羊李氏桿菌病的鑒別與檢測檢疫方法

張精海

摘要：羊李氏桿菌病是羊只感染單核細(xì)胞增多性的李氏桿菌從而引發(fā)的傳染病，又稱轉(zhuǎn)圈病?；疾⊙蛑槐憩F(xiàn)為發(fā)熱至40.5～41℃、行動遲緩、頭向一側(cè)傾斜、隨意轉(zhuǎn)圈、頭頸高抬、角弓反張、四肢劃水狀等，若未及時治療或誤診會導(dǎo)致羊只的死亡。本文對羊李氏桿菌病的臨床癥狀進行了綜述，分別介紹了羊李氏桿菌病的實驗室診斷方法和與其他病的鑒別診斷方法，并總結(jié)了檢測方法，以期廣大養(yǎng)殖場能夠更好地預(yù)防羊李氏桿菌病的發(fā)生，降低羊只的傷亡率和養(yǎng)殖場的經(jīng)濟損失。

關(guān)鍵詞：羊；李氏桿菌；臨床癥狀；鑒別診斷；檢測方法

羊李氏桿菌病是由革蘭氏陽性的、不形成芽孢和莢膜的李氏桿菌導(dǎo)致的傳染病，各年齡階段的羊只均可感染，但羔羊的發(fā)病率更高。羊李氏桿菌病一年四季均可發(fā)生，根據(jù)患病羊只的年齡階段可以分為羔羊、成年羊以及妊娠母羊，具有低發(fā)病率、高死亡率的特點，也屬于人畜共患病之一，因此一旦患病會給養(yǎng)殖業(yè)和消費者安全健康造成極大的隱患，因此在養(yǎng)殖過程中必須給予高度的重視，本文對羊李氏桿菌病的臨床癥狀、實驗室診斷方法、鑒別診斷以及檢測方法進行了總結(jié)，具體內(nèi)容如下：

1 臨床癥狀

不同年齡階段的羊只患病后表現(xiàn)出的臨床癥狀不同，可以具體分為：羔羊、成年羊及妊娠母羊三種。

1.1 羔羊

羔羊感染羊李氏桿菌病后通過表現(xiàn)出典型、明顯的臨床癥狀，即表現(xiàn)為急性敗血癥，非常高的死亡率。具體表現(xiàn)為：體溫升高至41 ℃，交替出現(xiàn)精神萎靡和突然興奮，共濟失調(diào)（行走站立不穩(wěn)），漫無目的地游走或者不停地轉(zhuǎn)圈，頭部向后仰的觀星狀態(tài)，角弓反張，尖叫，四肢劃水，有白色的泡沫狀液體從口腔中流出，面部、頸部肌肉僵直且過段時間可恢復(fù)，雖食欲不受影響但由于肌肉痙攣而導(dǎo)致不能采食到口中，根據(jù)患病羔羊自身體質(zhì)病程可持續(xù)1～3周。

1.2 成年羊

成年綿羊感染此病的概率高于成年的山羊，羊只感染羊李氏桿菌后病程緩慢。具體表現(xiàn)為：多數(shù)羊只有創(chuàng)傷存在于口腔中，體溫正常，精神萎靡，采食下降或停止，貧血導(dǎo)致可視黏膜蒼白，角膜渾濁，有分泌物存在于眼瞼部位，視力減退甚至完全失明，之后伴隨神經(jīng)癥狀，遇到障礙后停滯不前且依靠從而導(dǎo)致偏癱，連續(xù)轉(zhuǎn)圈，眼瞼及患病側(cè)耳朵下垂，有未咀嚼的飼料存儲在口腔中且流涎，全身麻痹，直至臥地不起，四肢劃水，最終死亡。

1.3 妊娠母羊

妊娠期母羊感染羊李氏桿菌后出現(xiàn)流產(chǎn)和子宮炎，虛脫，昏迷，麻痹，直至死亡，有些妊娠母羊未表現(xiàn)出任何癥狀就突然死亡。病程7 d左右。

2 實驗室診斷和鑒別

2.1 實驗室診斷

1）剖檢。工作人員在做好防護的情況下，對患病死亡的羊只進行解剖，可以觀察到明顯的病變。心臟：心外膜點狀出血；肝臟：腫大、變性，不同形狀（米粒狀、散在或者成片）的壞死灶、出血點存在于其表面；胃腸道：黏膜充血、出血；脾臟：出血點存在其表面且明顯腫大；腎臟：存在出血點；淋巴結(jié)：全身淋巴結(jié)腫大、出血，腸系淋巴結(jié)尤為嚴(yán)重；腦部：腦、腦膜等部位水腫、充血，炎性病變，增多而渾濁的腦脊液，腦干軟化，存在一些壞死灶，中腦、延腦有膿性腫脹以及管套；鼻腔：鼻炎，流出呈黏膿性的鼻液；對于妊娠后流產(chǎn)的母羊，解剖后可觀察到子宮有面積較大的充血和壞死灶，大量膿性滲出物存在于胎盤頂端且胎盤絨毛壞死[1]。

2）鏡檢。首先，在無菌環(huán)境中，采集死亡羊只的肝臟或者脾臟，然后使用干凈牙簽將樣品涂抹至載玻片中，接著進行染色，使用的是瑞特氏和革蘭氏染料，再使用光學(xué)顯微鏡進行觀察，可以觀察到革蘭氏陽性、兩端鈍圓、粗短、菌體細(xì)小、無芽孢、無莢膜、以單個或者成對方式存在的菌體。

3）實驗室培養(yǎng)。首先采集樣品，在無菌環(huán)境中，采集患病后死亡羊只的肝臟或者脾臟作為培養(yǎng)樣品均可；然后按照樣品∶生理鹽水＝1∶5的比例對樣品進行研磨，并接種在肝片肉湯和血液瓊脂培養(yǎng)基中，血液瓊脂培養(yǎng)基需要的條件為：厭氧、有氧、溫度37 ℃、培養(yǎng)1～3 d，此時有圓形、透明、大小似針尖、表面光滑的菌落出現(xiàn)在其中，且菌落周圍存在溶血環(huán)，在透光且隨著培養(yǎng)時間的延長，菌落由藍灰色變成灰白色，由透明變?yōu)椴煌该?。而肝片肉湯培養(yǎng)基中有輕微的渾濁出現(xiàn)但不存在氣泡；接著，對可疑菌落進行染色，并分別在濃度為0.05%和0.1%的亞硫酸鈉血液瓊脂中進行接種，培養(yǎng)條件為：37 ℃、1～3 d，此時0.05%的亞硫酸鈉血液瓊脂中可以觀察到：灰白色菌落且菌落顏色在3 d后變?yōu)榧t色；0.1%的亞硫酸鈉血液瓊脂可以觀察到：黑色菌落。最后在血清葡萄糖甘油肉湯、濃度為10%的氯化鈉血清葡萄糖甘油瓊脂中分別接種典型菌落，培養(yǎng)條件為37 ℃、1～3 d。前者培養(yǎng)基中觀察到：略微渾濁、底部出現(xiàn)黏稠的沉淀物，震蕩時先出現(xiàn)螺旋狀上升后表現(xiàn)為顆粒狀，未形成菌環(huán)和菌膜；后者培養(yǎng)基中觀察到：圓形、透明、針尖大小、光滑、淡藍色的菌落，逐漸變?yōu)椴煌该?、灰白色的菌落?/p>

4）運動性診斷。取出血清葡萄糖甘油肉湯中的培養(yǎng)物，并穿刺接種在半固體培養(yǎng)基中22 ℃培養(yǎng)3 d，菌體運動并沿著穿刺線以倒立松樹的形狀生長至兩側(cè)；接著在37 ℃培養(yǎng)3 d，這時可以發(fā)現(xiàn)菌體停止運動，但仍舊沿著穿刺線兩側(cè)生長[2]。

2.2 鑒別診斷

羊只感染李氏桿菌后具有一些與其他疾病相似的癥狀，故在生產(chǎn)中需要進行鑒別診斷。

1）絳蟲病。當(dāng)羊只感染絳蟲病后，也會偶爾出現(xiàn)轉(zhuǎn)圈、旋回、臥地不起等癥狀。但是可以通過檢查糞便進行區(qū)別，糞便中可以觀察到絳蟲節(jié)片，對死亡羊只進行剖檢，可以觀察到胃腸道中存在蟲體。

2）包蟲病。當(dāng)羊只感染腦包蟲病后，也會出現(xiàn)頸部向一側(cè)傾斜，精神萎靡和亢奮交替出現(xiàn)，轉(zhuǎn)圈，痙攣等，可能與羊李氏桿菌病混淆。但是，若是腦包蟲病則體溫正常，病程較長，寄生蟲存在于羊只頭部導(dǎo)致頭骨軟化、松軟，剖檢時腦膜中存在蟲體。

3）偽狂犬病。當(dāng)羊只患偽狂犬病后，會出現(xiàn)神經(jīng)過度興奮，轉(zhuǎn)圈，頭部向一側(cè)傾斜，頭部抵墻或者依靠障礙物。但是與羊李氏桿菌病也存在一些差異，如體溫忽然升高，全身被毛脫落嚴(yán)重，咽喉、皮膚均出現(xiàn)水腫，有泡沫狀的液體從口腔中流出，病程較短，一般1～2 d即可死亡。

3 檢測方法

使用恰當(dāng)、準(zhǔn)確的檢測方法及時進行檢測，并根據(jù)檢測結(jié)果采取相關(guān)預(yù)防措施，可以有效降低羊李氏桿菌的危害。其中，常用的檢測方法包括傳統(tǒng)檢測、免疫學(xué)檢測以及分子生物學(xué)檢測。

3.1 傳統(tǒng)檢測

傳統(tǒng)檢測主要指的是細(xì)菌分離培養(yǎng)。此檢測方法具有成本低廉、可定量、可定性的優(yōu)勢，但是也存在檢測速度慢、影響因素較多等缺點。具體操作為：先在無菌條件下采集患病羊只的病料組織，然后放在專門的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，并將所長的菌落進行生化反應(yīng)、運行性檢查、溶血試驗、血清型鑒定等，最終確定檢測結(jié)果。

3.2 免疫學(xué)檢測

常見的免疫學(xué)檢測方法分為：膠體金免疫技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附法等。

1）膠體金免疫技術(shù)。此方法具有快速、靈敏度高、時間短、簡便等優(yōu)勢。其原理是利用膠體金作為標(biāo)記物的一種常見的免疫學(xué)檢測方法。江玲麗等[3]使用檸檬酸鈉法研制出了李氏桿菌溶血素的膠體金試紙，研究發(fā)現(xiàn)此試紙具有較強的特異性、較高的穩(wěn)定性和靈敏度、較好的親和力（常數(shù)為4.25×108 L/mol），檢測時間只需15 min，與PCR檢測結(jié)果、國際檢測方法的符合率為91.67%。

2）酶聯(lián)免疫吸附法。此方法具有方便、標(biāo)準(zhǔn)化程度高等優(yōu)勢，也是在李氏桿菌檢測中應(yīng)用最廣的方法。隨著科技的進步和檢測技術(shù)的不斷成熟，酶聯(lián)免疫吸附法的檢測時間由最初的2～3 d縮短至幾小時，加快了檢測速度，縮短了時間。

3.3 分子生物學(xué)檢測

常見的分子生物學(xué)檢測方法包括：PCR技術(shù)、重組酶聚合酶擴增技術(shù)、免疫磁珠分離與PCR結(jié)合法等。

1）PCR技術(shù)。此技術(shù)具有重復(fù)使用、可靠等優(yōu)點，且具有可以與其他技術(shù)結(jié)合以提高檢測結(jié)果靈敏性、特異性的優(yōu)勢。王一明等[4]使用PCR技術(shù)對新疆伊犁地區(qū)280個綿羊血液等指標(biāo)通過設(shè)計特異性引物、提取DNA、確定反應(yīng)條件、分析擴增結(jié)果等步驟，檢測出5個樣本中含有李氏桿菌。

2）基于測流層析的重組酶聚合酶擴增技術(shù)。此技術(shù)具有檢測時間短、特異性好、結(jié)果直觀、所需儀器設(shè)備簡單等優(yōu)勢。其原理是探針5'段具有熒光基團、反向引物被生物素標(biāo)記，從而使得產(chǎn)物既有熒光基團又有標(biāo)記物從而利用測流層析法進行檢測。王亞磊等[5]通過設(shè)計、合成引物，提取單核細(xì)胞李氏桿菌細(xì)菌基因組，篩選RPA最佳引物，測定RPA-LF靈敏度和特異性等步驟建立了產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌的RPA-LF快速檢測方法，此方法適合快速的現(xiàn)場檢測、野外檢測。

3）免疫磁珠分離與PCR結(jié)合法。此方法具有檢測時間短、特異性強等優(yōu)勢，但是需要專業(yè)的檢測人員、操作較為復(fù)雜、應(yīng)用范圍窄。其原理是用核酸探針為基礎(chǔ)然后進行斑點雜交實驗。

4 小結(jié)

羊李氏桿菌嚴(yán)重威脅各階段羊只尤其是羔羊的生命健康，春秋季發(fā)病率高，死亡率高，因此會威脅整個羊群的健康，未及時治療或者治療不當(dāng)會造成較大的損失。養(yǎng)殖戶在飼養(yǎng)過程中要通過專業(yè)的實驗室診斷、鑒別、檢測準(zhǔn)確判斷此病，以便采取及時有效的治療和預(yù)防措施，做到及早發(fā)現(xiàn)、及時治療、科學(xué)預(yù)防，保證羊群的健康生長。

參考文獻：

[1] 傅雯婕.羊李氏桿菌病流行病學(xué)及診治[J].畜牧獸醫(yī)科學(xué)（電子版），2020（3）：120-121.

[2] 朱鳳民.羊李氏桿菌病的臨床癥狀、實驗室檢查、鑒別及防治[J].現(xiàn)代畜牧科技，2017（6）：91.

[3] 江玲麗，高有領(lǐng)，胡興娟，等.檢測產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌溶血素的膠體金試紙條制備及初步應(yīng)用[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2022，53（6）：1841-1848.

[4] 王一明，張海蘭，楊菊清，等.伊犁地區(qū)綿羊李氏桿菌病PCR診斷方法的建立[J].中國草食動物科學(xué)，2013，33（4）：53-55.

[5] 王亞磊，張海洋，王權(quán)，等.產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌RPA-LF快速檢測方法的建立[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2020，50（1）：1-9.