阿魏酸鈉治療梅尼埃病模型小鼠的效果及機制研究

基金項目：內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金項目（2019LH08009）

作者單位：內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（郵編010059）

作者簡介：崔彥儒（1982），女，主任醫(yī)師，主要從事耳源性眩暈、耳聾、耳鳴及耳鼻咽喉科疾病研究。E-mail：r9s47q0@163.com

△通信作者 E-mail：zhengyanqiu2001@sina.com

摘要：目的 探討阿魏酸鈉治療梅尼埃?。∕D）模型小鼠的效果及機制。方法 BALB/c小鼠采用后顱窩硬膜外入路內(nèi)淋巴囊阻塞術(shù)聯(lián)合腹腔注射醛固酮的方法構(gòu)建MD模型，將造膜成功的60只小鼠隨機分為模型組，阿魏酸鈉低、中、高劑量組，地塞米松組，每組12只。另取12只BALB/c小鼠作為假手術(shù)組。分組鼓室給藥后以聽覺誘發(fā)腦干反應(yīng)（ABR）檢測各組小鼠聽力水平。HE染色及磁共振成像（MRI）觀測各組小鼠耳蝸形態(tài)及其膜迷路積水情況；酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測各組小鼠血清脂蛋白（a）［Lp（a）］及促炎因子白細(xì)胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平；免疫組織化學(xué)染色及Western blot法檢測各組小鼠Lp（a）表達。結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組小鼠ABR閾值、膜迷路積水評分、中階面積占比、血清Lp（a）、IL-6與TNF-α水平、耳蝸組織Lp（a）陽性表達的IOD值與Lp（a）蛋白表達增加（P＜0.05）；與模型組比較，阿魏酸鈉低、中、高劑量組及地塞米松組小鼠ABR閾值、膜迷路積水評分、中階面積占比、血清Lp（a）、IL-6與TNF-α水平、耳蝸組織Lp（a）陽性表達的IOD值與Lp（a）蛋白表達降低（P＜0.05），且高劑量阿魏酸鈉效果更明顯。結(jié)論 阿魏酸鈉可下調(diào)Lp（a）蛋白表達，減少促炎因子產(chǎn)生，抑制炎癥反應(yīng)，進而減輕MD小鼠膜迷路積水癥狀，并改善其聽覺功能。

關(guān)鍵詞：梅尼埃??；脂蛋白（a）；阿魏酸鈉；鼓室給藥

中圖分類號：R764.3 文獻標(biāo)志碼：A DOI：10.11958/20231044

Effect and mechanism of sodium ferulate on Ménière disease model mice

CUI Yanru， ZHENG Yanqiu△， GAO Wei

Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery， Inner Mongolia Medical University Affiliated Hospital，

Hohhot 010059， China

△Corresponding Author E-mail： zhengyanqiu2001@sina.com

Abstract： Objective To investigate the effect and mechanism of sodium ferulate in the treatment of Ménière disease （MD） model mice. Methods BALB/c mice were selected， and an MD model was constructed using posterior fossa epidural approach combined with intraperitoneal injection of aldosterone. Sixty model mice were randomly grouped into the model group， the low dose sodium ferulate group， the medium dose sodium ferulate group， the high dose sodium ferulate group and the dexamethasone group， with 12 mice in each group. Another 12 BALB/c mice were selected as the sham operation group. After grouping and tympanic administration， auditory evoked brainstem response （ABR） was applied to detect the hearing level of mice in each group. HE staining and magnetic resonance imaging （MRI） were applied to observe the morphology of cochlea and membranous labyrinth hydrops of mice in each group. Enzyme-linked immunosorbent assay was applied to detect serum levels of lipoprotein a [Lp（a）]， pro-inflammatory factor interleukin-6 （IL-6） and tumor necrosis factor-α （TNF-α） in each group. Immunohistochemical staining and Western blot assay were applied to detect the expression of Lp（a） in each group. Results Compared with the sham operation group， the ABR threshold， the score of membranous labyrinth hydrops， the proportion of middle stage area， serum levels of Lp（a）， IL-6 and TNF-α， the IOD value of Lp（a） positive expression and the expression of Lp（a） protein in the cochlea of mice were significantly increased in the model group （P＜0.05）. Compared with the model group， the ABR threshold， the score of membranous labyrinth hydrops， the proportion of middle stage area， levels of serum Lp（a）， IL-6 and TNF-α， the IOD value of Lp（a） positive expression and the expression of Lp（a） protein in the cochlea of mice were significantly decreased in the low， medium and high dose sodium ferulate groups and the dexamethasone group （P＜0.05）， and the effect of high dose sodium ferulate was more obvious. Conclusion Sodium ferulate can down regulate the expression of Lp（a） protein， reduce the production of proinflammatory factors， inhibit the inflammatory reaction， thereby alleviating the symptoms of membranous labyrinth hydrops in MD mice， and improving their auditory function.

Key words： Ménière disease; lipoprotein（a）; sodium ferulate; tympanic administration

梅尼埃病（Ménière disease，MD）是一種病變在內(nèi)耳的臨床常見疾病，主要病理改變是內(nèi)耳膜迷路積水，臨床表現(xiàn)以旋轉(zhuǎn)性眩暈、波動性聽力損失、耳鳴、耳內(nèi)悶脹等為主并反復(fù)發(fā)作［1-2］。MD發(fā)病機制復(fù)雜多樣，通常與免疫炎癥、病毒感染、神經(jīng)傳導(dǎo)功能異常和內(nèi)耳血管閉塞等有關(guān)，其中內(nèi)耳慢性炎癥和動脈粥樣硬化是造成眩暈或聽力損失，引發(fā)MD的重要危險因素［3-4］。脂蛋白（a）［lipoprotein（a），Lp（a）］是一種在MD大鼠體內(nèi)高表達的低密度脂蛋白膽固醇樣顆粒。研究顯示，Lp（a）表達上調(diào)可誘導(dǎo)血管炎癥與動脈粥樣硬化、鈣化和血栓形成，進而造成內(nèi)耳血管硬化阻塞，是MD發(fā)生的重要因素［5-6］。因而，降低Lp（a）表達并減輕炎癥反應(yīng)是防治MD的潛在治療措施。阿魏酸鈉是阿魏酸的鈉鹽化合物，可拮抗內(nèi)皮素引起的血管收縮，并具有抗炎、抗脂質(zhì)過氧化、抗血栓、提高機體免疫功能等藥理功效，能降低肛周膿腫患者炎性因子水平并促使其術(shù)后創(chuàng)面愈合［7］，且可保護冠心病患者血管內(nèi)皮功能并改善其臨床癥狀［8］。另有研究顯示，阿魏酸鈉聯(lián)合銀杏達莫可明顯改善MD患者眩暈癥狀［9］。目前，有關(guān)阿魏酸鈉對MD確切的療效及其藥理機制尚不明確。本研究通過構(gòu)建MD小鼠模型，探討阿魏酸鈉鼓室給藥對MD的治療效果及對Lp（a）蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 實驗動物 6周齡SPF級雄性BALB/c小鼠76只，體質(zhì)量17～21 g，購自山東博安生物技術(shù)股份有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（魯）2020-0006，飼養(yǎng)在內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，使用許可證號：SYXK（蒙）2020-0003，在動物房中適應(yīng)喂養(yǎng)1周后用于實驗。具體嚴(yán)格遵照《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》進行。

1.1.2 試劑與儀器 醛固酮（純度98%，批號A46271）購自上海吉至生化科技有限公司；阿魏酸鈉注射液（5 mL：0.1 g，國藥準(zhǔn)字H20056485）購自康臣藥業(yè)（內(nèi)蒙古）有限責(zé)任公司；地塞米松磷酸鈉注射液（1 mL：2 mg，國藥準(zhǔn)字H41020035）購自國藥集團容生制藥有限公司；HE染色試劑盒、小鼠Lp（a）、白細(xì)胞介素6（IL-6）及腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購自上海研啟生物科技有限公司；免疫組化染色試劑盒、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購自英國Abcam公司；兔抗小鼠Lp（a）一抗購自艾美捷科技有限公司等。小動物7.0 T磁共振成像（MRI）系統(tǒng)購自德國Bruker公司，型號BioSpec70/30；聽覺腦干誘發(fā)電位儀購自美國Biologic公司，型號Navigator Pro；生物顯微鏡購自德國Zeiss公司，型號Stemi 305；手動輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機購自德國Leica公司，型號RM2235；小型膠電泳槽、轉(zhuǎn)印模塊、全波長酶標(biāo)儀購自賽默飛世爾科技中國有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 MD模型制作與分組 取64只小鼠，參照文獻［10］，采用后顱窩硬膜外入路內(nèi)淋巴囊阻塞術(shù)聯(lián)合腹腔注射醛固酮的方法構(gòu)建MD小鼠模型。以肌內(nèi)注射10 mg/kg鹽酸氯胺酮聯(lián)合皮下注射30 mg/kg戊巴比妥鈉進行全麻，仰臥位固定后于小鼠右耳枕頸部旁切開，經(jīng)后顱窩硬膜外路徑暴露枕骨上嵴和橫嵴、枕骨髁，磨薄三者圍成區(qū)域的枕骨骨質(zhì)后可見暗紅色乙狀竇，接著磨薄顳骨外側(cè)緣后將乙狀竇推至中線，使其后下方內(nèi)淋巴囊和前庭導(dǎo)水管所在的龕暴露，磨除內(nèi)淋巴囊所在位置后以骨蠟填塞，最后縫合傷口。2周后每天腹腔注射1 mg/kg醛固酮1次，連續(xù)注射5 d，繼續(xù)飼養(yǎng)小鼠3周，小鼠出現(xiàn)眼震、眩暈耳鳴、擺頭、走路不穩(wěn)等一種或幾種癥狀即表示MD小鼠造模成功。將造模成功的60只小鼠以隨機數(shù)字表法分為模型組，阿魏酸鈉低、中、高劑量組，地塞米松組，每組12只。另取12只BALB/c小鼠為假手術(shù)組，只暴露枕骨上嵴和橫嵴、枕骨髁不阻塞內(nèi)淋巴囊并以同樣方式腹腔注射等劑量生理鹽水。

造模成功后，各組小鼠于其耳道內(nèi)滴入2%利多卡因進行局部浸潤麻醉：劑量換算參照文獻［11-12］。阿魏酸鈉低、中、高劑量組小鼠分別以注射器經(jīng)鼓膜前下象限注入鼓室0.1、0.2、0.4 g阿魏酸鈉；地塞米松組小鼠以同樣方法注入鼓室2.5 mg地塞米松［13］；模型組和對照組小鼠注入鼓室與阿魏酸鈉高劑量組等量的生理鹽水，各組每2日1次，共給藥5次。

1.2.2 聽覺功能檢測 于末次給藥后48 h，采用聽覺誘發(fā)腦干反應(yīng)（ABR）檢測各組小鼠聽覺功能。將小鼠麻醉后俯臥固定，于其兩耳廓連線正中皮下插入記錄電極，于兩側(cè)耳垂皮下分別朝向腮部插入?yún)⒖茧姌O，用聽覺腦干誘發(fā)電位儀測試小鼠ABR閾值，值越小表明小鼠聽覺功能越強。

1.2.3 小鼠耳蝸形態(tài)和膜迷路積水觀察 （1）HE染色觀測各組小鼠耳蝸形態(tài)。于密閉容器中以異氟烷麻醉各組小鼠，用注射器采集其心臟血液約1 mL，1 500 r/min離心10 min采集上清液，-80 ℃保存?zhèn)溆?。采用隨機數(shù)字表法于每組抽取6只小鼠，以磷酸鹽緩沖液（PBS）快速進行心臟灌注后斷頭，剪開頭部取出耳蝸，剪下約0.3 g耳蝸組織后存在液氮內(nèi)備用；剩余耳蝸組織于4%中性多聚甲醛內(nèi)固定夜，以10%乙二酸四乙酸溶液浸泡脫鈣，梯度（70%、80%、90%、100%）乙醇脫水、二甲苯透明、熱石蠟包埋后以與耳蝸蝸軸平行的方向進行連續(xù)切片。65 ℃烤片過夜后于二甲苯內(nèi)脫蠟，梯度（95%、80%、70%、60%）乙醇水化后浸入蒸餾水內(nèi)，2 min后取出按照試劑盒說明書行HE染色，蒸餾水沖洗切片，以同樣方式再次脫水后用中性樹膠進行封片，以生物顯微鏡觀察并采集各組小鼠耳蝸形態(tài)圖片。參照文獻［14］判定膜迷路積水嚴(yán)重程度并進行評分（0～4分），分?jǐn)?shù)越高表示膜迷路積水越嚴(yán)重。（2）MRI觀測耳蝸膜迷路改變。將每組剩余的6只小鼠腹腔內(nèi)注射469.01 g/L經(jīng)釓噴酸葡胺注射液100 μL，0.5 h后于密閉容器中以異氟烷進行麻醉，于操作臺上固定（小鼠頭部位于正中無偏斜）后，用膠帶固定小鼠背部以減輕呼吸動度對實驗結(jié)果的影響，行內(nèi)耳磁共振薄層掃描，重復(fù)100 ms、回波時間2.5 ms。Image J軟件分析掃描圖像，計算中階面積占比=中階面積/（中階面積與前庭階面積之和），以此判斷膜迷路積水嚴(yán)重程度，中階面積占比越大，膜迷路積水越嚴(yán)重。

1.2.4 ELISA檢測血清Lp（a）及促炎因子IL-6、TNF-α水平 取1.2.3凍存的各組小鼠血清，于室溫4 ℃下解凍，參照ELISA試劑盒說明書，檢測Lp（a）、IL-6及TNF-α水平。

1.2.5 免疫組織化學(xué)染色觀察Lp（a）表達 取1.2.3中的各組耳蝸組織切片，脫蠟、水化后進行抗原修復(fù)，以5%牛血清白蛋白溶液封閉后滴加兔抗小鼠Lp（a）一抗（1∶100），參照試劑盒說明書，進行免疫組化和DAB顯色、脫水、透明并封片，以生物顯微鏡觀察并采集圖像，用Image Pro Plus 6.0圖像采集分析系統(tǒng)定量各組小鼠Lp（a）陽性表達的積分光密度（integrate optical density，IOD）值，以此表示Lp（a）表達水平。

1.2.6 Western blot檢測耳蝸組織Lp（a）相對表達水平 取1.2.3凍存的各組小鼠耳蝸組織，分別加入RAPI裂解液，冰水浴內(nèi)高速研磨得到勻漿液，4 ℃、3 000 r/min離心20 min，采集各組上清液。以BCA法測量總蛋白濃度后于沸水內(nèi)加熱，使蛋白變性后每組上樣15 μg總蛋白樣品于110 V恒壓下電泳，75 min后于40 mA穩(wěn)流下濕轉(zhuǎn)1.5 h將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。剪下Lp（a）、GAPDH蛋白條帶于5%脫脂奶粉溶液中封閉2 h，分別孵育兔抗小鼠Lp（a）、GAPDH一抗（均1∶2 000）4 ℃孵育過夜，PBS清洗3遍（5 min/遍）后滴加HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗（1∶1 000）室溫孵育2 h，PBS清洗3遍后（5 min/遍）顯色、攝取圖像，Image J軟件量化各組Lp（a）相對表達水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8.0進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以[x] ±s表示，多組間比較用單因素方差分析，組間多重比較用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組ABR閾值、膜迷路積水評分、中階面積占比比較 假手術(shù)組耳蝸形態(tài)正常，未產(chǎn)生膜迷路積水且前庭膜無隆起；與假手術(shù)組比較，模型組小鼠耳蝸形態(tài)呈現(xiàn)病理損傷變化：出現(xiàn)嚴(yán)重膜迷路積水，前庭膜向前庭階方向隆起且部分前庭膜發(fā)生破裂，ABR閾值、膜迷路積水評分、中階面積占比增加（P＜0.05）；與模型組比較，阿魏酸鈉低、中、高劑量組及地塞米松組小鼠耳蝸形態(tài)上述病理損傷變化均減輕，ABR閾值、膜迷路積水評分、中階面積占比降低且高劑量阿魏酸鈉效果更明顯（P＜0.05）；與阿魏酸鈉高劑量組比較，地塞米松組小鼠耳蝸形態(tài)病理損傷變化相似，ABR閾值、膜迷路積水評分、中階面積占比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖1、2，表1。

2.2 各組血清Lp（a）及促炎因子IL-6、TNF-α水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組小鼠血清Lp（a）、IL-6、TNF-α水平增加（P＜0.05）；與模型組比較，阿魏酸鈉低、中、高劑量組及地塞米松組小鼠血清Lp（a）、IL-6、TNF-α水平降低且高劑量阿魏酸鈉效果更明顯（P＜0.05）；與阿魏酸鈉高劑量組比較，地塞米松組小鼠血清Lp（a）、IL-6、TNF-α水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

2.3 各組小鼠耳蝸組織Lp（a）表達變化 與假手術(shù)組比較，模型組小鼠耳蝸組織Lp（a）陽性及蛋白表達增加（P＜0.05）；與模型組比較，阿魏酸鈉低、中、高劑量組及地塞米松組小鼠耳蝸組織Lp（a）陽性及蛋白表達降低且高劑量阿魏酸鈉效果更明顯（P＜0.05）；與阿魏酸鈉高劑量組比較，地塞米松組小鼠Lp（a）陽性及蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖3、4，表3。

3 討論

臨床常采用手術(shù)及抗組胺藥、糖皮質(zhì)激素、利尿劑等藥物治療MD，但手術(shù)治療恢復(fù)期長而藥物治療不良反應(yīng)大［15-16］。本研究結(jié)果顯示，相比假手術(shù)組，造模小鼠促炎因子IL-6與TNF-α大量產(chǎn)生，引發(fā)炎癥，導(dǎo)致小鼠ABR閾值、膜迷路積水評分、中階面積占比明顯增加，其耳蝸出現(xiàn)嚴(yán)重膜迷路積水，前庭膜向前庭階方向隆起且部分前庭膜發(fā)生破裂等病理損傷變化，并出現(xiàn)眼震、眩暈耳鳴、擺頭、走路不穩(wěn)等一種或幾種癥狀，提示MD模型構(gòu)建成功。

研究表明，MD的發(fā)病與內(nèi)耳免疫炎癥、耳蝸血流功能障礙密切相關(guān)，通過調(diào)控免疫、阻止炎癥反應(yīng)及改善內(nèi)耳血管內(nèi)皮功能可有效緩解眩暈、聽力功能障礙，進而改善MD典型癥狀［3，17］。阿魏酸鈉具有調(diào)控免疫及抗炎、抗血栓形成、抗動脈粥樣硬化等生物活性［7-8］。阿魏酸為阿魏酸鈉在體內(nèi)的主要起效成分，可通過保護感覺毛細(xì)胞來減輕氨基糖苷類藥物暴露引發(fā)的功能性聽力損傷［18］。另外，阿魏酸鈉可治療突發(fā)性耳聾［12］，且與銀杏達莫聯(lián)合應(yīng)用可治療MD并減輕患者臨床癥狀［9］。本研究結(jié)果顯示，以不同劑量阿魏酸鈉處理MD小鼠，可降低其ABR閾值、膜迷路積水評分、中階面積占比、血清Lp（a）、IL-6與TNF-α水平，且高劑量阿魏酸鈉效果更明顯。與文獻［9］不同，本研究表明單獨應(yīng)用阿魏酸鈉也可減少促炎因子產(chǎn)生，抑制炎癥反應(yīng)，減輕MD小鼠耳蝸形態(tài)病理損傷及內(nèi)耳膜迷路積水癥狀，改善其聽覺功能障礙，且劑量越高，功效越強，提示阿魏酸鈉在MD臨床治療中具有應(yīng)用前景。

Lp（a）是導(dǎo)致心血管疾病的重要影響因素，可與載脂蛋白（a）結(jié)合引發(fā)單核細(xì)胞活化和炎癥，進而導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙［19］。另有研究顯示，血管內(nèi)皮功能受損引發(fā)的內(nèi)耳血流受阻是引發(fā)MD并造成聽力降低的危險因素［4-5］。郭霞等［20］研究顯示，MD患者體內(nèi)Lp（a）表達水平較正常人顯著增加。本研究結(jié)果顯示，MD小鼠耳蝸組織Lp（a）表達較假手術(shù)組小鼠明顯增加，以不同劑量阿魏酸鈉處理后Lp（a）表達降低，高劑量阿魏酸鈉效果更明顯，表明阿魏酸鈉可逆轉(zhuǎn)MD小鼠Lp（a）表達上述變化趨勢，證實了Lp（a）參與MD發(fā)病過程，還參與介導(dǎo)阿魏酸鈉對MD的治療過程，作用機制可能為阿魏酸鈉通過降低Lp（a）蛋白表達來改善MD小鼠臨床癥狀。

綜上所述，阿魏酸鈉可減輕MD小鼠耳蝸病理損傷，改善內(nèi)耳膜迷路積水，修復(fù)MD小鼠聽覺功能，降低Lp（a）表達可能是阿魏酸鈉藥理機制之一。

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（2023-07-16收稿 2023-09-13修回）

（本文編輯 陸榮展）