米老排優(yōu)樹組培技術(shù)體系優(yōu)化研究

收稿日期Received：2023-03-06""" 修回日期Accepted：2023-04-25

基金項目：廣東省林業(yè)科技創(chuàng)新項目（2023KJCX002）。

第一作者：孫旭高（sunxugao1998@163.com）。

*通信作者：鄧小梅（dxmei2006@scau.edu.cn），教授。

引文格式：

孫旭高，陶家璐，謝微，等. 米老排優(yōu)樹組培技術(shù)體系優(yōu)化研究. 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2024，48（2）：69-78.

SUN X G， TAO J L， XIE W， et al. Optimization of the tissue culture technology system of Mytilaria laosensis" trees. Journal of Nanjing Forestry University （Natural Sciences Edition），2024，48（2）：69-78.

DOI：10.12302/j.issn.1000-2006.202303008.

摘要：【目的】建立米老排（Mytilaria laosensis）優(yōu)良單株組培再生體系，為今后其無性化推廣提供技術(shù)支撐?！痉椒ā恳悦桌吓艃?yōu)樹基部半木質(zhì)化萌芽為外植體，采用叢芽發(fā)生途徑，通過初代腋芽誘導(dǎo)、繼代增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)等過程，研究篩選最適的外植體采集時間、繼代及生根培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基以及植物生長調(diào)節(jié)劑的種類及濃度配比等。【結(jié)果】10月采集的外植體誘導(dǎo)效果最好，存活率為32.38%；米老排腋芽誘導(dǎo)最適配方為MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.02 mg/L，誘導(dǎo)率為100%，萌發(fā)時間為4.07 d；最適增殖培養(yǎng)基為MX（改良WPM）+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L，增殖系數(shù)達(dá)4.94，芽生長旺盛；最適生根培養(yǎng)基為MX + NAA 0.3 mg/L，生根率100%，平均根數(shù)13.18，根生長健壯，移栽成活率可達(dá)92.3%。【結(jié)論】米老排外植體誘導(dǎo)成活率與取材地點、時間相關(guān)，廣東地區(qū)10月的米老排外植體材料最佳；在使用MS基本培養(yǎng)基增殖系數(shù)低的情況下，改用MX（改良WPM）培養(yǎng)基能夠顯著提高米老排增殖繼代倍數(shù)；本研究還對米老排誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，有助于建立米老排優(yōu)樹組培體系，有效提高組培質(zhì)量和效率。

關(guān)鍵詞：米老排；基本培養(yǎng)基；叢生芽；組織培養(yǎng)

中圖分類號：S722.3+7""""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

文章編號：1000-2006（2024）02-0069-10

Optimization of the tissue culture technology system of Mytilaria laosensis trees

SUN Xugao， TAO Jialu， XIE Wei， SHI Jie， ZHANG Baojin， DENG Xiaomei*

（College of Forestry and Landscape Architectural， Guangdong Key Laboratory for Innovative Development and Utilization of Forest Plant Germplasm， South China Agricultural University， Guangzhou 510642， China）

Abstract： 【Objective】Mytilaria laosensis" is an evergreen， broad-leaved tree with a wide range of suitable habitats and good economic and ecological protection. The seedling is mostly used for cultivation. Grafting and cutting techniques are still experimental， and few reports on tissue culture techniques exist. Therefore， it is of great significance to establish an efficient tissue culture technology system for M. laosensis and to provide technical support for promoting its clone in the future. 【Method】With the semi-lignified bud at the base of the superior tree as explants， through the processes of primary axillary bud induction， secondary proliferation culture， rooting culture， the optimal explant collection time， the basic breeding and rooting culture medium， and the type and concentration ratio of plant growth regulator were studied. 【Result】There were significant differences in the effect of different sampling times on the induction of M. laosensis. The best induction of explants was collected in October 2022， with a survival rate of 32.38%. Treatment with different hormone concentrations significantly affected the time required for bud germination and the growth status of explants. The optimal formula for axillary bud induction was MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.02 mg/L， the induction rate was 100%， and the germination time was 4.07 d. The selection of different basic mediums significantly affected the proliferation of M. laosensis. MX medium had the highest average shoot length （4.47 cm） and the largest proliferation coefficient （4.41）， respectively， which were significantly higher than those of other basic media （1/2 MS， MS， DKW， WPM）， and the proliferation buds grew strongly， increased quickly and had a good effect. Different hormone types and treatment concentrations significantly affected the proliferation and rooting effects of M. laosensis. The optimal breeding medium was MX （modified WPM） + 6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L， and the proliferation coefficient reached 4.94. The buds grow vigorously. The optimal rooting medium was MX+NAA 0.3 mg/L， the rooting rate was 100%， the average root number was 13.18， root growth was robust， and the transplanting survival rate reached 92.3%. 【Conclusion】The induction survival rate of M. laosensis explants was related to the location and time of material collection. October was the best time to collect explant material in Guangdong. In the case of a low proliferation coefficient of the MS basic medium， switching to an MX （modified WPM） medium could significantly increase the proliferation succession factor. Then， the induction medium， breeding medium， and rooting medium were optimized， which helped establish the tissue culture system of the superior tree of M. laosensis and improved the quality and efficiency of the tissue culture.

Keywords：Mytilaria laosensis; basal medium; multiple shoots; tissue culture

米老排（Mytilaria laosensis），又名殼菜果、山桐油，為金縷梅科（Hamamelidaceae）殼菜果屬（Mytilaria）的常綠闊葉喬木，其適生范圍廣，喜溫濕氣候，有一定耐寒能力，是我國南方珍貴的鄉(xiāng)土闊葉樹種。其更新萌蘗能力強(qiáng)，具涵養(yǎng)水源、改良土壤等功能，是良好的生態(tài)防護(hù)樹種，同時還具較強(qiáng)的防火性能，可作為防火林帶種植；米老排干形通直，材質(zhì)美觀，強(qiáng)度高，是制作家具、板材的重要原料；且米老排枝葉繁茂，葉大肥厚，不僅易形成較厚的林地腐殖質(zhì)層，提高土壤肥力，還富有營養(yǎng)，可滿足動物生長發(fā)育所需，是一種頗具潛力的木本飼料。由于米老排的優(yōu)良特性及廣泛用途，其在我國云南、廣東、廣西、福建、江西等地的速生豐產(chǎn)林和生態(tài)公益林等應(yīng)用中得到推廣。

目前米老排人工造林大多采用種子實生苗進(jìn)行，而米老排種子內(nèi)源激素含量少，自然狀態(tài)下萌發(fā)率低，催芽時間長，成本極大，嚴(yán)重影響造林效率，且使用來自不同種源的種子容易產(chǎn)生遺傳變異，導(dǎo)致米老排林分分化大，林相參差不齊，影響造林質(zhì)量及效益；雖然采用無性繁殖能克服種子繁殖的缺點，但目前米老排的嫁接和扦插技術(shù)尚未取得突破，且關(guān)于米老排的組織培養(yǎng)技術(shù)報道甚少，其中組培所用母本材料為3～5年生幼林中的單株，不是經(jīng)過長期選擇的成年優(yōu)樹，同時組培過程中還存在誘導(dǎo)污染率高，增殖率低，增殖周期長，增殖苗質(zhì)量差，增殖苗生根率較低等不足，導(dǎo)致組培速度慢、成本高，難以實現(xiàn)規(guī)?；?/p>

因此本研究選擇米老排成年優(yōu)良單株為母本，以基部萌枝為外植體，通過基本培養(yǎng)基設(shè)計、激素種類、濃度及其配比的優(yōu)化，旨在建立其高效的離體植株再生技術(shù)，達(dá)到增殖芽健壯生長，增殖率、生根率、移栽成活率均高等目的。通過規(guī)?；邕M(jìn)行無性系推廣，為我國米老排人工林栽培所需優(yōu)質(zhì)種苗的繁殖提供技術(shù)支撐，對提升米老排人工林經(jīng)濟(jì)效益有重大意義。

1" 材料與方法

1.1" 供試材料

試驗材料為廣東韶關(guān)樂昌龍山林場12年生米老排人工林優(yōu)良單株。外植體選取優(yōu)樹基部生長健壯、無病害的半木質(zhì)化枝條的萌芽，將其誘導(dǎo)后獲得的米老排組培苗作為試驗材料。

1.2" 實驗方法

1.2.1" 啟動培養(yǎng)

1）外植體采集與表面消毒。分別于2022年的1、4、7、10月，選擇天氣晴朗的9：30—10：30，采集米老排新萌發(fā)的半木質(zhì)化嫩枝，剪去部分葉片，并用吸水棉將枝條基部包裹保濕帶回實驗室。剪去外植體上所有葉片，用體積分?jǐn)?shù)5%洗潔精溶液浸泡5 min，并用軟毛刷清洗葉腋，后用流水沖洗3 h。在超凈工作臺中，根據(jù)枝條老嫩程度的差異選擇不同時長進(jìn)行滅菌，分為頂芽、第2、3節(jié)、中間段、基部4部分；先用體積分?jǐn)?shù)75%酒精滅菌1～3 min，無菌水清洗1次；后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1% HgCl2溶液（加入吐溫1～2滴）滅菌3～10 min，滅菌過程放入搖床振蕩，最后用無菌水清洗5次。滅菌后迅速接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。

2）誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選。經(jīng)過表面消毒滅菌后，將外植體剪成若干帶1個腋芽或頂芽的莖段，接種于不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基以進(jìn)行誘導(dǎo)。本試驗以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同質(zhì)量濃度的6-BA、NAA，共5個處理（表1）。

每瓶接種1個莖段，每個誘導(dǎo)處理及對照組接種30瓶，重復(fù)3次。試驗期間觀察外植體的腋芽萌發(fā)、生長及污染情況，接種后30 d統(tǒng)計誘導(dǎo)率、褐化率及污染率。

1.2.2" 增殖培養(yǎng)基的篩選

1）基本培養(yǎng)基的篩選。將組培苗切去下端愈傷組織和上端嫩芽部分，再切成1.0～1.5 cm的單芽莖段，轉(zhuǎn)接于1/2MS、MS、DKW（B5）、WPM、MX（表2）的基本培養(yǎng)基（均添加6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L）進(jìn)行增殖培養(yǎng)。試驗共5個處理，每個處理接種20個莖段，重復(fù)3次。培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計增殖系數(shù)并觀察記錄增殖苗生長情況。

2）植物生長調(diào)節(jié)劑水平及配比的篩選。以MX為基本培養(yǎng)基，設(shè)置6-BA（0.5、1.0、2.0 mg/L）、NAA（0.02、0.05、0.1 mg/L）2因素3水平共9個不同濃度配比處理的正交實驗（表3）。每個處理6瓶，每瓶接種5個莖段，重復(fù)3次。培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計增殖系數(shù)（培養(yǎng)30 d后的總芽數(shù)與接種時的芽數(shù)之比值），并觀察記錄增殖苗的生長情況。

1.2.3" 生根培養(yǎng)基的篩選

選取苗高2 cm、生長健壯的繼代苗，以MX作為基本培養(yǎng)基， 添加不同質(zhì)量濃度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L）的NAA進(jìn)行生根培養(yǎng)。每個濃度接種15瓶， 每瓶接種6株，重復(fù)3次。培養(yǎng)20 d統(tǒng)計生根率（生根苗數(shù)占接種苗數(shù)的百分比）和生根系數(shù)（生根總數(shù)與接種苗數(shù)之比值）。

1.2.4" 培養(yǎng)條件

以上培養(yǎng)基均添加卡拉膠9.0 g/L，蔗糖30 g/L（生根培養(yǎng)基添加蔗糖15 g/L），pH均調(diào)至5.8～6.0，于高壓蒸汽滅菌鍋121 ℃溫度下滅菌1 100 s；組培試驗在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院組培實驗室進(jìn)行，培養(yǎng)溫度（25±2） ℃，光照度1 500～2 000 lx，光照時間12 h/d。

1.2.5" 煉苗與移栽

生根培養(yǎng)20 d，移至溫室煉苗5～7 d后將生根苗取出，用流水洗凈根部培養(yǎng)基， 移入已消毒處理的泥炭土和珍珠巖（體積比為3∶1）的混合基質(zhì)中， 覆膜并加蓋遮陽網(wǎng)，保持相對濕度80%～90%，溫度25 ℃左右，30 d后統(tǒng)計移栽成活率。

1.3" 數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計外植體污染率、存活率、腋芽誘導(dǎo)率、生長狀況、增殖系數(shù)、生根率、誘導(dǎo)根長度、根條數(shù)等數(shù)據(jù)。使用Excel 2016、SPSS 26.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 不同取材時間對米老排誘導(dǎo)效果的影響

取材時間對米老排外植體誘導(dǎo)效果影響結(jié)果的方差分析顯示，不同取材時間對外植體誘導(dǎo)的污染率、褐化率和存活率存在顯著性差異（Plt;0.05）（表4）。

不同小寫字母代表各組相同指標(biāo)內(nèi)顯著性差異（Plt;0.05）。Different lowercase letters represent significant differences within the same index in each group（Plt;0.05）.下同。The same below.

各月取材誘導(dǎo)的結(jié)果（圖1）顯示：1月取材誘導(dǎo)的污染率、褐化率分別為60.95%、47.62%，顯著高于其他月份取材（Plt;0.05）；污染率隨著取材時間的推移而降低，10月取材的污染率為39.05%，顯著低于其他月份取材（Plt;0.05）。4、7、10月取材誘導(dǎo)褐化率相近，分別為33.33%、35.24%、31.43%；各月份取材的存活率存在顯著差異（Plt;0.05），從大到小依次為10月gt;4月gt;7月gt;1月（圖2a）；綜上各指標(biāo)，10月取材誘導(dǎo)效果最佳（圖2b），4月次之。

2.2" 腋芽誘導(dǎo)

誘導(dǎo)結(jié)果顯示所有激素組合處理均能誘導(dǎo)米老排外植體萌發(fā)新芽，且誘導(dǎo)率均達(dá)100%，但不同激素濃度處理對外植體芽萌動所需的時間（圖3a）和生長狀況存在顯著影響（Plt;0.05）。

其中，在不添加任何激素的A0培養(yǎng)基中誘導(dǎo)，芽萌發(fā)所需時間最長（Plt;0.05），為9.50 d，苗長勢不良（表5）；使用6-BA 0.5 mg/L + NAA 0.02 mg/L的培養(yǎng)基（A1），萌發(fā)時間最短（Plt;0.05），為4.07 d，顯著小于其他處理結(jié)果，且生長情況最好；而A2—A4誘導(dǎo)萌發(fā)時間分別為5.47、7.20、6.23 d，顯著增加（Plt;0.05），同時基部開始出現(xiàn)愈傷組織（表5）。綜合萌發(fā)時間和生長情況的誘導(dǎo)培養(yǎng)基次序為A1lt;A2lt;A4lt;A3lt;A0。

2.3" 基本培養(yǎng)基對米老排增殖效果的影響

將誘導(dǎo)出的米老排腋芽連續(xù)在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上繼代，腋芽分化成叢生芽，叢生芽不斷分化出新的腋芽（圖2c），但隨著繼代次數(shù)的增加，新芽變小，增殖系數(shù)雖高，但芽細(xì)小，生長緩慢，節(jié)間短，有效芽數(shù)少（圖2d）。在連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)3～4代后，部分增殖芽甚至出現(xiàn)死亡的情況。故推測MS基本培養(yǎng)基不適合米老排的增殖培養(yǎng)。

分別以1/2 MS、MS、DKW、WPM（1/4MS）、MX（改良WPM）為基本培養(yǎng)基進(jìn)行米老排增殖試驗。基本培養(yǎng)基對米老排增殖效果影響結(jié)果的方差分析（表6）表明，不同基本培養(yǎng)基類型對米老排增殖的平均芽長和增殖系數(shù)均有極顯著影響（Plt;0.001）。

試驗結(jié)果所示，以1/2 MS為基本培養(yǎng)基進(jìn)行增殖，腋芽平均芽長和增殖系數(shù)分別為1.20 cm和1.90，與MS相近，增殖效果差（圖3b）；DKW增殖的平均芽長3.57 cm，顯著高于MS（Plt;0.05），但增殖系數(shù)僅2.40，長勢一般，增殖效果優(yōu)化不佳（表7）；1/4 MS的增殖系數(shù)為3.28，顯著優(yōu)于前3組處理（Plt;0.05），但平均芽長為1.96 cm，顯著低于DKW（Plt;0.05），且葉片顏色黃綠，增殖優(yōu)化效果同樣不全面；而以MX增殖培養(yǎng)的增殖芽平均芽長最高，增殖系數(shù)最大，分別為4.47 cm和4.41，均顯著高于其他基本培養(yǎng)基，且增殖芽生長旺盛，增殖速度快，效果好。對比各基本培養(yǎng)基增殖的平均芽長、增殖系數(shù)和生長情況來看，MX最適宜作為米老排增殖的基本培養(yǎng)基，增殖效果最佳。

2.4" 6-BA和NAA對米老排叢生芽增殖的影響

不同激素種類及使用濃度對米老排增殖效果影響試驗結(jié)果的方差分析結(jié)果（表8）可知，不同6-BA、NAA濃度以及雙激素的交互作用對米老排叢生芽的增殖系數(shù)和平均芽長均有顯著影響。均為影響米老排叢生芽增殖的主要因素（Plt;0.05）。

試驗方差分析中極差（R）分析結(jié)果見表9。

表9顯示，6-BA、NAA對米老排增殖的影響程度不同，NAA對米老排增殖系數(shù)的影響程度大于6-BA，而對平均芽長的影響小于6-BA。各處理增殖指標(biāo)顯著性差異和多重比較結(jié)果表明：當(dāng)添加6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.02 mg/L（B1）時，米老排叢芽生長較好（圖2e），但增殖系數(shù)和平均芽長分別為4.14和4.07 cm，仍有優(yōu)化空間；B5的米老排增殖系數(shù)和平均芽長分別為4.94和4.62 cm，均顯著高于其他處理（Plt;0.05），生長情況最佳（圖2f）；當(dāng)添加6-BA 2.0 mg/L（B3、B6、B9）時，叢生芽增殖系數(shù)下降，有效芽數(shù)目減少，芽苗質(zhì)量下降，植株出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象（圖2g），特別是同時添加NAA 0.1 mg/L的B9處理，其增殖系數(shù)、平均芽長分別為3.12和2.67 cm，均顯著低于其他處理（Plt;0.05），長勢最差。

2.5" 生根培養(yǎng)基及移栽

將生長健壯、芽高在1.5～2.0 cm的繼代單芽切下，接入以MX作為基本培養(yǎng)基，并添加不同濃度梯度的NAA生根培養(yǎng)基中，平均培養(yǎng)5～6 d后開始生根。生根試驗的方差分析結(jié)果（表10）表明，不同濃度NAA對米老排的平均根長、生根系數(shù)、生根率、生根苗高均具有顯著影響（Plt;0.05）。

相同指標(biāo)進(jìn)行對比（圖4）顯示：平均根長在NAA質(zhì)量濃度為0.4、0.5 mg/L時下降，分別為2.04、1.82 cm，顯著低于0.1～0.3 mg/L的平均根長（分別為3.29、3.38、3.50 cm）（Plt;0.05）；平均根數(shù)隨NAA濃度的增加出現(xiàn)先升高后降低的現(xiàn)象，并在濃度為0.3 mg/L時最高13.18，顯著高于其他濃度水平（Plt;0.05），同時植株根系發(fā)達(dá)，葉色翠綠，芽伸長生長快（圖2h、2i），而NAA質(zhì)量濃度達(dá)0.5 mg/L時，生根苗基部出現(xiàn)大塊愈傷組織；NAA質(zhì)量濃度在0.1、0.5 mg/L的生根率分別為73.29%、80.39%，均顯著低于其他濃度水平（Plt;0.05），且當(dāng)質(zhì)量濃度為0.3 mg/L時，生根率達(dá)100%；生根苗高在NAA質(zhì)量濃度0.1、0.5 mg/L時顯著低于其他濃度水平（Plt;0.05），0.2、0.3、0.4 mg/L NAA處理的苗高接近，分別為4.43、4.44、4.29 cm。

生根培養(yǎng)20 d后將生根瓶苗移到溫室中煉苗5～7 d，然后將組培瓶蓋從半開到全開煉苗1 d，將組培苗取出，洗凈根部殘留的培養(yǎng)基，移栽到泥炭土和珍珠巖（體積比為3∶1）的混合基質(zhì)上，前20 d采用蓋膜保濕，后揭開薄膜按常規(guī)幼苗管理。移栽成活率為92.3%，植株生長旺盛（圖2j）。

3" 討" 論

不同植物在各個季節(jié)的生長情況，不同季節(jié)外植體生理代謝情況以及外植體材料表面攜帶病菌情況都是影響外植體誘導(dǎo)成功率的關(guān)鍵因素，所以在適宜的季節(jié)采集合適的外植體，可以有效減少污染、褐化的發(fā)生，如：異葉南洋杉（Araucaria heterophylla）最佳取材時節(jié)為春末夏初，此時利于不定芽的形成，而秋冬季不定芽數(shù)量少，長勢弱，易褐化；徐南翔從桉樹離體培養(yǎng)試驗中得出3—5月取的外植體比下半年取的外植體污染少，且褐化率低的結(jié)論；胡計紅等研究錦繡杜鵑（Rhododendron×pulchrum ）古樹組培快繁時，發(fā)現(xiàn)5月中旬取材，誘導(dǎo)成功率最高。本研究對象米老排的生長季節(jié)性變化較大，冬春季生長量較低，夏秋季生長旺盛，月平均生長出現(xiàn)2次高峰，分別在5月和9月，而廣東6—8月盛夏屬高溫多雨季節(jié)，林木生長處于相對低谷期。取材誘導(dǎo)實驗表明取材當(dāng)月氣候及米老排生長情況與誘導(dǎo)情況息息相關(guān)，隨取材時間的推移先升高后降低再升高，結(jié)果顯示廣東地區(qū)冬季1月取材誘導(dǎo)情況最差，該階段米老排的幼芽正處于休眠時期，生長勢弱，對誘導(dǎo)反應(yīng)遲鈍，誘導(dǎo)期長，同時外植體老，內(nèi)含物及帶菌多等因素共同導(dǎo)致誘導(dǎo)死亡率、污染率居高；4月天氣回暖，米老排新莖、芽長勢逐漸恢復(fù)，枝條幼嫩，內(nèi)含物少，誘導(dǎo)效果好轉(zhuǎn)；而7月進(jìn)入夏季，華南地區(qū)高溫多雨，氣候環(huán)境適合細(xì)菌霉菌生長，且米老排受高溫影響生長放緩，外植體內(nèi)酚類物質(zhì)積累，多酚氧化酶活性增強(qiáng)，導(dǎo)致外植體易褐化且存活率低，此時不宜采樣誘導(dǎo)；10月廣東地區(qū)溫度適宜，伴有臺風(fēng)，水熱條件良好，同時米老排生長迎來2次高峰，其外植體幼嫩，帶病菌少，幼芽生長旺盛，此時取材誘導(dǎo)效果最好，更有利于米老排外植體的無菌系建立。同樣，李清香等在樹型金銀花（Lonicera japonica ）外植體誘導(dǎo)試驗和番木瓜（Carica papaya）組培研究中均發(fā)現(xiàn)秋季外植體誘導(dǎo)的萌芽率最高，更適合組培誘導(dǎo)。

同一品種不同基因型，甚至同一植株不同部位對生長所需的營養(yǎng)成分存在不同要求，所以外植體誘導(dǎo)完成后，接種到合適的基本培養(yǎng)基是外植體能否順利增殖的關(guān)鍵?；九囵B(yǎng)基不僅影響植株的有效芽率和平均芽長，在植物組培研究中已有數(shù)十種組分各異的基本培養(yǎng)基配方得到應(yīng)用，根據(jù)不同材料的需要，常使用MS、1/2 MS、N6、DKW（B5）、WPM（1/4MS）等作為基本培養(yǎng)基，MS培養(yǎng)基源于對White培養(yǎng)基的改良，是目前使用最廣泛的基本培養(yǎng)基，適合大部分植物生長，最初用于煙草（Nicotiana tabacum）愈傷組織培養(yǎng)；而DKW和WPM培養(yǎng)基適合一般木本植物生長。本試驗選用MS對米老排進(jìn)行繼代培養(yǎng)時，新芽細(xì)小，生長慢，節(jié)間短，有效芽數(shù)少，且3～4代后，部分增殖芽出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。裘珍飛等在以MS作為米老排基本培養(yǎng)基進(jìn)行增殖培養(yǎng)時也存在株高生長緩慢的現(xiàn)象。因此，選擇合適的基本培養(yǎng)基對植物組織培養(yǎng)至關(guān)重要。在本研究中，對各類基本培養(yǎng)基篩選試驗對比，MX（改良WPM）培養(yǎng)基，各項指標(biāo)均顯著優(yōu)其他基本培養(yǎng)基，生長狀況最佳。

組培增殖過程中，細(xì)胞分裂素與生長素的比值決定了芽和根的分化，其中細(xì)胞分裂素在芽的增殖和生長中起決定性作用。6-BA是組織培養(yǎng)中常用的細(xì)胞分裂素類物質(zhì)，主要是促進(jìn)細(xì)胞分裂和分化，誘導(dǎo)胚狀體和不定芽的形成和增殖?，F(xiàn)報道的米老排芽增殖試驗中發(fā)現(xiàn)添加1.0 mg/L的6-BA效果最好。而適量濃度生長素NAA的加入，能夠促進(jìn)不定芽和側(cè)芽的萌發(fā)并促進(jìn)莖的伸長。饒丹丹等在紫葉紫薇（Lagerstroemia indica）繼代增殖試驗中，添加NAA 0.25 mg/L得到的幼芽增殖系數(shù)最高，增殖芽健壯。本研究增殖試驗中，添加6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L進(jìn)行增殖時，叢芽增殖系數(shù)、平均芽長最高，分別為4.94、4.62 cm，均高于其他激素濃度組合的數(shù)據(jù)，增殖優(yōu)化效果最好，且植株生長旺盛，葉色翠綠，有效芽多，生長狀況最佳。試驗發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞分裂素與生長素的比值較大，且激素濃度過高時，增殖植株出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。玻璃化是植物組織培養(yǎng)中普遍發(fā)生的一種生理失調(diào)或生理病變，將導(dǎo)致葉片半透明鮮綠水漬狀，伴隨卷曲或腫脹，變得脆弱易碎，難以恢復(fù)正常，進(jìn)而影響分化和生根，嚴(yán)重影響組培快繁體系的穩(wěn)定性。高英等在天津野生山櫻花（Cerasus serrulate）莖段增殖時使用6-BA出現(xiàn)了不同程度的組培苗玻璃化現(xiàn)象，最高可達(dá)87%?？梢娺m宜質(zhì)量濃度的細(xì)胞分裂素6-BA和生長素NAA配合使用，對米老排叢生芽的增殖才更有效，而過高濃度的激素會適得其反，該結(jié)論在西瓜（Citrullus lanatus）、桑樹（Morus alba）、尾巨桉（Eucalyptus urophylla × E. grandis）、楊樹（Populus sp.）等植物中均有此規(guī)律。因此，找到米老排增殖培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素與生長素的最佳配比，既能保證最好的增殖效果，又能在米老排規(guī)?；a(chǎn)中節(jié)約資源，降低成本。

不定根的形成是組培過程中一個非常關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，直接影響到組培苗移栽成活率的高低，關(guān)系到組培的成敗。生長素NAA等是植物不定根誘導(dǎo)過程中是最常用的激素，使形成層薄壁細(xì)胞恢復(fù)分裂機(jī)能、刺激愈傷組織細(xì)胞的分裂與分化、誘導(dǎo)根原基的發(fā)生，從而促進(jìn)根的形成。NAA濃度與組培苗幼根的生長發(fā)育密切相關(guān)，本研究生根試驗發(fā)現(xiàn)生根率隨著生長素濃度的升高而增加，但高濃度的生長素對生根也有抑制作用，當(dāng)添加NAA 0.3 mg/L時，平均根數(shù)最多為13.18，生根率100%，幼苗根系發(fā)達(dá)粗壯；而NAA濃度過高會降低生根率，并且誘導(dǎo)愈傷組織的形成，與Park等研究結(jié)論相同。為了避免生根過程中愈傷組織的產(chǎn)生，可在生根培養(yǎng)基中添加活性炭，吸附部分生長素，以降低高濃度NAA的抑制效果。此外，本試驗所得生根效果是自米老排組培快繁報道以來最佳的，并在單激素生根培養(yǎng)基配方中取得重大突破，可進(jìn)一步簡化米老排工廠化育苗生根培養(yǎng)基的配制步驟。

通過研究米老排外植體取材時間的選擇、誘導(dǎo)培養(yǎng)基的優(yōu)化、增殖培養(yǎng)基的篩選、生根培養(yǎng)基的改良和移栽生根苗，最終實現(xiàn)了米老排離體再生和組培快繁。其中一系列的試驗確定米老排外植體的最佳取材時間為10月；最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.02 mg/L；最適增殖培養(yǎng)基為 MX （改良WPM）+ 6-BA 1.0mg/L + NAA 0.05 mg/L；最適宜生根的培養(yǎng)基配方為MX （改良WPM）+NAA 0.3 mg/L。本研究為米老排工廠化育苗提供了理論基礎(chǔ)，一定程度上縮短了組培生產(chǎn)周期，且繁殖系數(shù)高，組培苗后代品質(zhì)好，成活率高，并為其他物種利用器官組織直接誘導(dǎo)不定芽進(jìn)行大規(guī)模擴(kuò)繁提供了一定的研究基礎(chǔ)和技術(shù)參考。參考文獻(xiàn)（reference）：

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（責(zé)任編輯" 吳祝華）