3C）。

2.1.2 其它目標(biāo)物的檢測

Ying 等[41]開發(fā)了一種高靈敏度的前列腺特異性抗原（Prostate specific antigen， PSA）檢測技術(shù)（圖4A）。該技術(shù)將PSA 特異性識(shí)別抗體分別連接到兩條DNA 序列（一抗-DNA1 和二抗-DNA2）中，其中， DNA1 含有T7 啟動(dòng)子序列和連接序列， DNA2 含有Broccoli 適配體序列和連接序列。PSA 與抗體特異性結(jié)合后，形成一抗-PSA-二抗的免疫夾心結(jié)構(gòu)，從而拉近DNA1 和DNA2 的距離，在連接序列和連接酶的作用下， DNA1與DNA2連接，引發(fā)體外轉(zhuǎn)錄形成大量Broccoli 適配體，在加入DFHBI-1T 后產(chǎn)生熒光，利用體系的熒光強(qiáng)度與PSA 濃度的關(guān)系，即可實(shí)現(xiàn)高靈敏檢測。Sheng 等[42]開發(fā)了基于鏈取代反應(yīng)的RNA 熒光適配體體外轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增方法，用于檢測食品和水樣中的食源性病原體（金黃色葡萄球菌）。該研究的關(guān)鍵為1 個(gè)模塊化的L-Broccoli 探針，該探針由兩部分組成：第一部分為擴(kuò)增模塊，用于介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增反應(yīng)，由啟動(dòng)子區(qū)域和Broccoli轉(zhuǎn)錄模板組成；第二部分是識(shí)別模塊，在金黃色葡萄球菌存在時(shí)，金黃色葡萄球菌適配體（SA31）與該細(xì)菌特異性結(jié)合，引起識(shí)別模塊的鏈取代反應(yīng)，促進(jìn)L-Broccoli 探針重排和延伸，從而形成Broccoli適配體的轉(zhuǎn)錄模板，在RNA體外轉(zhuǎn)錄試劑盒的作用下，轉(zhuǎn)錄生成大量Broccoli適配體的G-四鏈體結(jié)構(gòu)，為DFHBI-1T提供結(jié)合位點(diǎn)，增強(qiáng)其熒光，實(shí)現(xiàn)了對(duì)金黃色葡萄球菌的高靈敏檢測。

除用于核酸和蛋白質(zhì)檢測外， RNA 熒光適配體也被用于小分子以及金屬離子的檢測。Xu 等[43]將Spinach 2 和核糖開關(guān)組合在一起，構(gòu)建出一種能探測多種二價(jià)金屬離子（鐵、錳、鈷、鎳和鋅）的熒光探針（圖4B），該探針在識(shí)別二價(jià)金屬離子后，會(huì)發(fā)生構(gòu)象變化，形成一個(gè)新的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)中含有Spinach 2 序列，可與DFHBI-1T 熒光團(tuán)結(jié)合并產(chǎn)生熒光。Lucks 研究組[44]開發(fā)了一種由配體介導(dǎo)的體外轉(zhuǎn)錄策略，用于水中污染物的檢測（圖4C）。該系統(tǒng)由三部分組成：RNA 聚合酶、變構(gòu)蛋白轉(zhuǎn)錄因子和DNA 轉(zhuǎn)錄模板。目標(biāo)污染物可誘導(dǎo)系統(tǒng)體外轉(zhuǎn)錄生成Broccoli，并在結(jié)合相應(yīng)的熒光團(tuán)后產(chǎn)生熒光信號(hào)。此外，該體系具有可冷凍干燥、便于存儲(chǔ)和分配的優(yōu)勢(shì)，已成功用于市政供水中抗生素、小分子和金屬離子的檢測，在水質(zhì)監(jiān)測方面具有很大的應(yīng)用潛力。第二信使分子環(huán)二鳥苷酸（Cyclic di-GMP，c-di-GMP）是在細(xì)菌生理活動(dòng)中協(xié)調(diào)一系列通路的關(guān)鍵調(diào)控因子，在許多致病微生物中，由c-di-GMP 介導(dǎo)的復(fù)雜信號(hào)網(wǎng)絡(luò)可幫助細(xì)菌適應(yīng)在侵染宿主細(xì)胞過程中急劇變化的復(fù)雜環(huán)境。Wang 等[45]開發(fā)了一種基于Spinach 的c-di-GMP 的二代生物傳感器，能夠檢測亞納摩爾濃度的c-di-GMP，并可在厭氧條件下對(duì)活細(xì)胞中的c-di-GMP 進(jìn)行測量。

基于RNA 熒光適配體的傳感器還可用于檢測人體細(xì)胞內(nèi)的靶標(biāo)，解析活細(xì)胞的生理過程和信號(hào)傳導(dǎo)通路。目前， 大部分RNA 熒光適配體含有G-四鏈體結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)可被細(xì)胞解旋酶特異性水解，導(dǎo)致RNA 解旋或降解，從而限制了含G-四鏈體結(jié)構(gòu)的RNA 熒光適配體構(gòu)建的傳感器在活細(xì)胞中的應(yīng)用。基于此， Chen 等[46]使用不含G-四鏈體結(jié)構(gòu)的Pepper 熒光適配體， 開發(fā)了一系列基于Pepper 的生物傳感器， 用于監(jiān)測活細(xì)胞中的內(nèi)源小分子代謝物、外源藥物、蛋白質(zhì)和金屬離子等多種靶標(biāo)。

2.2 RNA熒光適配體在成像中的應(yīng)用

2.2.1蛋白質(zhì)的成像

Peppers適配體能夠結(jié)合不同HBC 衍生物并發(fā)射不同顏色的熒光，并且熒光強(qiáng)度高、穩(wěn)定性好，可在不影響其轉(zhuǎn)錄、定位、翻譯和降解等正常代謝的情況下，對(duì)活細(xì)胞中不同的RNA 進(jìn)行成像[20]。研究者將Pepper 與熒光蛋白聯(lián)用，同時(shí)檢測了Pepper 標(biāo)記的信使RNA 及其翻譯的融合熒光蛋白的水平，利用雙光子共聚焦顯微鏡（Two-photon confocal microscopy）實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞中RNA 的動(dòng)態(tài)追蹤，并首次實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模的活體單細(xì)胞mRNA 的翻譯調(diào)控分析，這為腫瘤的診療提供了一種全新的思路和方法。除Pepper 適配體外，由于Corn 與DFHO 結(jié)合后產(chǎn)生黃色熒光且光穩(wěn)定性好， Corn 也被成功應(yīng)用于活細(xì)胞內(nèi)聚合酶Ⅲ（Polymerase Ⅲ， Pol Ⅲ）轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光成像，以此研究蛋白（Mammalian target of rapamycin，mTOR）抑制劑對(duì)Pol Ⅲ的轉(zhuǎn)錄抑制[22]。

四磷酸鳥苷和五磷酸鳥苷（（p）ppGpp）作為一種重要的生物信號(hào)分子，可在應(yīng)激環(huán)境中調(diào)節(jié)細(xì)菌的生存狀態(tài)。Sun 等[47]結(jié)合（p）ppGpp 特異性適配體與RNA 熒光適配體Broccoli，設(shè)計(jì)了一種能夠直接監(jiān)測細(xì)胞（p）ppGpp 積累的傳感器。（p）ppGpp 與ppGpp 特異性適配體區(qū)域結(jié)合前，體系的熒光較弱，當(dāng)（p）ppGpp 與適配體區(qū)域特異性結(jié)合后，轉(zhuǎn)導(dǎo)序列雜交同時(shí)促進(jìn)Broccoli 適配體的折疊，激發(fā)DFHBI-1T的熒光（圖5），該研究首次實(shí)現(xiàn)了（p）ppGpp 在活細(xì)胞中的直接成像，為研究細(xì)胞中（p）ppGpp 的生物合成與積累的動(dòng)態(tài)變化提供了依據(jù)。

2.2.2 核酸的成像

Wang 等[48]開發(fā)了一種適配體（Broccoli 和Spinach 2）引發(fā)的熒光互補(bǔ)系統(tǒng)，用于細(xì)胞內(nèi)mRNA 的成像。如圖6A 所示，該系統(tǒng)借鑒了基于熒光蛋白的雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)，依靠RNA 之間的互補(bǔ)配對(duì)介導(dǎo)RNA 適配體產(chǎn)生熒光，實(shí)現(xiàn)了對(duì)宮頸癌細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞中常見的3 種編碼骨架蛋白的mRNA 的原位成像。該系統(tǒng)具有信號(hào)背景低、響應(yīng)快的優(yōu)勢(shì)，為哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)源性RNA 的定量監(jiān)測和實(shí)時(shí)成像提供了有效工具。南京大學(xué)陳洪淵院士和徐靜娟教授研究組[49]基于RNA 熒光適配體Corn 在亮度和光穩(wěn)定性上的優(yōu)異性質(zhì)，開發(fā)了新型目標(biāo)物誘導(dǎo)RNA 探針精確自組裝的方法。該研究在胞內(nèi)環(huán)境下采用兩段RNA 探針特異性識(shí)別目標(biāo)miRNA 后，可自組裝形成頭對(duì)頭構(gòu)型G-四鏈體Corn 的空間結(jié)構(gòu)，從而激發(fā)DFHO 熒光增強(qiáng)的原理，構(gòu)建了生物體系內(nèi)miRNA 的動(dòng)態(tài)監(jiān)測新策略（圖6B）。該探針易合成，可通過改變識(shí)別位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)其它RNA 目標(biāo)物的檢測，背景干擾小且抗光漂白能力強(qiáng)，為RNA/RNA 相互作用的體內(nèi)可視化分析和腫瘤等重大疾病的發(fā)生機(jī)理探究、早期診斷和制定精準(zhǔn)治療方案等提供了技術(shù)支撐。但是，對(duì)目標(biāo)物而言，上述兩種方法始終為“一對(duì)一”的信號(hào)生成方式，應(yīng)用于細(xì)胞或活體中低豐度的內(nèi)源性RNA 分析時(shí)具有一定的局限性。

為了實(shí)現(xiàn)低豐度目標(biāo)物的成像， You 研究組[ 50]開發(fā)了一種基于基因編碼RNA 催化發(fā)夾組裝（Catalytic hairpin assembly， CHA）電路，用于活細(xì)胞內(nèi)RNA 的靈敏成像。通過基因編碼技術(shù)，細(xì)胞可自動(dòng)轉(zhuǎn)錄生成RNA 發(fā)夾H1 和H2。其中， Broccoli 適配體被劈裂成兩部分，分別連接在H1 和H2 上。當(dāng)目標(biāo)RNA 分子存在時(shí)，一個(gè)目標(biāo)RNA 分子可催化觸發(fā)多個(gè)H1 和H2 發(fā)生CHA 放大反應(yīng)，生成十到上百個(gè)Broccoli，結(jié)合DFHBI-1T 后產(chǎn)生熒光信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)示蹤低豐度目標(biāo)RNA 的目的（圖6C）。然而，該方法無法實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的原位在線監(jiān)測，因此，該研究組[51]進(jìn)一步開發(fā)了原位基因雜交擴(kuò)增（In situ genetichybridization amplification technique， INSIGHT）方法，用于活細(xì)胞內(nèi)RNA 的原位和高靈敏度成像。在目標(biāo)物RNA不存在的情況下，兩種RNA 發(fā)夾（H1 和H2）在亞穩(wěn)態(tài)下共存，加入目標(biāo)RNA 后， H1 發(fā)夾打開，并與H2 發(fā)生雜交鏈反應(yīng)（Hybridization chain reaction， HCR），生成多個(gè)H1 和H2 的HCR 的產(chǎn)物，從而組裝生成多個(gè)Broccoli 適配體，產(chǎn)生放大的熒光信號(hào)（圖6D）。由于組裝形成的Broccoli 與目標(biāo)RNA 相連，該方法可用于定位和追蹤細(xì)胞內(nèi)的RNA 目標(biāo)分子，為活細(xì)胞內(nèi)生物分子傳感和定位提供了新思路。

2.2.3 小分子化合物的成像

RNA熒光適配體還可用于細(xì)胞中小分子化合物成像，如硫胺素焦磷酸（Thiamine pyrophosphate，TPP）[52]、Ag+[53]、四環(huán)素和環(huán)二鳥苷酸（Cyclic di-GMP）[9]。將小分子化合物特異性適配體或結(jié)合序列與RNA 熒光適配體融合而設(shè)計(jì)探針，探針與小分子結(jié)合引起構(gòu)象變化，形成正確的熒光適配體構(gòu)象，從而實(shí)現(xiàn)小分子化合物成像。You等[52]將Spinach序列引入TPP的核糖開關(guān)并設(shè)計(jì)探針，探針結(jié)合TPP后轉(zhuǎn)導(dǎo)形成Spinach 的H1 莖環(huán)結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)DFHBI 熒光，基于此原理實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞中TPP的熒光成像（圖7A）。Yu 等[53]通過加入Ag⁺后形成胞嘧啶-Ag⁺-胞嘧啶（C-Ag⁺-C）結(jié)構(gòu)，促進(jìn)Broccoli 的正確折疊（圖7B），測量了Ag+的細(xì)胞通量和抗菌效果。

3 結(jié)論與展望

RNA 熒光適配體因其設(shè)計(jì)靈活性和可編程性受到廣泛關(guān)注，在體外檢測和生物成像領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。本文總結(jié)了RNA 熒光適配體及其相應(yīng)熒光團(tuán)的特點(diǎn)和發(fā)展歷程，以及近年來在細(xì)胞外檢測和成像領(lǐng)域的研究進(jìn)展。與熒光蛋白相比， RNA 熒光適配體的發(fā)展仍處于起步階段，未來的發(fā)展方向主要包括以下方面：（1）開發(fā)發(fā)光范圍覆蓋近紅外至紅外區(qū)的新型RNA 熒光適配體，并在一定程度上提高其亮度和穩(wěn)定性，從而減少細(xì)胞或活體成像的本底背景；（2）除Pepper 外，大多數(shù)RNA 熒光適配體結(jié)構(gòu)為G-四鏈體，易受細(xì)胞內(nèi)RNA 酶的影響，應(yīng)進(jìn)一步開發(fā)不依賴于G-四鏈體且具有高特異性的RNA 熒光適配體，提高其折疊效率，以適應(yīng)活細(xì)胞內(nèi)多目標(biāo)物檢測和成像的需求；（3）將RNA適配體與超分辨和單分子成像技術(shù)結(jié)合，提高其在傳感檢測和生物成像中的靈敏度，實(shí)現(xiàn)多目標(biāo)物的檢測，以及基因和蛋白質(zhì)組的分析和實(shí)時(shí)監(jiān)控?？傊行Ю肦NA 熒光適配體，可促進(jìn)生命科學(xué)以及相關(guān)學(xué)科的進(jìn)步，解決疾病診療過程中的難題。