基于血紅蛋白—納米磷酸鈥復(fù)合材料的過氧化氫生物傳感器

黃海平+徐亮+岳亞鋒+呂連連

摘 要 以Ho2O3為反應(yīng)物，采用水熱法制備了納米磷酸鈥（n.HoPO4），并利用場發(fā)射掃描電子顯微鏡（SEM）、能譜分析（EDS）對其進行形貌表征和元素組成分析。將n.HoPO4和血紅蛋白（Hb）復(fù)合材料修飾于裸玻碳電極（GCE）表面構(gòu)建生物傳感器，實現(xiàn)了對H2O2的電化學(xué)檢測。采用循環(huán)伏安（CV）和電化學(xué)交流阻抗（EIS）技術(shù)對修飾電極進行表征，結(jié)果表明，Hb/n.HoPO4/GCE對H2O2的還原具有良好的電化學(xué)催化效果； n.HoPO4具有良好的導(dǎo)電性和生物相容性，促進了Hb與工作電極間的直接電子轉(zhuǎn)移。研究了不同pH值和電化學(xué)掃速對修飾電極響應(yīng)電流的影響。在優(yōu)化實驗條件下，此生物傳感器對H2O2在50～1000 μmol/L 范圍內(nèi)表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，相關(guān)線性系數(shù)R=0.999，檢出限為17 μmol/L（S/N=3）。此生物傳感器具有檢測范圍寬、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好、抗干擾能力強等優(yōu)點，可用于實際樣品的檢測。

關(guān)鍵詞 血紅蛋白； 磷酸鈥； 過氧化氫； 電催化； 生物傳感器

1 引 言

稀土元素獨特的4f電子構(gòu)型，賦予稀土材料優(yōu)異的光、電、磁性能，在工業(yè)催化、燃料電池、熒光材料、生物傳感器等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[1～5]。以稀土磷酸化合物納米材料為例，因其優(yōu)越的物理化學(xué)性質(zhì)，近年來成為科研工作者的研究熱點。Wang等[6]通過水熱法制備了不同組成的（Y 0.95Eu 0.05）PO4和 （Y 0.96.xTb 0.04Eux）PO4 （x=0～0.10）晶體納米片，并詳細研究不同組份時的發(fā)光性能。Zhang等[7]利用自犧牲模板技術(shù)制備了Eu3+摻雜的YPO4空心球，并對不同摻雜條件下產(chǎn)物的熒光性能進行了詳細探討。此外，納米稀土磷酸化合物具有大的比表面積，穩(wěn)定性、良好的導(dǎo)電性及生物相容性，因此也被應(yīng)用在生物傳感器領(lǐng)域[1，8]。Zhou等[1]通過水熱法在150℃下反應(yīng)12 h成功合成了LaPO4納米線，用于生物傳感器的構(gòu)建， 該生物傳感器在多巴胺（DA）、尿酸（UA）檢測中表現(xiàn)出良好的選擇性、寬的檢測范圍、低的檢出限。

磷酸鈥（HoPO4）作為一種重要的稀土磷酸鹽，制備方法包括高溫灼燒法[9]、共沉淀法[10]、結(jié)晶法[11]等。HoPO4由于其優(yōu)異的熒光性能在安全防偽、裝飾等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。在太陽光和三色光的激發(fā)下，HoPO4能發(fā)射不同波長的光[10]。通過不同金屬離子的摻雜作用，可以改變其晶體結(jié)構(gòu)和熒光性能[11]。但是目前關(guān)于HoPO4在生物傳感領(lǐng)域的應(yīng)用，卻鮮有報道。

H2O2是一種強氧化劑，被廣泛應(yīng)用在食品加工、消毒液、醫(yī)藥生產(chǎn)等領(lǐng)域。但H2O2的強氧化性會對人體健康造成危害，因此對其含量的分析測定具有重要意義[12～14]。目前對H2O2的檢測方法主要有電化學(xué)法[15]、熒光分析法[16]、比色法[17]、表面增強拉曼光譜法[18]和電化學(xué)發(fā)光法[19]等，其中電化學(xué)法因具有選擇性好、靈敏度高、反應(yīng)快速等優(yōu)點得到廣泛應(yīng)用[20]。Guo等[14]制備了基于血紅蛋白（Hb）.collagen復(fù)合材料的新型H2O2生物傳感器，該傳感器表現(xiàn)出穩(wěn)定性好、靈敏度高、線性范圍寬等優(yōu)點。血紅蛋白作為一種重要的氧化還原蛋白，對人體內(nèi)的氧和二氧化碳的存儲和運輸起著重要作用。血紅蛋白擁有豐富的生物催化活性位點，而且價格低廉易得，被廣泛的用于構(gòu)建H2O2生物傳感器[21]。然而，血紅蛋白作為生物大分子，被直接固定在電極表面時，將阻礙電子的直接轉(zhuǎn)移[22]。為了克服該難題，碳納米管[23]、石墨烯[24]、普魯士藍[25]及各種金屬納米粒子[26，27]等被用于固載生物酶，提高酶與電極間的直接電子轉(zhuǎn)移，進而提高H2O2的檢測靈敏度。

本研究結(jié)合稀土元素多能級的電子結(jié)構(gòu)、良好的生物相容性等特點，研究稀土納米材料HoPO4的電化學(xué)性能及生物傳感應(yīng)用。首先采用熱水法合成n.HoPO4，將其用于固載Hb到玻碳電極表面，從而制備出Hb/n.HoPO4/GCE修飾電極，并研究了修飾電極的電化學(xué)行為。n.HoPO4因具有良好的導(dǎo)電性和生物相容性，能夠促進Hb與電極間的電子轉(zhuǎn)移。所制備的生物傳感器對H2O2具有較寬的檢測范圍、良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

CHI660D型電化學(xué)工作站（上海辰華儀器有限公司）； 能譜分析（EDS）儀（Philips XL30）、MLA650F型掃描電子顯微鏡（美國FEI公司）； Autolab PGSTAT12電化學(xué)交流阻抗儀（Ecochemie， BV，荷蘭）； 電化學(xué)測量采用三電極體系，玻碳電極作為工作電極（Φ=4 mm），鉑絲電極作為對電極，甘汞（飽和KCl溶液）電極作為參比電極。

殼聚糖（CS）溶液由0.5 g殼聚糖、1 mL冰醋酸、99 mL去離子水混合超聲1 h制備，0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（PBS）由NaH2PO4， Na2HPO4和 KCl配制，實驗所用支持電解液預(yù)先通入高純氮氣除氧。2 mmol/L鐵氰化鉀溶液由鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀、KCl配制； 血紅蛋白（Hb），H2O2（30%），過氧化氫消毒液（3.0%），Ho2O3，濃HNO3， NaOH，檸檬酸三鈉等試劑均為分析純級，實驗用水為去離子水。

2.2 n.HoPO4的合成

根據(jù)文獻[28]制備YPO4的方法略有改動： 首先稱取0.1 g Ho2O3固體粉末于燒杯中，加入去離子水后加熱，再緩慢滴加濃HNO3至固體完全溶解后，用一定濃度的NaOH調(diào)節(jié)溶液pH值至中性。隨后將0.5 g檸檬酸三鈉和0.1 g NaH2PO4加到上述溶液，在磁力攪拌器下持續(xù)攪拌，當溶液開始變渾濁后繼續(xù)攪拌30 min，再將此溶液移到100 mL聚四氟乙烯反應(yīng)釜中， 140℃下反應(yīng)24 h。將所得產(chǎn)物依次用乙醇和去離子水多次洗滌，最后在真空干燥箱60℃下烘干，得到n.HoPO4。

2.3 修飾電極的制備

首先，分別用粒徑為0.3 μm和0.05 μm的氧化鋁粉末拋光打磨裸玻碳電極成鏡面，再用乙醇和去離子水超聲清洗后， 置于4℃儲存， 備用。將制備好的n.HoPO4用去離子水超聲分散獲得n.HoPO4溶液（2 mg/mL），同時將2 mg Hb振蕩溶于2 mL PBS緩沖溶液（pH 7.0），將制備好的溶液置于4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

分別取20 μL的H2O、n.HoPO4溶液、Hb溶液，充分振蕩混合均勻后，取10 μL滴涂在拋光好的裸玻碳電極表面，室溫下晾干，再取5 μL CS溶液用于電極表面的封閉，從而制得Hb/n.HoPO4/GCE修飾電極。用同樣的方法制備n.HoPO4/GCE修飾電極和Hb/GCE修飾電極，將制備好的修飾電極置于4℃儲存， 備用。

3 結(jié)果與討論

3.1 n.HoPO4的形貌表征和組成分析

通過水熱法合成的n.HoPO4的SEM圖如圖1A所示， n.HoPO4的形貌呈六棱柱體，粒徑在50～100 nm之間均勻分布。同時對n.HoPO4進行了能譜分析，從圖1B和表1可知， 制備的材料由Ho， P， O及Na元素組成，由此可以推斷合成的物質(zhì)主要是HoPO4。

3.2 修飾電極的電化學(xué)表征

不同修飾電極的循環(huán)伏安曲線如圖2A所示，在01 mol/L PBS溶液（pH 7.0）中，n.HoPO4/GCE（曲線b）與裸GCE（曲線a）相比背景電流增大，說明n.HoPO4具有良好的導(dǎo)電性，能促進電子的轉(zhuǎn)移速率； 將Hb修飾在玻碳電極表面后（曲線c），在電0.334 V出現(xiàn)明顯的還原峰，這是Hb在PBS溶液（pH 7.0）中的經(jīng)典還原峰[14]； 而Hb/n.HoPO4復(fù)合材料修飾電極的CV圖（曲線d）與n.HoPO4/GCE、Hb/GCE相比，有明顯的還原峰和更大的還原峰電流值，表明n.HoPO4具有良好的生物相容性，能夠保持Hb與玻碳電極間的直接電子轉(zhuǎn)移。為進一步說明HoPO4在H2O2電催化還原中所起的作用，考察了Hb/GCE和Hb/n.HoPO4/GCE修飾電極在含有0.1 mmol/L H2O2的 PBS溶液中的循環(huán)伏安行為，與Hb/GCE修飾電極對H2O2的電化學(xué)還原電流（曲線e）相比，Hb/n.HoPO4/GCE修飾電極（曲線f）對H2O2的電化學(xué)還原具有更大的響應(yīng)電流。此結(jié)果進一步說明n.HoPO4的存在，能有效提升Hb對H2O2的電化學(xué)催化效果。

不同修飾電極在2 mmol/L鐵氰化鉀溶液中的電化學(xué)交流阻抗圖如圖2B所示。在高頻區(qū)產(chǎn)生的半圓部分反映其界面電子轉(zhuǎn)移過程，半圓直徑大小為修飾電極的電子轉(zhuǎn)移阻抗值（Ret）， 直徑越大， 其修飾電極的Ret越大； 低頻區(qū)的曲線部分代表著擴散過程。從圖2B可知，在所有修飾電極中，n.HoPO4/GCE的Ret最小，表明其電子轉(zhuǎn)移阻礙性最小，

從而證明了n.HoPO4具有良好的導(dǎo)電性； 而Hb修飾電極的半圓部分最大，說明Hb/GCE的Ret最大，這是由于Hb生物大分子阻礙了電子的轉(zhuǎn)移速率[29]。Hb/n.HoPO4/GCE與Hb/GCE相比，其Ret明顯的減小，表明n.HoPO4促進了Hb與玻碳電極間的直接電子轉(zhuǎn)移速率； 與n.HoPO4/GCE相比，其Ret明顯更大，表明Hb已經(jīng)成功地修飾在電極表面。

3.3 pH值對Hb/n.HoPO4/GCE電化學(xué)行為的影響

3.6 穩(wěn)定性和重現(xiàn)性實驗

本實驗考察了Hb/n.HoPO4/ GCE制備過程的重現(xiàn)性，將制備的3支修飾電極在PBS（pH 7.0）溶液中檢測，電化學(xué)響應(yīng)電流的相對標準偏差（RSD）為2.1%，表明修飾電極的制備過程具有良好的重現(xiàn)性。同時考察了修飾電極對H2O2檢測的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，3支修飾電極在含有0.1 mmol/L H2O2的PBS溶液（pH 7.0）中進行檢測，電化學(xué)響應(yīng)電流的RSD為3.5%。此外，將修飾電極置于4℃儲存10天，在含0.1 mmol/L H2O2的PBS溶液（pH 7.0）中的響應(yīng)電流仍為初始信號的96%，表明修飾電極對H2O2的檢測具有較好的穩(wěn)定性。

3.7 干擾實驗和實際樣品回收率

配制含有0.1 mmol/L H2O2， 0.1 mmol/L UA， 0.1 mmol/L AA， 1 mmol/L NaCl， 1 mmol/L MgCl2， 1 mmol/L葡萄糖的PBS（pH 7.0）溶液，用于考察修飾電極的選擇性及抗干擾能力。將制備好的3支Hb/n.HoPO4/ GCE浸在此溶液中檢測，與只含0.1 mmol/L H2O2檢測的電流值相比，修飾電極的平均響應(yīng)電流值（RSD=4.6%）僅提高了1.94%。實驗表明，此生物傳感器具有良好的選擇性和抗干擾能力。

選擇含3% H2O2的醫(yī)用消毒液作為實際樣品進行檢測分析。將消毒液用PBS溶液（pH 7.0）稀釋，通過檢測其實際H2O2的含量，探討了該生物傳感器的實際應(yīng)用價值。由表3中可知，H2O2的回收率為100.6%～107.9%，說明此生物傳感器可用于醫(yī)用H2O2消毒液的測定。

4 結(jié) 論

利用水熱法合成了納米HoPO4，并將Hb/n.HoPO4復(fù)合材料修飾在裸玻碳電極表面，制備得到H2O2生物傳感器。n.HoPO4優(yōu)良的導(dǎo)電性、生物相容性等性能，能夠保持Hb的生物活性，并促進Hb與玻碳電極間的直接電子轉(zhuǎn)移。此生物傳感器對H2O2的檢測表現(xiàn)出線性范圍寬、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性好、抗干擾能力強等優(yōu)點，在實際樣品的檢測中具有良好的回收率。

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Abstract The nanomaterial of n.HoPO4 was synthesized via hydrothermal method with Ho2O3 as raw material， and its morphology and component were characterized by SEM and EDS. The composite material of n.HoPO4 and hemoglobin （Hb） was dropped onto the surface of the glassy carbon electrode （GCE） so as to construct the biosensor for detection of hydrogen peroxide. The whole process was characterized by cyclic voltammetry （CV） and electrochemical impedance spectroscopy （EIS）. The results indicated that （Hb/n.HoPO4/GCE） possessed good electrochemical catalytic effect towards H2O2 reduction. The n.HoPO4 showed good electrical conductivity and could promote the direct electron transfer rate between Hb and GCE. The effect of different pH value and electrochemical scan rates on the response current of the modified electrode was studied. Under the optimal conditions， the biosensor exhibited a good linear detection range from 50 to 1000 μmol/L （correlation coefficient R=0.999） with the detection limit of 17 μmol/L （S/N=3）. The biosensor showed wide detection range， good stability and reproducibility and strong anti.interference ability， and could be used for real sample detection.

Keywords Hemoglobin； Holmium phosphate； Hydrogen peroxide； Electrocatalysis； Biosensor