輕度慢性阻塞性肺疾病的病理特征及其與炎性因子的相關(guān)性

基金項目：天津市醫(yī)學重點學科（呼吸病學）項目（TJYXZDXK-049A）

作者單位：1天津醫(yī)科大學胸科臨床學院（郵編300222）；2天津市胸科醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，3病理科

作者簡介：趙術(shù)彤（1999），女，碩士在讀，主要從事肺部疾病的病理方面研究。E-mail：zst199903@tmu.edu.cn

△通信作者 E-mail：meilinxugh2017@163.com

摘要：目的 探索輕度慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者肺組織病理特征及其與炎性因子的相關(guān)性。方法 前瞻性納入因肺小結(jié)節(jié)行手術(shù)治療的患者70例，分為正常組10例、輕度COPD組50例、中重度COPD組10例。肺組織分別經(jīng)HE、Masson、EVG染色后評估病理改變；免疫組化染色檢測肺組織平滑肌肌動蛋白（SMA）、肌動蛋白（Actin）、CD31蛋白表達；免疫組化及qPCR檢測肺組織腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素（IL）-10蛋白及mRNA水平。結(jié)果 輕度COPD肺組織可見肺泡間隔增寬，小氣道擴張，血管壁輕度增厚，多見以淋巴細胞為主的炎癥反應。免疫組化染色提示輕度COPD肺組織中SMA、Actin蛋白含量較正常組升高（P＜0.05）。此外，輕度COPD肺組織中TNF-α的mRNA水平及TNF-α陽性率明顯高于正常組，而IL-10的mRNA水平明顯低于正常組（均P＜0.05）。SMA、Actin與炎性因子TNF-α陽性表達呈正相關(guān)，而與IL-10陽性表達呈負相關(guān)（均P＜0.05）。結(jié)論 輕度COPD肺組織主要病理改變包括以小血管平滑肌層增厚為特征的肺小血管重構(gòu)和以淋巴細胞浸潤為主的炎癥反應，同時促炎因子TNF-α升高和抗炎因子IL-10降低與COPD病理改變相關(guān)。

關(guān)鍵詞：肺疾病，慢性阻塞性；肌細胞，平滑??；肌動蛋白類；腫瘤壞死因子α；白細胞介素10

中圖分類號：R563 文獻標志碼：A DOI：10.11958/20231360

Pathological features of mild chronic obstructive pulmonary disease and their correlation with inflammatory factors

ZHAO Shutong1， DING Yun1， LI Yuechuan1， 2， ZHAO Xiaoyun1， 2， GENG Hua3， XU Meilin1， 3△

1 Clinical School of Thoracic， Tianjin Medical University， Tianjin 300222， China; 2 Department of Respiratory and Critical Care Medicine， 3 Department of Pathology， Tianjin Chest Hospital

△Corresponding Author E-mail： meilinxugh2017@163.com

Abstract： Objective To explore the pathological features of lung tissue in mild chronic obstructive pulmonary disease （COPD） and their association with inflammatory factors. Methods A total of 70 patients who underwent surgery for small lung nodule were prospectively included， and were divided into the normal group （n=10）， the mild COPD group （n=50） and the moderate and severe COPD group （n=10）. The pathological changes of lung tissue were evaluated after HE， Masson and EVG staining. The expression levels of SMA， Actin and CD31 proteins were detected by immunohistochemistry staining. Tumor necrosis factor α （TNF-α）， interleukin-10 （IL-10） protein and mRNA levels were detected by immunohistochemistry and qPCR. Results Pulmonary tissue in mild COPD showed widening of alveolar septum， dilation of small airways， mild thickening of blood vessel wall and inflammatory reaction dominated by lymphocyte infiltration. Immunohistochemistry staining showed that contents of SMA and Actin proteins in mild COPD lung tissue were higher than those in the normal group （P＜0.05）. In addition， the TNF-α mRNA and the positive rate of TNF-α in lung tissue of mild COPD were significantly higher than those in the normal group， while the IL-10 mRNA was significantly lower than that of the normal group （all P＜0.05）. SMA and Actin were positively correlated with the positive expression of inflammatory cytokine TNF-α， but negatively correlated with the positive expression of IL-10 （all P＜0.05）. Conclusion The main pathological changes of lung tissue in mild COPD include small lung blood vessel remodeling ocharacterized by thickening of small blood vessel smooth muscle layer and lymphocyte-dominated inflammatory response， while the increase of pro-inflammatory factor TNF-α and decrease of anti-inflammatory factor IL-10 are associated with pathological changes of COPD.

Key words： pulmonary disease， chronic obstructive; myocytes， smooth muscle; actins; tumor necrosis factor-alpha; interleukin-10

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是多種原因所致的一種肺部異質(zhì)性狀態(tài)，患者由于氣道和（或）肺泡異常導致持續(xù)性氣流受限［1］。世界衛(wèi)生組織報道全球每年約有6 500萬人患COPD，且每年有超過300萬人死于COPD［2］。COPD持續(xù)時間長，嚴重影響患者的生活質(zhì)量；戒煙、定期服用藥物、積極參加肺部康復治療可以改善其相應的癥狀，然而肺部損傷仍存在，且無法完全恢復［3］。COPD的肺部病理學改變是導致患者出現(xiàn)相應臨床表現(xiàn)和病理生理學改變的基礎(chǔ)，因此了解其病理學改變及其機制有助于COPD的早期預防和治療。目前認為肺實質(zhì)的慢性炎癥反應和肺小動脈的血管重構(gòu)是COPD的發(fā)病基礎(chǔ)［4］，上述改變在中重度COPD中尤為典型。然而，至今鮮有關(guān)于輕度COPD病理特征的研究報道，且其組織病理改變與炎性因子的相關(guān)性尚未明確。本研究旨在探索輕度COPD肺組織病理改變，重點關(guān)注肺小血管的變化并探究其病理特征與炎性因子的相關(guān)性。

1 對象與方法

1.1 研究對象

1.1.1 入組標準 前瞻性選取2022年7月—2023年6月于天津市胸科醫(yī)院因肺部小結(jié)節(jié)行手術(shù)的患者。納入標準：（1）健康查體行高分辨計算機斷層掃描（HRCT）發(fā)現(xiàn)肺部小結(jié)節(jié)（6 mm≤直徑≤20 mm），行手術(shù)切除。（2）術(shù)前行肺功能檢查。

1.1.2 分組 根據(jù)2023版慢性阻塞性肺病診斷、治療和預防全球策略（GOLD2023）指南進行分組：（1）正常組。第1秒用力呼氣容積（FEV1）/用力肺活量（FVC）≥70%。（2）輕度COPD組。FEV1/FVC＜70%，且FEV1占預計值≥80%。（3）中重度COPD組。FEV1/FVC＜70%，且FEV1占預計值＜80%。使用PASS 15.0軟件估算樣本量，按估算結(jié)果120%入組，最終納入正常組10例，輕度COPD組50例，中重度COPD組10例。本研究得到天津市胸科醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 主要試劑與儀器 鼠源平滑肌肌動蛋白（SMA）、肌動蛋白（Actin）、CD31單克隆一抗及辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠/兔通用二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；兔源腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素（IL）-10多克隆一抗購自英國Abcam；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒購自上海翌圣生物科技股份有限公司；實時熒光定量PCR儀7500型購自美國Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 一般資料收集 收集患者的性別、年齡、吸煙史、飲酒史、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、病變部位、術(shù)前肺功能等資料。

1.3.2 病理標本制作 于小結(jié)節(jié)病灶5 cm外取1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm大小肺組織2塊用于病理切片制作，其中1塊包含臟層胸膜，常規(guī)固定、脫水、石蠟包埋后制成切片。另取約50 mg新鮮肺組織1塊用于PCR檢測。

1.3.3 蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色 對切片進行HE染色，光鏡下觀察并記錄其病理特征。

1.3.4 免疫組化染色檢測 分別對肺組織的連續(xù)切片進行免疫組化染色，檢測SMA、Actin、CD31、TNF-α和IL-10表達。SMA、Actin、CD31采用平均光密度法評估染色結(jié)果，使用Image J軟件進行計算。TNF-α和IL-10結(jié)果判斷標準為：每張切片隨機讀取5個高倍視野（×400），光鏡下觀察細胞著色程度，按陽性細胞所占的百分比進行評判，陰性為＜5%，陽性為≥5%。

1.3.5 特殊染色 采用Masson染色評估肺組織膠原纖維含量，每張切片隨機讀取5個高倍視野（×400），使用Image J軟件計算膠原陽性的綠色面積與所測視野總面積的百分比。采用彈力纖維（EVG）染色法評估彈性纖維的改變情況，隨機讀取5個高倍視野（×400），使用Image J軟件計算陽性藍黑色面積與所測視野總面積的百分比。

1.3.6 實時熒光定量PCR Trizol法提取肺組織總RNA，將1.5 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后采用SYBR green法對目的基因進行擴增。反應條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 32 s，循環(huán)40次。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計算TNF-α、IL-10的相對表達水平。引物序列為TNF-α：上游5′-CTGCACTTTGGAGTGATCGG-3′，下游5′-AGGGTTTGCTACAACATGGG-3′；IL-10：上游5′-GACTTTAAGGGTTACCTGGGTTG-3′，下游5′-TCACATGCGCCTTGATGTCTG-3′；GAPDH：上游5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游" " " "5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′；引物由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 26.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標準差（[x] ±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，并根據(jù)方差齊性檢驗結(jié)果，方差齊性時采用LSD-t法、方差不齊性時采用Tamhane’s T2法進行組間多重比較。計數(shù)資料組間比較采用卡方檢驗或Fisher確切概率法，組間多重比較用Bonferroni法。采用Pearson相關(guān)分析評估相關(guān)性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 患者的基本情況 3組患者年齡、性別、吸煙史、飲酒史、BMI、肺部結(jié)節(jié)部位比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表1。

2.2 HE染色結(jié)果 相較于正常組，輕度COPD組肺泡間隔輕度增寬，部分肺泡壁斷裂融合，少量纖維結(jié)締組織增生，可見以淋巴細胞為主的炎癥細胞反應；小氣道擴張，管壁增厚，平滑肌輕度增生，纖毛發(fā)生粘連、倒伏；血管壁增厚，管腔狹窄，中膜平滑肌增厚，部分閉塞，周圍可見以淋巴細胞為主的炎癥反應；胸膜稍變薄，纖維結(jié)締組織呈輕至中度增生、排列紊亂。而在中重度COPD組中，上述改變明顯加重，同時肺泡壁可見斷裂融合形成大的肺泡腔、肺氣腫形成；部分小氣道塌陷，纖毛消失，管腔內(nèi)黏液分泌增多，阻塞管腔。見圖1。

2.3 SMA、Actin、CD31免疫組化結(jié)果 輕度COPD組中小血管SMA和Actin含量較正常組升高（均P＜0.05）；此外，中重度COPD組中小血管SMA和Actin含量進一步升高，而CD31含量降低（均P＜0.05），見圖2，表2。

2.4 Masson和EVG染色結(jié)果 輕度COPD組肺組織內(nèi)胸膜和小血管中的膠原纖維和彈力纖維含量與正常組相比差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）；而中重度COPD組肺組織小血管中的膠原纖維和彈力纖維含量較正常組和輕度COPD組均增加，且胸膜中彈力纖維含量較正常組和輕度CODP組減少（均P＜0.05）。見表3。

2.5 COPD病理改變及與炎性因子的相關(guān)分析 qPCR及免疫組化染色結(jié)果顯示，輕度和中重度COPD肺組織中TNF-α的mRNA及TNF-α陽性率明顯高于正常組，而IL-10的mRNA明顯低于正常組（均P＜0.05），見表4。3組相關(guān)分析結(jié)果顯示，SMA、Actin與炎性因子TNF-α陽性表達情況呈明顯正相關(guān)，而與IL-10陽性表達情況明顯負相關(guān)（均P＜0.05），見表5。

3 討論

COPD是一種常見的以不可逆的氣流受限為特征的慢性氣道疾病，其肺部病理改變是導致不可逆性的主要原因。因此，了解輕度COPD的病理特征及其病理改變發(fā)生、發(fā)展的機制，并在出現(xiàn)不可逆病理改變之前盡早診斷并進行干預，對改善患者預后有重要意義［5］。

本研究結(jié)果顯示，輕度COPD組內(nèi)肺小血管平滑肌層較正常組明顯增厚，且SMA、Actin含量增多，提示輕度COPD肺小血管顯著的病理改變之一是以血管平滑肌細胞增殖、肥大，平滑肌層增厚為主要表現(xiàn)的肺小動脈重構(gòu)。既往大鼠體內(nèi)研究同樣顯示COPD組的肺血管炎癥、肺血管重構(gòu)程度明顯［6］；并且COPD在尚未出現(xiàn)明顯肺動脈高壓時就已經(jīng)存在以小動脈重構(gòu)為特征的血管改變［7］，隨著病情進展最終導致肺動脈高壓。此外，目前肺血管內(nèi)皮細胞損傷被認為是COPD發(fā)展的主要原因之一［8］，Theodorakopoulou等［9］研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮功能障礙與COPD嚴重程度有關(guān)；Li等［10］研究發(fā)現(xiàn)肺血管內(nèi)皮細胞凋亡在肺氣腫發(fā)病機制中發(fā)揮作用。因此，筆者推測輕度COPD先出現(xiàn)小血管內(nèi)皮功能障礙，隨著疾病進展，內(nèi)皮細胞可能會出現(xiàn)凋亡，導致血管萎縮，從而致肺泡損傷，進而發(fā)展為肺氣腫。

在COPD的早期階段，由于肺血管的損傷導致結(jié)構(gòu)細胞和炎癥細胞產(chǎn)生多種炎性因子［11］。其中，TNF-α是促炎因子，IL-10是抗炎因子，IL-10在促炎因子過度產(chǎn)生的情況下表達，可抑制TNF-α的產(chǎn)生［12］，二者是公認的COPD中的經(jīng)典因子［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著COPD程度加重，TNF-α mRNA水平升高，而IL-10 mRNA水平下降，且在輕度COPD肺組織內(nèi)TNF-α和IL-10的mRNA的變化已比較明顯。同時，本研究發(fā)現(xiàn)小血管內(nèi)SMA、Actin與TNF-α陽性表達呈正相關(guān)，而與IL-10陽性表達呈負相關(guān)，提示TNF-α和IL-10與SMC的增殖有關(guān)。既往研究顯示促炎因子可刺激肺動脈SMC增殖［14］； Kim等［15］研究發(fā)現(xiàn)IL-10在大鼠平滑肌細胞中的抗增殖作用。然而，CD31與TNF-α、IL-10無明顯相關(guān)性，這可能與本研究主要對象為輕度COPD有關(guān)，輕度COPD主要表現(xiàn)為內(nèi)皮細胞功能障礙而非內(nèi)皮細胞凋亡；此外，也可能與輕度COPD中IL-10水平高于中重度組，其抑制了TNF-α誘導的內(nèi)皮細胞凋亡有關(guān)。然而，CD31與TNF-α、IL-10無明顯相關(guān)性，這可能與本研究主要對象為輕度COPD有關(guān)，輕度COPD主要表現(xiàn)為內(nèi)皮細胞功能障礙而非內(nèi)皮細胞凋亡；也可能與輕度COPD中IL-10水平高于中重度組有關(guān)，IL-10抑制了TNF-α誘導的內(nèi)皮細胞凋亡。

綜上，本研究顯示，輕度COPD主要病理特征包括以平滑肌層增厚為主要表現(xiàn)的肺小動脈重構(gòu)和以淋巴細胞浸潤為主的炎癥反應，促炎因子TNF-α和抗炎因子IL-10與COPD相關(guān)病理特征存在相關(guān)性，為COPD早期防治提供了依據(jù)。本研究尚有不足之處，輕度COPD相關(guān)病理改變和TNF-α、IL-10之間的因果關(guān)系及COPD病理改變的具體機制未做深入研究，其他炎性因子與輕度COPD病理特征的關(guān)系也有待進一步探究。

參考文獻

［1］ 梁振宇，王鳳燕，陳子正，等. 2023年GOLD慢性阻塞性肺疾病診斷、管理及預防全球策略更新要點解讀［J］. 中國全科醫(yī)學，2023，26（11）：1287-1298. LIANG Z Y，WANG F Y，CHEN Z Z，et al. Interpretation of the 2023 GOLD Global Strategy Update for the Diagnosis，Management and Prevention of Chronic Obstructive Pulmonary Disease ［J］. Chin Gen Pract，2023，26（11）：1287-1298. doi：10.12114/j.issn.1007-9572.2023.0052.

［2］ SANDELOWSKY H，WEINREICH U M，AARLI B B，et al. COPD- do the right thing［J］. BMC Fam Pract，2021，22（1）：244. doi：10.1186/s12875-021-01583-w.

［3］ LAREAU S C，F(xiàn)AHY B，MEEK P，et al. Chronic Obstructive Pulmonary Disease （COPD）［J］. Am J Respir Crit Care Med，2019，199（1）：1-2. doi：10.1164/rccm.1991P1.

［4］ KARNATI S，SEIMETZ M，KLEEFELDT F，et al. Chronic obstructive pulmonary disease and the cardiovascular system：vascular repair and regeneration as a therapeutic target［J］. Front Cardiovasc Med，2021，8：649512. doi：10.3389/fcvm.2021.649512.

［5］ FAZLEEN A，WILKINSON T. Early COPD：current evidence for diagnosis and management［J］. Ther Adv Respir Dis，2020，14：1753466620942128. doi：10.1177/1753466620942128.

［6］ 何永鴻，強麗，王宋平. 阿托伐他汀鈣對COPD模型大鼠肺血管重塑的影響及機制探討［J］. 天津醫(yī)藥，2021，49（6）：598-602. HE Y H，QIANG L，WANG S P. Effect and mechanism of atorvastatin calcium on pulmonary vascular remodeling in COPD model rats［J］.Tianjin Med J，2021，49（6）：598-602. doi：10.11958/20203011.

［7］ 郭曉桐，范玉春，郝斌威，等. 慢性阻塞性肺疾病患者肺小動脈重塑對肺動脈壓的影響［J］. 中華結(jié)核和呼吸雜志，2018，41（6）：477-483. GUO X T，F(xiàn)AN Y C ，HAO B W，et al. Effect of pulmonary arteriolar remodeling on pulmonary artery pressure in patients with chronic obstructive pulmonary disease［J］. Chin J Tuberc Respir Dis，2018，41（6）：477-483. doi：10.3760/cma.j.issn.1001-0939.2018.06.009.

［8］ 李水霞，孫麗蓉，蘇日娜，等. CD34+細胞和血管內(nèi)皮功能與慢性阻塞性肺疾病急性期的相關(guān)性［J］. 中國老年學雜志，2021，41（14）：2984-2987. LI S X，SUN L R，SU R N，et，al. Association of CD34+ cell and vascular endothelial function with the acute phase of chronic obstructive pulmonary disease［J］. Chin J Gerontol，2021，41（14）：2984-2987. doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2021. 14.022.

［9］ THEODORAKOPOULOU M P，BAKALOUDI D R，DIPLA K，et al. Vascular endothelial damage in COPD：current functional assessment methods and future perspectives［J］. Expert Rev Respir Med，2021，15（9）：1121-1133. doi：10.1080/17476348.2021. 1919089.

［10］ LI K，YE X，XU M，et al. MiR-23a-3p alleviates cigarette smoke extract-induced pulmonary vascular endothelial cell apoptosis by targeting DNAJB1 in emphysema［J］. Clin Respir J，2023. doi：10.1111/crj.13707.

［11］ SZUCS B，SZUCS C，PETREKANITS M，et al. Molecular characteristics and treatment of endothelial dysfunction in patients with COPD：a review article［J］. Int J Mol Sci，2019，20（18）：4329. doi：10.3390/ijms20184329.

［12］ SILVA B，LIRA F S，RAMOS D，et al. Severity of COPD and its relationship with IL-10［J］. Cytokine，2018，106：95-100. doi：10.1016/j.cyto.2017.10.018.

［13］ 鄭鑫鎣，夏之，肖琳琳，等. COPD肺組織中MAL、IL-10、TNF-α的表達［J］. 臨床肺科雜志，2022，27（7）：999-1002，1009. ZHENG X Y，XIA Z，XIAO L L，et al. Expression of MAL，IL-10，TNF-α in lung tissue of COPD［J］. Clin Pulm Med，2022，27（7）：999-1002，1009.

［14］ 羅杰，劉維佳. IL-6、GATA6在大鼠肺動脈平滑肌細胞中的表達及對細胞增殖的影響［J］. 天津醫(yī)藥，2020，48（11）：1025-1030，1137. LUO J，LIU W J. Expression of IL-6 and GATA6 in rat pulmonary artery smooth muscle cells and their effects on cell proliferation［J］. Tianjin Med J，2020，48（11）：1025-1030，1137. doi：10.11958/20200939.

［15］ KIM H Y，KIM H S. Sulfatase 1 mediates IL-10-induced dimethylarginine dimethylaminohydrolase-1 expression and antiproliferative effects in vascular smooth muscle cells of spontaneously hypertensive rats［J］. Cytokine，2021，137：155344. doi：10.1016/j.cyto.2020.155344.

（2023-09-06收稿 2023-11-16修回）

（本文編輯 李國琪）