空腸彎曲桿菌快速檢測方法研究進展

申秋平 沈靜怡 劉曉明 莊林林

摘要：空腸彎曲桿菌是一種常見的人畜共患病原菌，快速精準檢測是有效控制其傳播和感染的關(guān)鍵。本文主要介紹了近年來發(fā)表的快速檢測空腸彎曲桿菌的相關(guān)方法，包括免疫學(xué)方法（酶聯(lián)免疫吸附試驗、免疫層析技術(shù)）、核酸檢測方法（聚合酶鏈式反應(yīng)及其衍生技術(shù)、多種等溫擴增技術(shù)等），以及其他新型檢測方法（表面等離子共振技術(shù)、生物傳感器、CRISPR-Cas12b檢測系統(tǒng)）。此外，本文還討論了這些方法的優(yōu)缺點以及在實際應(yīng)用中的考慮因素，以期為行業(yè)研究者提供相對全面的空腸彎曲桿菌檢測方法參考和科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：空腸彎曲桿菌；快速檢測；免疫學(xué)方法；核酸檢測方法；生物傳感器

空腸彎曲桿菌（Campylobacter jejuni，C. jejuni）是一種常見的腸道致病菌，屬于彎曲桿菌屬，革蘭氏染色陰性[1]。該菌多寄生于畜禽、寵物及野生動物，可通過污染的水、牛奶、禽制品等途徑進行傳播，其感染可引起家畜繁殖障礙、乳房炎、幼畜禽腹瀉等。人類感染則可急性胃腸炎或食物中毒，并伴發(fā)關(guān)節(jié)炎等免疫性疾病[2]。

快速、精準地檢測空腸彎曲桿菌是有效控制和預(yù)防該類食源性病原菌傳播的關(guān)鍵。近年來，免疫學(xué)和核酸檢測技術(shù)及交叉學(xué)科技術(shù)的發(fā)展為快速精準檢測空腸彎曲桿菌提供了新的有力技術(shù)和工具支持。本文就近年來國內(nèi)外在空腸彎曲桿菌快速檢測方法上的研究進展做一綜述。

1 免疫學(xué)檢測方法

1.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗

酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是一種可用于檢測抗原或抗體的免疫學(xué)技術(shù)。ELISA方法具有良好的靈敏度和特異性，且操作相對簡單，目前已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷、生物學(xué)研究等領(lǐng)域。樓宏強等[3]以O(shè)MP18的B細胞抗原表位多肽為包被抗原，建立了一種可快速檢測空腸彎曲桿菌的ELISA方法。實驗表明，當表位多肽在稀釋度1：1000時，免疫反應(yīng)性增高最明顯。同時，該方法的特異性經(jīng)空腸彎曲菌感染的血清樣本驗證。

1.2 免疫層析技術(shù)

免疫層析技術(shù)是一種廣泛使用的免疫學(xué)檢測技術(shù)，可用于現(xiàn)場檢測目標物質(zhì)。由于免疫層析技術(shù)設(shè)計簡單、操作方便，目前已廣泛應(yīng)用于醫(yī)療診斷、獸醫(yī)學(xué)、食品及環(huán)境檢測等。Kawatsu等[4]利用制備的針對空腸彎曲菌15-kDa細胞表面蛋白的單克隆抗體，建立了一種免疫層析檢測方法（Campy-ICA）。經(jīng)86株空腸彎曲菌和26種非空腸彎曲桿菌驗證，該方法具有良好的特異性，且對C. jejuni細胞懸浮液的檢測限為1.8×104 CFU/mL。通過對222份糞便樣本進行檢測表明，與細菌培養(yǎng)結(jié)果相比，Campy-ICA的敏感性和特異性分別可達84.8%和100%。此外，Campy-ICA操作簡單，能夠在15分鐘內(nèi)檢測出糞便提取物中的彎曲桿菌抗原，有望作為糞便培養(yǎng)的一種簡單而快速的輔助手段，用于檢測樣本中的空腸彎曲桿菌。

磁珠具有獨特的磁學(xué)性能和高比表面積，且形貌可控、易于修飾，在病原體快速檢測中具有非常高的應(yīng)用價值。為快速捕獲家禽樣品中的空腸彎曲菌，Poonlapdecha等[5]使用多克隆抗體功能化的鐵納米顆粒進行目標菌特異性捕獲。在此基礎(chǔ)上，利用PCR擴增hipO基因目標片段并結(jié)合側(cè)向?qū)游鲈嚰堖M行產(chǎn)物檢測。結(jié)果顯示，該方法對純培養(yǎng)物以及人工感染物中的空腸彎曲桿菌檢測限分別為1 CFU/mL和101～102 CFU/mL。此外，經(jīng)60份雞肉樣本驗證，該方法的相對準確性、特異性和敏感性分別可達96.67%、100%和93.33%。同時，該方法約可在3 h內(nèi)完成檢測，其結(jié)果與標準培養(yǎng)法相當，而后者需要5～7 d，顯示出良好的臨床檢測適用性。He等[6]使用免疫磁性納米球捕獲、分離C. jejuni后，再用熒光量子點進行檢測。該方法檢測限為103 CFU/mL，線性范圍為105～107 CFU/mL。與傳統(tǒng)的方法如兩步法、PCR或培養(yǎng)法相比，該策略不僅顯示出增強的靈敏度，而且更簡單、省時。

1.3 免疫學(xué)方法優(yōu)缺點

ELISA、免疫層析技術(shù)以及免疫磁珠技術(shù)是目前已發(fā)表的可用于檢測C. jejuni的主要免疫學(xué)技術(shù)。ELISA是一種常用的免疫學(xué)檢測技術(shù)，方法設(shè)計靈活，應(yīng)用范圍廣，但是需要制備抗原和抗體，以及相對較長的處理時間。免疫層析技術(shù)具有便攜、快速和易于操作等優(yōu)點，適于現(xiàn)場進行初步篩查，但其敏感性和特異性可能低于ELISA。免疫磁珠能快速、高效地富集目標病原體，可提高檢測的靈敏度和特異性，但磁珠的制備需要特殊的設(shè)備和一定的技術(shù)要求。未來，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展及多學(xué)科技術(shù)的融合，期待相關(guān)方法能在操作便捷性、靈敏度、特異性等方面能有更多的改良和提升，以更好地滿足不同的場合和檢測需求。

2 基于核酸的檢測方法

2.1 基于聚合酶鏈式反應(yīng)的檢測方法

1）常規(guī)聚合酶鏈式反應(yīng)。聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）可通過在反應(yīng)管內(nèi)循環(huán)熱解和合成來擴增特定的DNA片段，從而獲得大量的DNA產(chǎn)物，具有靈敏、特異、高效、設(shè)計靈活、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)勢。根據(jù)已發(fā)表的研究，可用于建立PCR方法的空腸彎曲桿菌靶基因主要有mapA、ceuE、hipO、gyrA、flaA基因，以及16S rRNA、23S rRNA等。Zhang等[7]基于空腸彎曲桿菌hipO基因特異性保守區(qū)域設(shè)計引物，建立了一種qPCR方法。該方法的檢出限可達4.3 CFU/mL，經(jīng)242例腹瀉患者糞便標本驗證，其比常規(guī)細菌培養(yǎng)更敏感。胡哲等[8]以空腸彎曲桿菌gyrA基因為擴增靶標，建立了一種可特異性檢測C. jejuni的PCR方法。分析結(jié)果表明，該方法檢測限為8 CFU/mL，且與非C. jejuni菌株無交叉反應(yīng)性。通過對100份雞肉樣品進行檢測對比，該PCR法檢測結(jié)果與生化試驗一致。

2）多重PCR方法。多重PCR（multiplex PCR，mPCR）是一種允許同時在同一反應(yīng)中擴增兩個或更多的目標序列，具有檢測效率高、成本可控、減少污染風險等優(yōu)勢。陳荀等[9]基于C. jejuni 16S rRNA和hipO基因建立了一種雙重PCR方法。結(jié)果顯示，該方法針對C. jejuni能擴增出699和366 bp兩個片段，而大腸桿菌、沙門氏菌等其他多種細菌均無法擴增。同時，該方法檢測限為2.4～16 CFU/mL，且可在27 h內(nèi)完成。翟海華等[10]以mapA和hipO為靶基因建立了一種可快速檢測C. jejuni的雙重PCR方法。相比于普通PCR，該方法能更特異、準確地檢測出C. jejuni，且與大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等無交叉反應(yīng)性。

3）套式PCR。套式PCR（nested PCR）是PCR的一種衍生技術(shù)，該技術(shù)的特點是使用兩對引物和兩次PCR反應(yīng)來提高檢測的特異性和靈敏度。高正琴等[11]基于flaA基因設(shè)計內(nèi)、外引物，建立了一種可特異性檢測C. jejuni的套式PCR方法。分析表明，該套式PCR的檢測限低至10 CFU，且檢測可在8 h內(nèi)完成。通過對121份臨床樣品進行檢測，該套式PCR檢出31份陽性，與常規(guī)細菌分離培養(yǎng)法一致。

為了實現(xiàn)套式PCR一管式擴增，Wu等[12]針對C. jejuni的hippuricase基因設(shè)計了兩對嵌套的PCR引物，建立了一種新型單管嵌套PCR（Single-tube nested PCR，STN-PCR）。通過優(yōu)化嵌套引物的退火溫度和工作濃度，擴增過程中可依次使用內(nèi)外兩對引物。STN-PCR的檢測限可達3.6×101 CFU/mL，比常規(guī)PCR低2個數(shù)量級。

4）熒光定量PCR。熒光定量PCR（Quantitative fluorescence PCR，qPCR）是一種在PCR過程中監(jiān)測目標DNA擴增的實時方法，通過使用熒光染料或探針來檢測特定的DNA序列。其中，染料法操作簡便、成本低，而探針法更加特異且具有多重檢測功能。

熒光染料可以結(jié)合到任何的雙鏈DNA上，并在結(jié)合后產(chǎn)生熒光。在PCR過程中，隨著DNA的擴增，熒光信號也隨之增強。王大勇等[13]利用膜吸附-洗脫法富集環(huán)境水樣中的空腸彎曲桿菌，并基于空腸彎曲桿菌VS1基因建立了一種qPCR方法，該方法檢測限可達46 CFU/mL，線性范圍為2.66×109～2.66×100 copies/μL，且與腸炎沙門氏菌無交叉反應(yīng)。經(jīng)實際水樣檢測驗證，該方法檢測結(jié)果與常規(guī)生化鑒定方法一致。張鳳榮等[14]基于空腸彎曲桿菌mapA基因建立了一種qPCR方法，該方法檢測限為6.42 copies/μL，并能特異性檢測空腸彎曲桿菌，并具有良好的可重復(fù)性（組內(nèi)和組間Ct值變異系數(shù)均小于2.5%）。

探針法主要是使用了特定的熒光標記探針，這些探針可以特異性地結(jié)合到目標DNA序列上。在PCR過程中，當探針與目標DNA結(jié)合時，會發(fā)出熒光信號。這種方法具有高度的特異性，但成本相對較高。陽成波等[15]建立的qPCR方法可在1 h內(nèi)完成，檢測限可達5 CFU，標準曲線相關(guān)系數(shù)為0.988。趙勤英等[16]以空腸彎曲桿菌hipO基因為靶標，建立的qPCR方法檢測限可達15 CFU/mL，低于常規(guī)分離培養(yǎng)法和PCR法。此外，由于閉管式檢測，可有效避免擴增產(chǎn)物引起的氣溶膠污染和假陽性問題。李丹丹等[17]基于ORF-C基因設(shè)計引物及探針建立的qPCR方法可特異性檢測C. jejuni，且檢測限為11 CFU/mL。經(jīng)60份樣品檢測驗證，該方法檢測結(jié)果與國標法一致，顯示出良好的應(yīng)用價值。

為實現(xiàn)一步法檢測小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌和空腸彎曲桿菌，溫和心等[18]基于上述目標菌YST和VSI基因分別設(shè)計引物和探針，建立了一種雙重qPCR方法。該方法對兩種細菌的檢測限均低于10 CFU/g，且具有良好的選擇性和可重復(fù)性（批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于1%）。此外，為了實現(xiàn)活的非可培養(yǎng)（viable but non-culturable，VBNC）狀態(tài)的C. jejuni檢測，Lv等[19]將疊氮溴化丙錠（PMA）與qPCR相結(jié)合，建立了一種PMA-qPCR方法。該方法針對細菌純培養(yǎng)物的檢測限為2.43 log CFU/mL。在3.43～8.43 log CFU/mL的線性范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)為0.9999。

5）基于PCR的其他方法。PCR-ELISA是結(jié)合了PCR和ELISA兩種技術(shù)的生物檢測方法。首先通過PCR擴增目標DNA，然后使用ELISA技術(shù)對擴增產(chǎn)物進行快速檢測和定量。唐夢君等[20]使用標記生物素和地高辛分別標記引物和探針，建立了一種可快速檢測空腸彎曲桿菌的PCR-ELISA方法。該方法針對空腸彎曲桿菌基因組DNA和人工感染泄殖腔樣本的檢測限分別為2 fg、50 CFU/mL。經(jīng)100份臨床樣品檢測驗證，該PCR-EIISA方法的陽性檢出率（69%）高于常規(guī)PCR（60%）。

MPN（most probable number）法，即最近似數(shù)法，是微生物檢驗中常用以估算細菌濃度的一種方法。MPN法適于生長條件特殊的微生物定量、靈敏度較高，但常需進行生化鑒定，且操作煩瑣、周期較長。有鑒于此，韓梅[21]基于空腸彎曲桿菌hipO基因和產(chǎn)氣莢膜梭菌cpa基因設(shè)計PCR引物，聯(lián)合MPN建立了MPN-PCR方法以快速檢測上述兩種目標菌。該方法不僅可以進行定量檢測，還可準確檢測VBNC狀態(tài)的細菌。通過對186份雞肉樣品進行檢測，空腸彎曲桿菌的陽性率為17.2%，含菌量范圍為3.6～92 MPN/g。結(jié)果表明，該MPN-PCR方法具有特異性強、敏感性高等優(yōu)點，為禽空腸彎曲桿菌精準檢測提供了新的技術(shù)支持。

2.2 核酸等溫擴增方法

1）環(huán)介導(dǎo)等溫擴增。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)是由Notomi等于2000年提出的一種核酸快速擴增技術(shù)。該技術(shù)可在恒溫（60～65 ℃）條件下短時間內(nèi)（通常1 h內(nèi)）擴增出大量的目標序列，目前已廣泛應(yīng)用于病原體檢測、遺傳疾病診斷、食品安全檢測和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域。唐夢君等[22]基于gyrA基因設(shè)計引物建立了一種LAMP法以快速檢測空腸彎曲桿菌。經(jīng)實驗驗證，該方法可在45 min內(nèi)完成擴增，與李斯特氏菌等8株菌株無交叉反應(yīng)性，且對C. jejuni純培養(yǎng)物的檢測限為20 CFU/mL。齊詩蕊等[23]建立了一種靶向空腸彎曲桿菌hipO基因的LAMP方法，檢測結(jié)果可通過實時濁度儀和裸眼顯色兩種方法進行判斷。該方法可在62 ℃、60 min內(nèi)完成擴增，且最低檢出限為6.97×102 copies/μL，比常規(guī)PCR法低1個數(shù)量級?；谕瑯拥陌谢?，Liu等[24]建立的LAMP方法針對細菌培養(yǎng)和人工感染雞肉的檢測限分別低至34.2 fg/μL和103 CFU/g，敏感性與Jainonthee等[25]建立的實時LAMP方法相當。經(jīng)74株細菌驗證，該方法可特異性檢測C. jejuni，而與大腸桿菌、海鷗彎曲桿菌以及其他11個屬的食源性病原菌無交叉反應(yīng)性。進一步地，徐義剛等[26]基于空腸彎曲桿菌ORF-C基因建立的LAMP法對純培養(yǎng)菌的檢測靈敏度達6 CFU/反應(yīng)，顯示出良好的實用性，為快速、特異檢測空腸彎曲桿菌提供了有力工具支持。

進一步地，為實現(xiàn)快速、可視化檢測空腸彎曲桿菌，Li等[27]開發(fā)了一種免疫捕獲磁珠-增強LAMP-CRISPR/Cas12a方法（ICB-LAMP-CRISPR/Cas12a）。首先用ICB捕獲空腸桿菌，LAMP擴增后產(chǎn)物使用CRISPR/Cas12a系統(tǒng)進行檢測。該方法可在70 min內(nèi)檢測出低至8 CFU/mL的空腸彎曲桿菌。除ICB捕獲外，整個反應(yīng)過程在封閉管中進行，可有效避免氣溶膠污染。同時，經(jīng)不同養(yǎng)殖場的31份陽性糞便樣品驗證，該方法可準確檢測出空腸彎曲桿菌。此外，為實現(xiàn)多重檢測，盤寶進等[28]在環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增體系引入分子信標，建立了一種雙重熒光LAMP方法以快速檢測空腸彎曲桿菌和小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌。實驗結(jié)果表明，該方法針對空腸彎曲桿菌的檢測限為102 CFU/mL，且具有高特異性。

2）重組酶聚合酶檢測方法。重組酶聚合酶擴增（recombinase polymerase amplification，RPA）是一種可在恒溫條件下進行DNA擴增的新型技術(shù)，其主要依賴于三種酶，包括重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白和DNA聚合酶，目前已被發(fā)展用于多種病原體的分子檢測。Geng等[29]基于hipO基因建立一種實時RPA檢測方法以實現(xiàn)對空腸彎曲桿菌的快速高效檢測。分析表明，該方法可在約13 min內(nèi)檢測出102 copies/μL的細菌DNA，敏感性與qPCR方法相當，且具有良好的特異性。

為實現(xiàn)現(xiàn)場檢測C. jejuni，Chen等[30]整合紙基DNA提取、RPA和側(cè)向?qū)游黾夹g(shù)，構(gòu)建了一種混合微流控裝置。RPA反應(yīng)在20 min內(nèi)完成，并對C. jejuni顯示出100%的特異性。該微流控裝置的檢測限為460 CFU/mL。該裝置將核酸提取從密集的移液簡化為紙質(zhì)試樣，使其更便于在現(xiàn)場使用，為監(jiān)測C. jejuni疫情提供了新的有力工具支持。

3）依賴核酸序列的擴增。依賴核酸序列的擴增（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）是一種用于擴增RNA序列的分子生物學(xué)技術(shù)。該技術(shù)利用逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA多聚酶以及核糖核酸酶循環(huán)復(fù)制和轉(zhuǎn)錄靶RNA，以實現(xiàn)RNA快速、準確地擴增。Churruca等[31]針對空腸彎曲菌和大腸彎曲菌的16S rRNA設(shè)計了一套特異性引物和信標探針，建立了一種基于分子信標的NASBA方法以實時檢測雞肉樣品中的兩種目標菌。整個反應(yīng)在封閉試管中進行，可有效降低污染風險。結(jié)果表明，該方法可有效檢測緩沖鹽水和人工污染雞肉樣品中的目標菌，且比常規(guī)NASBA和Northern印跡更方便。此外，實驗證明，該方法可特異性檢測新鮮或饑餓培養(yǎng)細菌樣品中的空腸彎曲桿菌以及VBNC狀態(tài)的空腸彎曲桿菌，而熱失活的細菌樣品中則未檢測到rRNA信號。

2.3 核酸檢測方法的優(yōu)缺點

PCR是目前最常用的核酸檢測技術(shù)，其優(yōu)點在于高度敏感和特異，且方法設(shè)計靈活。然而，其結(jié)果判斷主要依賴瓊脂糖凝膠電泳，需使用存在安全威脅的核酸染料。多重PCR可同時檢測多個目標序列，有效提高了PCR的檢測效率，但需注意引物之間的相互干擾及反應(yīng)體系的和條件的優(yōu)化。套式PCR通過兩輪PCR大大提高了檢測的靈敏度和特異性，但也增加了樣本污染的風險。qPCR可實現(xiàn)實時定量檢測，不需要后續(xù)的凝膠電泳步驟，具有檢測速度快、靈敏、特異等優(yōu)勢。然而，這類方法需要專用的設(shè)備和熒光探針，成本相對較高。PCR-ELISA通過結(jié)合PCR和ELISA，可以對特定的PCR產(chǎn)物進行檢測和定量，但操作步驟復(fù)雜，可能存在誤判的風險。LAMP方法擴增DNA效率高、反應(yīng)設(shè)備簡單。然而，其特異性可能低于PCR。RPA檢測時間短，適于現(xiàn)場快速檢測，但其對引物和模板的設(shè)計要求較高。NASBA可用于擴增RNA，且具有較高的敏感性和特異性，但反應(yīng)體系復(fù)雜，在DNA檢測中不具優(yōu)勢。

3 其他新型檢測方法

3.1 表面等離子共振技術(shù)

表面等離子共振技術(shù)（surface plasmon resonance，SPR）是一種利用表面等離子體共振現(xiàn)象來研究分子間相互作用的技術(shù)。Singh等[32]使用空腸彎曲菌噬菌體NCTC 12673受體結(jié)合蛋白功能化的捕獲表面來特異性地捕獲C. jejuni，并將谷胱甘肽自組裝單層（GSH SAM）固定在SPR表面。分析表明，基于GSH SAM的細菌捕獲效率比基于DTSP自組裝單層的無定向附著提高了2～3倍。同時，該方法可檢測到低至102 CFU/mL的空腸彎曲菌，且具有高選擇性。Masdor等[33]聯(lián)合SPR和扣除抑制試驗（subtractive inhibition assay，SIA）建立了一種SIA-SPR方法以快速檢測C. jejuni。將特異性兔多克隆抗體與C. jejuni細胞混合后，使用芯片修飾山羊抗兔IgG多克隆抗體的SPR傳感器進行檢測。該SIA-SPR方法對C. jejuni的檢測極限為131±4 CFU/mL，且具有很高的特異性。

3.2 生物傳感器

為快速檢測食品中的空腸彎曲桿菌，Masdor等[34]利用兔多克隆抗體作為捕獲抗體，構(gòu)建夾心法石英晶體微天平（Quartz crystal microbalance，QCM）免疫傳感器，并與金納米顆粒（AuNPs）共軛作為檢測抗體。該傳感器檢測限低至150 CFU/mL，具有良好的臨床檢測應(yīng)用價值。Wang等[35]在QCM基礎(chǔ)上，使用納米級磁珠（Magnetic nanobeads）分離目標病原體，并使用AuNPs進行檢測信號放大。用QCM分析儀測量共振頻率，并將共振頻率的變化與空腸桿菌的細胞數(shù)相關(guān)聯(lián)。結(jié)果表明，該QCM免疫傳感器檢測限為20～30 CFU/mL，且無需預(yù)富集，總檢測時間小于30 min。

Kim等[36]使用適配體功能化的金納米顆粒構(gòu)建了一種新型比色傳感器以實現(xiàn)空腸彎曲桿菌現(xiàn)場檢測。在高特異性適配體的作用下，金納米顆粒的聚集將產(chǎn)生明顯地從紅色到紫色的顏色變化。經(jīng)50份自然污染的禽樣本的驗證，該傳感器的檢測準確率優(yōu)于基于瓊脂的常規(guī)分離培養(yǎng)法，且可將樣品富集后的檢測時間從48 h縮短至30 min。

Dehghani等[37]基于多克隆抗體與石墨烯量子點在C. jejuni細胞膜上與表面蛋白的相互作用，構(gòu)建了一種熒光免疫傳感器。石墨烯量子點與C. jejuni的特異性結(jié)合導(dǎo)致石墨烯量子點和氧化石墨烯之間產(chǎn)生距離，產(chǎn)生熒光。當缺乏C. jejuni或存在其他細菌細胞的情況下，石墨烯點和氧化石墨烯之間的距離非常低，熒光關(guān)閉。實驗表明，C. jejuni的逐步增加導(dǎo)致熒光發(fā)射逐漸增加，并且該過程是線性的。該傳感器可在1.5 h內(nèi)完成檢測，檢測限為10 CFU/mL，并具有良好的特異性。

3.3 其他新型方法

近年來，RNA引導(dǎo)的CRISPR-Cas方法由于其高可靠性和特異性，在快速核酸檢測方面顯示出具有吸引力的應(yīng)用前景。Cas12b是一種雙RNA引導(dǎo)的DNA核酸內(nèi)切酶，在被sgRNA靶標復(fù)合物激活后顯示出側(cè)支切割活性。在此過程中，Cas12b可在單堿基水平識別復(fù)合物并切割其周圍的非靶點單鏈DNA。Huang等[38]開發(fā)了一種基于CRISPR-Cas12b的系統(tǒng)來快速準確地檢測C. jejuni。該系統(tǒng)可識別C. jejuni特異性和保守基因組。該系統(tǒng)可在約40 min內(nèi)檢測出約10 CFU的C. jejuni，低于傳統(tǒng)的分離方法，且具有高特異性。

3.4 新型檢測方法的優(yōu)缺點

SPR具有非破壞性、靈敏度高、快速響應(yīng)、適用范圍廣等優(yōu)點，但該方法需要較高要求的實驗室技術(shù)和設(shè)備。生物傳感器優(yōu)點是靈敏度高、檢測速度快，但目前傳感器的設(shè)計和制備要求較高。隨著生物、物理、化學(xué)等多學(xué)科的融合創(chuàng)新，期待上述新型檢測方法在方法設(shè)計、設(shè)備制作、檢測成本等方面能有更多的突破。

4 總結(jié)

近年來，免疫學(xué)技術(shù)、核酸檢測技術(shù)及新興交叉學(xué)科技術(shù)在空腸彎曲桿菌快速檢測及應(yīng)用中均取得了顯著的進展。目前，這些技術(shù)各有優(yōu)、缺點，例如：免疫學(xué)方法操作簡單、快速，但需考慮交叉反應(yīng)的影響；基于PCR的方法靈敏度高，但需要專業(yè)的設(shè)備和訓(xùn)練；核酸等溫擴增技術(shù)支持現(xiàn)場即時檢測，但在方法成熟度以及穩(wěn)定性方面仍有待提升；表面等離子共振、生物傳感器等可實現(xiàn)超敏檢測，但較高的檢測成本、樣本處理及結(jié)果分析要求等仍限制著這些技術(shù)的推廣應(yīng)用。

隨著交叉學(xué)科的技術(shù)融合與創(chuàng)新，期待能有更多簡單、快速、超敏、特異、可視化的空腸彎曲桿菌檢測方法，以更好地滿足人類及動物健康等多層次、多樣化的現(xiàn)實需求。

參考文獻：

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