基于磁性多壁碳納米管的磁性同相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定農(nóng)產(chǎn)品中22種真菌毒素

關鍵詞 真菌毒素；磁性多壁碳納米管；磁性固相萃取；超高效液相色譜-串聯(lián)質譜

真菌毒素（Mycotoxins）是各種產(chǎn)毒絲狀真菌在生長繁殖過程中產(chǎn)生的有毒次級代謝產(chǎn)物[1-2]。根據(jù)聯(lián)合國糧食農(nóng)業(yè)組織統(tǒng)計，全球超過25%的農(nóng)作物在生長、收獲、干燥和儲存期間受到不同真菌毒素的污染，造成數(shù)百億美元的經(jīng)濟損失[3-4]。目前，已知的真菌毒素有400 多種[5-6]，其中，黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮及單端孢霉烯族毒素是常見且危害較大的真菌毒素，具有致癌、致畸、致突變效應以及激素毒性和免疫抑制毒性等[7-8]。這些真菌毒素的化學性質多數(shù)較穩(wěn)定，很容易進入飼料和食物鏈中，對動物和人類健康造成嚴重危害[9-10]。因此，亟需建立能夠高效富集凈化且準確測定農(nóng)產(chǎn)品中多種真菌毒素的有效分析方法。

目前，真菌毒素的分析方法主要包括光電化學分析法[11-14]、免疫分析法[15-16]和儀器分析法[17-21]等。光電化學分析法和免疫分析法促進了真菌毒素快速檢測技術的發(fā)展，但其主要用于基于適配體的少數(shù)幾種真菌毒素的檢測，而且存在重復性不佳和抗干擾能力差等問題。研究表明，農(nóng)產(chǎn)品中同時存在的多種真菌毒素會在生物體內產(chǎn)生協(xié)同作用，導致聯(lián)合毒性疊加，極大地增大了人類健康的危險系數(shù)[22]。因此，對農(nóng)產(chǎn)品中的多種真菌毒素進行同時測定是非常重要和必要的。目前，超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法（UPLC-MS/MS）仍然是多種真菌毒素同時檢測最有效的技術方法。

農(nóng)產(chǎn)品樣品的基質成分復雜，并且真菌毒素在農(nóng)產(chǎn)品的污染狀況呈現(xiàn)出低水平、聯(lián)合毒性和分布不均勻等特點。因此，樣品前處理過程是UPLC-MS/MS 分析過程中必要且關鍵的步驟。目前，農(nóng)產(chǎn)品中真菌毒素的樣品前處理方法主要有免疫親和層析（IAC）[23]、液液萃?。↙LE）[24]、QuEChERS[25]、固相萃?。⊿PE）[26]和磁性固相萃?。∕SPE）[27]等。其中， IAC 前處理效率高，但是操作步驟繁瑣；LLE 需要較多的有機溶劑；QuEChERS 是應用較廣泛的前處理方法，但容易產(chǎn)生較高的基質效應，而且需要通過高速離心進行兩相分離，比較耗時；SPE 法操作過程復雜、耗時長且成本高。MSPE 是一種以磁性材料作為吸附劑的固相萃取方法，通過外部磁場即可實現(xiàn)吸附劑與樣品基質的高效分離，具有操作簡單快速、有機溶劑消耗少以及目標物回收率較高等優(yōu)點。

磁性納米吸附劑的設計是MSPE 前處理方法的關鍵。多壁碳納米管（Multi-walled carbon nanotubes，MWCNTs）具有較大的比表面積、豐富的π電子、獨特的中空和層狀結構以及豐富的官能團，已被成功應用于農(nóng)藥和抗生素的富集凈化[28-29]。目前，關于MWCNTs 用于MSPE 富集凈化真菌毒素的研究較少。本研究將Fe₃O₄ 納米顆粒引入到MWCNT 表面，采用共沉淀法制備Fe₃O₄-MWCNTs，將其作為MSPE 吸附劑，建立了簡單、高效和環(huán)保的前處理方法，結合UPLC-MS/MS 分析方法，實現(xiàn)了農(nóng)產(chǎn)品中常見的22 種真菌毒素的準確定量分析。對影響前處理效率的提取溶液、吸附劑類型、吸附劑用量和洗脫溶液類型進行了系統(tǒng)性優(yōu)化，對方法的線性范圍、靈敏度和精密度進行了驗證，并將其應用于實際樣品的分析。Fe₃O₄-MWCNTs 具有良好的富集凈化效果和磁分離特性，基于Fe₃O₄-MWCNTs 的MSPE 前處理方法為開發(fā)高效的樣品前處理技術提供了新思路，所建立的分析方法也為農(nóng)產(chǎn)品中真菌毒素質量安全監(jiān)測和控制提供了技術支撐。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters ACQUITY UPLC I-Class PLUS/XEVO TQ-S 超高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀（美國Waters 公司）；JEOL 2100 透射電子顯微鏡儀（日本Jeol 公司）；Nicolet iN10 紅外光譜儀（美國Thermo 公司）；Bruker D8Advance X 射線衍射儀（德國Bruker 公司）；Buchi-R-210 旋蒸蒸發(fā)儀（瑞士Buchi 公司）；恒溫水浴搖床（中國Labor Tech 公司）；Milli-Q 超純水儀（美國Mimpore 公司）；ME104E 電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Vortex Genie 2 渦旋儀（美國Scientific Industries 公司）；N-EVAP 氮吹儀（美國Organomation 公司）；pHS-3C 精密pH 計（上海雷磁公司）。

乙腈、甲醇和丙酮（色譜純，美國Thermo Fisher 公司）；甲酸和乙酸銨（色譜純，美國Sigma Aldrich公司）；FeCl₂·4H₂O（≥99%）、FeCl₃·6H₂O（≥99%）、NaOH（≥98%）和乙酸（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；不同類型碳納米管（中國科學院成都有機化學有限公司），包括MWCNTs（直徑8 nm，長度10～30 μm， 純度＞98%）、羥基多壁碳納米管（Hydroxylated multi-walled carbon nanotubes， MWCNTs-OH）、羧基多壁碳納米管（Carboxyl multi-walled carbon nanotubes， MWCNTs-COOH）和長多壁碳納米管（Multi-walled carbon nanotubes-2， MWCNTs-2，直徑8～15 nm、長度50 μm， 純度＞98%）；22 種真菌毒素標準品（純度＞98%，美國Sigma-Aldrich 公司），詳細信息見電子版文后支持信息表S1。各標準品用乙腈配制成1 mg/mL 的標準儲備溶液，于–20 ℃避光密封保存；混合標準工作溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2 實驗方法

1.2.1 Fe₃O₄-MWCNTs的制備

采用化學共沉淀法合成磁性多壁碳納米管（Fe₃O₄-MWCNTs）[30]。首先，將FeCl3·6H2O（0.810 g）和FeCl₂·4H₂O（0.309 g）溶解在300 mL 純水中，然后轉移到500 mL 三頸燒瓶中持續(xù)攪拌。取0.3 g MWCNTs加入到上述溶液中，然后向溶液中逐滴添加1% NaOH 溶液，調節(jié)pH=12，在80 ℃下劇烈攪拌60 min。整個反應過程在氮氣保護下進行。待溶液冷卻至室溫后，對黑色的沉淀產(chǎn)物（Fe3O4-MWCNTs）進行磁性收集，然后用純水洗滌數(shù)次，直到洗滌液的pH 值接近中性，于80 ℃下干燥10 h，研磨，備用。采用同樣的方法合成Fe₃O₄-MWCNTs-OH、Fe₃O₄-MWCNTs-COOH 和Fe₃O₄-MWCNTs-2。

1.2.2 樣品前處理

首先，稱取5.0 g 玉米粉（購于北京當?shù)啬吵校┲糜?0 mL 聚丙烯離心管中，加入25 mL 提取液（含1%乙酸的乙腈-水（80∶20， V/V）溶液），置于旋渦混合器中劇烈振蕩1 min，超聲提取20 min， 8000 r/min離心5 min。然后，取5 mL 上清液在50 ℃下氮吹至干，加入5 mL 乙腈-水（5∶95，V/V）復溶，加入20 mgFe₃O₄-MWCNTs，在旋渦混合器中劇烈振蕩吸附3 min 后磁分離，去除上清液。最后，加入10 mL 甲酸的丙酮溶液（0.5%， V/V）進行洗脫，磁分離，去除上清液后，在50 ℃下進行氮吹干燥，加入1 mL 乙腈-水（50∶50， V/V）復溶，過0.22 μm PTFE 濾膜至進樣瓶中，采用UPLC-MS/MS 分析檢測。

1.2.3 UPLC-MS/MS分析

采用Waters Acquity UPLC 系統(tǒng)進行液相分離， Acquity Cortecs UPLC C18 色譜柱（100 mm × 2.1 mm，1.6 μm）的柱溫為40 ℃， 樣品室溫度4 ℃， 進樣量5 μL， 流速為0.3 mL/min， 梯度洗脫（梯度洗脫程序見電子版文后支持信息表S2）。質譜分析使用Waters XEVO TQ-S質譜儀，采用電噴霧電離源（ESI），在多反應監(jiān)測（MRM）模式下進行檢測，根據(jù)分析物的結構特征選擇正離子或負離子模式（具體見電子版文后支持信息表S3）。參數(shù)如下：離子源溫度為150 ℃， 脫溶劑氣溫度為500 ℃， 毛細管電壓為2.5/–0.8 kV， 錐孔氣流速為150 L/h， 去溶劑氣體流量為1000 L/h。采用MassLynx v4.1和Targetlynx（Waters）進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 UPLC-MS/MS分析方法的評價

根據(jù)歐盟法規(guī)401/2006/EC[31]和歐洲SANCO 指南12571/2013[32]對所建立的方法進行驗證，包括基質效應（Matrix effect， ME）、線性范圍、檢出限（Limit of detection， LOD）、定量限（Limit of quantitation，LOQ）、準確度和精密度等。將22 種真菌毒素分為4 組進行回收率實驗：A 組（0.1～5 ng/g）：AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、OTA、OTB 和TEN；B 組（1～50 ng/g）：ALT、T-2、α-ZOL、α-ZAL、β-ZAL、β-ZOL、ZAN 和ZEN；C 組（5～250 ng/g）：3-ADON、15-ADON、FUS-X、HT-2 和DAS；D 組（10～500 ng/g）：DON 和NEO。

2 結果與討論

2.1 Fe3O4-MWCNTs復合材料的表征

通過透射電子顯微鏡（TEM）、X 射線衍射（XRD）和紅外光譜（FT-IR）考察了Fe₃O₄-MWCNTs 的形貌、結構和光譜特性。如圖1 所示， Fe₃O4 納米顆粒的平均直徑約為150 nm。采用共沉淀法將Fe₃O₄ 納米顆粒復合到MWCNTs 表面， Fe₃O₄-MWCNTs 和MWCNTs 的XRD 表征如圖2 所示。Fe₃O₄-MWCNTs 在25.80°附近的峰值歸因于MWCNTs，其它6 個典型的衍射峰分別位于31.04°、35.58°、43.15°、53.78°、57.25°和63.03°處，對應于（220）、（311）、（400）、（422）、（511）和（440）晶面，與JCPDS 文件（PDFNo.65/3107）中的數(shù)據(jù)庫一致，表明Fe3O4-MWCNTs 上的Fe₃O₄ 呈立方晶型。在Fe₃O₄-MWCNTs 中， Fe₃O₄和MWCNT 的峰共存，表明Fe₃O₄-MWCNTs 被成功制備[33]。

Fe₃O₄-MWCNTs 的FT-IR 光譜如圖3所示，位于3420、1735 和1620 cm^–1 處的峰分別歸屬于—OH、—C=O 和—COOH 的拉伸振動， 1381 和1173 cm^–1 處的峰歸屬于O—H 的彎曲振動和C—O 的拉伸振動， 582 cm^–1 處的峰歸屬于Fe—O[34]。以上結果表明， Fe₃O₄ 吸附在MWCNTs 表面， Fe₃O₄-MWCNTs 納米材料被成功制備。

2.2 前處理方法的優(yōu)化

通過樣品前處理過程能夠有效富集目標物，減少樣品的基質效應干擾，顯著提高方法的準確度和靈敏度，是建立靈敏且高效的方法的基礎和前提。對影響前處理富集凈化效率的提取溶液類型、吸附劑類型、吸附劑用量和洗脫溶液類型進行了系統(tǒng)性優(yōu)化，在優(yōu)化樣品制備過程中，采用外標基質匹配法計算回收率。

2.2.1 提取溶液類型的優(yōu)化

提取溶液是影響前處理效率的首要因素。研究表明，乙腈-水混合液是常用的真菌毒素分析提取溶液，在提取溶液中加入適量的酸可以提高提取效率[25，33]。Wang 等[35]研究表明，在提取溶液中加入檸檬酸可以螯合重金屬，提高真菌毒素的回收率。Myresiotis 等[36]研究表明，在提取溶劑中加入1%乙酸可以提高AFs、TEN、DON、HT-2 和T-2的回收率。因此，對提取溶劑中酸的類型和用量（0%、1%、3%乙酸和10 mmol/L 檸檬酸）進行了優(yōu)化。研究結果表明，含1%乙酸的乙腈-水（80∶20，V/V）溶液對22 種目標真菌毒素的提取效率最高（72.3%～109.8%），隨著乙酸濃度增加，提取溶液中的基質干擾物增加將導致回收率降低，而添加檸檬酸并不能提高大多數(shù)目標真菌毒素的回收率（見電子版文后支持信息圖S1）。因此，本研究選擇含1%乙酸的乙腈-水（80∶20，V/V）溶液作為提取溶液。

2.2.2 富集凈化材料類型的優(yōu)化

吸附材料的選擇在MSPE 樣品前處理過程中具有重要意義。MWCNTs 的中空管狀結構具有質量密度小、比表面積大、氫鍵和π-π堆積作用較強等優(yōu)點，對復雜基質具有很好的富集凈化性能，而不同基團修飾的MWCNTs 富集凈化效果不同。本研究考察了不同類型磁性碳納米管的MSPE 前處理富集凈化效率，包括Fe₃O₄-MWCNTs、Fe₃O₄-MWCNTs-OH、Fe₃O₄-MWCNTs-COOH 和Fe₃O₄-MWCNTs-2。結果表明， Fe₃O₄-MWCNTs 的富集凈化效果最好，對22 種目標真菌毒素的回收率為72.3%～109.8%（見電子版文后支持信息圖S2）。樣品經(jīng)Fe₃O₄-MWCNTs-OH、Fe₃O₄-MWCNTs-COOH 和Fe₃O₄-MWCNTs-2 富集凈化后，目標真菌毒素的回收率分別為42.2%～139.2%、30.5%～142.3%和20.3%～142.9%，這可能是由于MWCNTs-OH、MWCNTs-COOH 和MWCNTs-2 表面的羥基和羧基等活性基團與基質干擾物表面的氨基和羰基相互作用導致基質干擾增強，回收率降低。因此，本研究選擇Fe₃O₄-MWCNTs 作為MSPE 樣品前處理的富集凈化材料。

2.2.3 Fe₃O₄-MWCNTs用量的優(yōu)化

考察了吸附材料Fe₃O₄-MWCNTs 的用量對目標真菌毒素回收率的影響。隨著Fe₃O₄-MWCNTs 用量從10 mg 增至20 mg， 22 種目標真菌毒素的回收率從14.7%～102.5%增至72.3%～109.8%；但是，當Fe₃O₄-MWCNTs 用量增至30 mg 時，目標真菌毒素的回收率反而降低，這是由于過量的Fe₃O₄-MWCNTs 會吸附基質干擾成分，導致目標真菌毒素回收率降低（見電子版文后支持信息圖S3）。因此，確定在MSPE樣品前處理中，F(xiàn)e₃O₄-MWCNTs 的用量為20 mg。

2.2.4 洗脫溶液類型的優(yōu)化

在MSPE 前處理過程中，解吸溶液可以破壞π-π作用、氫鍵和分子間作用力而解吸目標分析物[37]。乙腈、甲醇和丙酮是最常用的解吸溶劑，在有機溶劑中加入甲酸可以提高其解吸性能[38-39]。考察了含0.5%（V/V）甲酸的乙腈、甲醇和丙酮對22種目標真菌毒素的洗脫效果，結果表明，采用含0.5%（V/V）甲酸的丙酮溶液進行解吸， 22種目標真菌毒素的回收率最好（72.3%～109.8%），而經(jīng)乙腈和甲醇洗脫后，真菌毒素的回收率低于40%（圖4）。因此，在MSPE 樣品前處理中選擇含0.5%（V/V）甲酸的丙酮進行解吸。

2.3 方法驗證

2.3.1 基質效應

在UPLC-MS/MS 分析過程中，樣品基質及外源組分會干擾目標物的電離，使目標物質譜響應增高或降低，產(chǎn)生基質效應（ME）[40]。因此，采用基質匹配標準溶液繪制標準曲線，對于UPLC-MS/MS 準確定量分析多種真菌毒素至關重要。本研究以空白樣品基質提取液和乙腈-水（50∶50，V/V）為溶劑，分別構建了基質匹配標準曲線和溶劑標準曲線，其相應基質效應的計算公式為ME（%）=（A–B）/A ×100，其中，A為基質匹配標準溶液標準曲線的斜率， B 為溶劑標準溶液標準曲線的斜率。當ME在?20%～+20%范圍內時，認為基質效應不顯著；當MEgt;+20%時，表示存在基質增強效應；當MElt;?20%時，表示存在基質抑制效應[41-42]。如圖5 所示，玉米樣品基質通過Fe₃O₄-MWCNTs 富集凈化后， 22 種目標真菌毒素的基質效應為–27.7%～9.8%，優(yōu)于Fe₃O₄-MWCNTs-OH（–57.8%～17.3%）、Fe₃O₄-MWCNTs-COOH（–69.5%～30.7%）和Fe₃O₄-MWCNTs-2（71.3%～33.3%）的凈化效果。此外，16 種真菌毒素經(jīng)Fe₃O₄-MWCNTs 富集凈化后，基質效應在–20%～20%之間，表明Fe₃O₄-MWCNTs 在農(nóng)產(chǎn)品真菌毒素多殘留凈化過程中具有良好的基質凈化效果，是理想的MSPE 前處理吸附劑。盡管如此，本研究仍采用基質匹配曲線以獲得更準確的定量分析結果。

2.3.2 方法的分析性能

利用空白玉米基質提取液配制22 種真菌毒素的基質標準溶液，以質量濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，繪制校準曲線，并計算每種真菌毒素的校準曲線方程和相關系數(shù)（R2）。結果表明，采用本方法測定22 種真菌毒素時，在各自的線性范圍內均具有良好的線性關系（R2≥0.9966）；以3倍信噪比（S/N=3）計算得到LOD 為0.0008～1.6337 ng/g，以10 倍信噪比（S/N=6）計算得到LOQ 為0.0025～5.4457 ng/g，表明本方法具有良好的靈敏度（見電子版文后支持信息表S4）。

在空白玉米樣品基質中分別添加2 倍LOQ、5倍LOQ 和10 倍LOQ 濃度的混合標準工作液，室溫下靜置2 h，待真菌毒素標準品被樣品充分吸收后進行提取、凈化和UPLC-MS/MS分析，每個加標水平均進行日內實驗（重復6 次）和日間實驗（連續(xù)3d， 每天重復3 次），結果見電子版文后支持信息表S5。22種目標真菌毒素在低、中、高3 個濃度添加水平下的回收率分別為71.5%～118.4%、72.3%～109.8%和73.9%～111.4%，日內和日間精密度（RSD）分別為1.3%～10.9%（n=6）和2.3%～11.6%（n =3）。以上結果表明，本方法具有較高的回收率、良好的準確度和靈敏度，適用于多種真菌毒素的準確定量分析。

將本方法與之前的研究工作進行比較（表1），本方法具有更寬的線性范圍、較高的回收率和較低的定量限，可以實現(xiàn)農(nóng)產(chǎn)品中22 種常見真菌毒素的同時檢測。

2.4 實際樣品的測定

采用建立的MSPE-UPLC-MS/MS 方法對玉米樣品中的真菌毒素進行測定，結果見表2，在5 個玉米樣品中共檢出8種真菌毒素（AFB1、AFB2、15-ADON、OTA、TEN、DON、ZEN 和β-ZAL），其中有2種真菌毒素（OTA 和ZEN）超標：在樣品2和3中測得的OTA 含量分別為12.1 和15.6 ng/g，超過國家限量標準（5 ng/g）[46]；在樣品1、2和4 中測得的ZEN含量分別為83.7、74.4和79.3 ng/g，超過國家限量標準（60 ng/g）[46]。以上結果表明，農(nóng)產(chǎn)品中存在多種真菌毒素共同污染及真菌毒素超標問題，需要加強農(nóng)產(chǎn)品中多種真菌毒素的同時監(jiān)測。

3 結論

本研究制備了Fe₃O₄-MWCNTs，并將其作為MSPE 吸附劑用于農(nóng)產(chǎn)品中真菌毒素的前處理過程。對提取溶液類型、吸附劑類型、吸附劑用量和洗脫溶液進行了系統(tǒng)性優(yōu)化，在最佳前處理條件下，將MSPE 技術與UPLC-MS/MS 技術相結合，建立了可同時測定農(nóng)產(chǎn)品中22種真菌毒素的方法?；贔e₃O₄-MWCNTs 的MSPE 前處理技術既發(fā)揮了Fe₃O₄-MWCNTs良好的富集凈化能力，又可以實現(xiàn)樣品溶液的磁性分離。本方法具有簡單、快速、靈敏和高效的特點，可用于大批量農(nóng)產(chǎn)品中多種真菌毒素的同時檢測，對于保障糧食安全具有重要參考意義。