激光誘導(dǎo)擊穿光譜定量分析全血中的鋰元素

關(guān)鍵詞 激光誘導(dǎo)擊穿光譜；血液；鋰元素；定量分析；偏最小二乘法

血液快速檢測(cè)是藥物代謝監(jiān)測(cè)的重要方式之一[1]。鋰（Li）鹽是一種常用的情緒穩(wěn)定劑，被廣泛用于雙向情感障礙的臨床治療。然而， Li 鹽的治療用藥劑量和中毒量相接近，且副作用強(qiáng)，不同患者個(gè)體對(duì)藥物的敏感差異較大，在臨床中很難把控用藥劑量[2]。因此，持續(xù)準(zhǔn)確地監(jiān)測(cè)患者血鋰水平，對(duì)及時(shí)發(fā)現(xiàn)Li中毒、指導(dǎo)臨床有效用藥及確保用藥安全具有至關(guān)重要的作用。當(dāng)前，血鋰水平的臨床檢測(cè)方法主要有原子發(fā)射光譜法（Atomic emission spectrometry， AES）和原子吸收光譜法（Atomic absorption spectroscopy，AAS）[3]。這些方法需要對(duì)全血臨床樣本進(jìn)行酸化分離及化學(xué)消解，普遍存在分析流程復(fù)雜、檢測(cè)實(shí)驗(yàn)耗時(shí)長(zhǎng)等問(wèn)題，對(duì)血鋰含量的快速、便捷監(jiān)測(cè)能力不足[4]。因此，為確保患者用藥安全有效，及時(shí)掌握血鋰代謝水平，研發(fā)更加簡(jiǎn)單快速的血鋰含量檢測(cè)方法至關(guān)重要。

激光誘導(dǎo)擊穿光譜（Laser-induced breakdown spectroscopy， LIBS）是一種基于激光剝蝕產(chǎn)生等離子體發(fā)射光譜的元素分析技術(shù)，被廣泛用于食品檢測(cè)、能源檢測(cè)[5]、海洋探測(cè)[6]和生物醫(yī)學(xué)[7]等領(lǐng)域，具有分析速度快、無(wú)需復(fù)雜樣本預(yù)處理等顯著特點(diǎn)[8]，可實(shí)現(xiàn)低取樣量條件下的實(shí)時(shí)分析[9]。對(duì)血液基質(zhì)的快速檢測(cè)是目前該技術(shù)的研究熱點(diǎn)之一，主要集中在對(duì)血液中腫瘤標(biāo)志物和血源性疾病的檢測(cè)識(shí)別[10]。Cheung 等[11]首次采用LIBS 測(cè)定了人血細(xì)胞中的K 和Na，檢測(cè)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于9%；Chu 等[12]采用LIBS 對(duì)不同患者血液樣本進(jìn)行直接分析，結(jié)合極限學(xué)習(xí)機(jī)和隨機(jī)森林算法診斷鼻咽癌，準(zhǔn)確率高達(dá)98.33%；Berlo 等[13]采用LIBS 和機(jī)器學(xué)習(xí)相結(jié)合區(qū)分SARS-CoV-2 陽(yáng)性和非陽(yáng)性的供體血清，準(zhǔn)確率達(dá)到95%。Feng 等[14]采用便攜式LIBS 儀器快速定量分析血清中K、Na 和Ca 等電解質(zhì)元素，具有極佳的線性預(yù)測(cè)精度，進(jìn)一步證實(shí)了LIBS 儀器是實(shí)時(shí)臨床檢測(cè)的優(yōu)秀工具。LIBS 技術(shù)和機(jī)器學(xué)習(xí)算法相結(jié)合，可快速獲得復(fù)雜基質(zhì)光譜數(shù)據(jù)和準(zhǔn)確的定量結(jié)果，從而提高對(duì)疾病發(fā)展的診斷能力，輔助臨床治療。

本研究建立了一種無(wú)需對(duì)臨床血液樣品進(jìn)行復(fù)雜預(yù)處理的血鋰濃度LIBS 快速檢測(cè)新方法，在分析過(guò)程中無(wú)需離心分離，可直接對(duì)全血進(jìn)行分析，結(jié)合偏最小二乘法（Partial least" squares， PLS）建立Li 元素的定量模型，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)快速準(zhǔn)確預(yù)測(cè)未知樣品的血鋰水平，為未來(lái)臨床床旁檢測(cè)提供了一種簡(jiǎn)便高效的新方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LIBS-Tracer 便攜式激光誘導(dǎo)擊穿光譜儀（成都艾立本科技有限公司）；PinAAcle 900T 原子吸收光譜儀（美國(guó)PerkinElmer 公司）。采血卡（FAT 標(biāo)準(zhǔn)卡，英國(guó)Whatman 公司）；鋰標(biāo)準(zhǔn)溶液（GSB 04-1734-2004， 1000 μg/mL）；HNO₃（蘇州晶銳化學(xué)有限公司）。雙向情感障礙患者血液樣本由四川大學(xué)華西醫(yī)院提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)裝置

本研究所使用的儀器為便攜式激光誘導(dǎo)擊穿光譜儀，其工作原理如圖1所示。該儀器采用Nd：YAG激光器，波長(zhǎng)為1064 nm， 脈沖重復(fù)頻率為1 Hz， 脈沖能量為100 mJ。儀器在180～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)能提供0.1 nm的光譜分辨率。樣品放置在XYZ三維樣品臺(tái)上，通過(guò)激光剝蝕產(chǎn)生等離子體，光纖探頭接收等離子體中的光譜信號(hào)并傳輸至光譜儀，光譜儀通過(guò)控制系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)外觸發(fā)同步。光譜儀延遲時(shí)間設(shè)置為1.5 μs。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

本研究對(duì)不經(jīng)分離消解等預(yù)處理的全血樣本進(jìn)行分析，隨機(jī)抽取45 例雙向感情障礙患者的血液樣本為研究對(duì)象，所有患者均根據(jù)醫(yī)囑用藥，用藥時(shí)間均在1 個(gè)月以上。抽取患者EDTA-K2 抗凝靜脈血，取血時(shí)間為末次服藥后12 h， 采用臨床常用的血卡為基底材料，將血卡粘貼在四氟乙烯底板上制成樣品板。取2.0 μL 血液樣品滴加在血卡上，用鹵素?zé)艨焖俸娓桑ā? min）， 干燥后形成圓點(diǎn)狀血斑，采集血斑樣品表面光譜數(shù)據(jù)。為減小激光能量波動(dòng)對(duì)定量分析結(jié)果的影響，每個(gè)譜圖分別由5 次重復(fù)測(cè)量的光譜平均所得，每個(gè)血斑樣品均隨機(jī)選取65 個(gè)不同位點(diǎn)的光譜分析。采用AAS 標(biāo)準(zhǔn)方法分別分析全血樣本和經(jīng)分離處理后的血漿樣本，并將結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。樣品制備和實(shí)驗(yàn)過(guò)程如圖2 所示。本研究符合《赫爾辛基宣言》，并獲得了四川大學(xué)華西醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 構(gòu)建定量模型的參數(shù)優(yōu)化

在全血樣本的LIBS 光譜圖（圖3）中，血液樣本中存在的Mg、Ca、K、Na 和Li 等元素的特征譜線清晰可見(jiàn)， LIBS 對(duì)全血樣本的定性分析能力突出。然而， Li 位于670.776和670.791 nm 處的兩條特征發(fā)射譜線自身相互重疊，位于610.354 和610.365 nm 處的另外兩條特征譜線與Ca 位于610.272 nm 處的特征譜線相互干擾，這些光譜重疊會(huì)導(dǎo)致單變量線性回歸定量分析模型難以獲得理想的定量分析結(jié)果，而多變量回歸模型考慮了多個(gè)解釋變量之間的相互關(guān)系，綜合考慮了多個(gè)因素對(duì)響應(yīng)變量的影響，減少了由于忽略其它潛在因素而導(dǎo)致的誤差，更全面地捕捉了系統(tǒng)的復(fù)雜性和多樣性，因此，本研究以605～675 nm 光譜帶作為輸入，構(gòu)建Li 元素的PLS 多變量回歸模型，有望更好地適應(yīng)血液復(fù)雜基質(zhì)下Li元素分析的特殊情況，提供更可靠的分析結(jié)果。PLS 算法是在多元回歸和主成分分析的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種分析方法，尤其適用于小樣本分析，對(duì)多重共線性具有強(qiáng)魯棒性。在構(gòu)建PLS 定量分析模型時(shí)，隨機(jī)選擇30 組血液樣本的光譜數(shù)據(jù)作為訓(xùn)練集， 10 組血液樣本作為測(cè)試集，其余5 組作為驗(yàn)證集。驗(yàn)證集不參與模型的訓(xùn)練與優(yōu)化，只用于檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷亩糠治鲂Ч?/p>

PLS 算法的參數(shù)優(yōu)化對(duì)定量分析模型的性能提升至關(guān)重要，合適的參數(shù)能夠提高模型的準(zhǔn)確性和魯棒性。潛變量的數(shù)量是影響PLS 模型定量分析效果的關(guān)鍵因素，對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化可有效防止過(guò)擬合，提高模型的泛化能力。在低樣本量條件下，本研究選擇五折交叉驗(yàn)證方法進(jìn)行潛變量?jī)?yōu)化，通過(guò)計(jì)算交叉驗(yàn)證均方根誤差（Root mean square error of cross validation， RMSECV）后選擇最小值所對(duì)應(yīng)的數(shù)值確定最佳潛變量數(shù)。均方根誤差RMSEVi 和總的均方根誤差平均值RMSECV 的計(jì)算公式如下：

潛變量的數(shù)量在1～23范圍內(nèi)的Li元素含量PLS定量分析模型交叉驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)圖4，基于血漿樣品中Li元素含量所建立的PLS-血漿（PLS-plasma）LIBS模型和基于全血樣品中Li元素含量所建立的PLS-全血（PLS-whole blood）LIBS 模型均在潛變量數(shù)為6 時(shí)達(dá)到了最低的RMSECV 值（分別為0.5877 和0.5672），因此，在優(yōu)化PLS算法中選擇潛變量數(shù)為6。

2.2 定量分析模型的構(gòu)建及評(píng)估

分別以血漿中Li 元素含量為血鋰濃度定標(biāo)值構(gòu)建PLS-血漿模型和以全血中Li 元素含量為血鋰濃度定標(biāo)值構(gòu)建PLS-全血模型，所得到的定標(biāo)曲線如圖5所示。PLS-血漿模型的預(yù)測(cè)決定系數(shù)（R²）達(dá)到0.9923，PLS-全血模型的R²為0.9844。

為進(jìn)一步評(píng)估模型的準(zhǔn)確性和有效性，以預(yù)測(cè)均方根誤差（Root mean square error of prediction， RMSEP）和測(cè)試集的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative standard deviation， RSD）作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)模型預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行準(zhǔn)確性及精密度評(píng)價(jià)，其計(jì)算公式如下：

根據(jù)計(jì)算可知， PLS-血漿模型的RMSEP 值為0.204 μg/mL，定量分析結(jié)果的RSD為2.14%， R²為0.992；PLS-全血模型的RMSEP 值為0.728 μg/mL，定量分析結(jié)果的RSD 為3.45%， R²為0.984。以上結(jié)果表明，相較于PLS-全血模型， PLS-血漿模型具有更優(yōu)的R²、更低的RMSEP 以及更小的測(cè)試集樣品RSD。因此，基于血漿定標(biāo)值所建立的LIBS 模型對(duì)全血中Li 元素定量分析效果更佳，具有優(yōu)異的定量分析精度和穩(wěn)定性。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，血液樣本暴露在空氣中會(huì)發(fā)生氧化或分解，并且血液中的血細(xì)胞可能會(huì)隨著時(shí)間變化而發(fā)生凝聚或沉降，這些因素都會(huì)影響血液樣本的穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致不同時(shí)間內(nèi)樣品的分析結(jié)果有較大差異。

2.3 定量分析模型的應(yīng)用驗(yàn)證

選擇未參與PLS 定量分析模型訓(xùn)練的剩余5 組血液樣本，進(jìn)行定量分析模型的應(yīng)用性能驗(yàn)證，并將預(yù)測(cè)的Li 元素含量和AAS 標(biāo)準(zhǔn)方法的測(cè)量結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。由表1 可知，無(wú)論是PLS-血漿模型，還是PLS-全血模型，對(duì)血液中Li 元素濃度預(yù)測(cè)結(jié)果的誤差都較小，說(shuō)明PLS 模型在處理LIBS 數(shù)據(jù)時(shí)能夠準(zhǔn)確地分析樣本中Li 元素含量變化，具有較好的定量分析預(yù)測(cè)性能。本研究初步驗(yàn)證了LIBS 技術(shù)測(cè)定血液中Li 元素濃度的可行性，在后續(xù)工作中將繼續(xù)研究樣本中的特定特征，探索模型性能在不同樣本之間的差異，提高模型的泛化性和預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性。

3 結(jié)論

本研究以臨床血液樣本為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，在較低的取樣量條件下，通過(guò)LIBS技術(shù)結(jié)合PLS算法構(gòu)建了血鋰定量分析模型，并對(duì)比了基于血漿及全血兩種定標(biāo)值的模型差異。相較于當(dāng)前臨床所用的檢測(cè)技術(shù)，LIBS技術(shù)具有快速便捷的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，有望實(shí)現(xiàn)床旁檢測(cè)，在快速檢測(cè)血液中Li 元素含量方面具有良好的應(yīng)用前景。本研究為未來(lái)LIBS技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢測(cè)方面的應(yīng)用提供了參考，后續(xù)將深入對(duì)比不同定量分析算法的模型差異性，考慮不同實(shí)驗(yàn)條件和樣本處理方式對(duì)結(jié)果的影響，并結(jié)合更大樣本量的驗(yàn)證，進(jìn)一步提高LIBS技術(shù)在血液成分定量分析方面的可靠性和穩(wěn)定性，從而擴(kuò)大LIBS技術(shù)在臨床醫(yī)療中的應(yīng)用范圍。