金合歡素調(diào)節(jié)Hippo信號通路對糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠血管生成的影響

基金項(xiàng)目：四川省科技計劃項(xiàng)目（23ZDYF1942）

作者單位：四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院眼科（郵編610000）

作者簡介：陳芋潔（1993），女，主要從事眼科方面研究。E-mail：zznijnmn@163.com

△通信作者 E-mail：hailunx60@163.com

摘要：目的 探究金合歡素（Aca）調(diào)節(jié)Hippo信號通路對糖尿病視網(wǎng)膜病變（DR）大鼠血管生成的影響。方法 將60只SD大鼠隨機(jī)分為對照組、DR組、Aca低劑量組（10 mg/kg）、Aca中劑量組（20 mg/kg）、Aca高劑量組（30 mg/kg）、Hippo-yes相關(guān)蛋白（YAP）通路抑制劑Verteporfin組（Aca高劑量30 mg/kg+Verteporfin 0.8 pmol/kg），每組10只。除對照組外，采用鏈脲佐菌素和高脂飼料喂養(yǎng)構(gòu)建DR模型，檢測大鼠體質(zhì)量和空腹血糖（FBG）水平，熒光素血管造影（FFA）觀察視網(wǎng)膜血管新生和熒光素滲漏，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測血清血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、促血管生成素-2（Ang-2）水平，蘇木素伊紅染色觀察視網(wǎng)膜組織病理形態(tài)變化，Western blot法檢測VEGF、缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）、血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）及Hippo信號通路蛋白表達(dá)。結(jié)果 與對照組比較，DR組大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞排列混亂、松散，新生血管形成，大量熒光素滲漏，體質(zhì)量、大腫瘤抑制激酶2（LATS2）、磷酸化YAP（p-YAP）表達(dá)降低，F(xiàn)BG、VEGF、Ang-2、HIF-1α、VCAM-1、YAP、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子（TAZ）、TEA結(jié)構(gòu)域家族成員1（TEAD1）表達(dá)增加（P＜0.05）；與DR組比較，Aca低、中、高劑量組和Verteporfin組大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞排列整齊，新生血管形成和熒光素滲漏減少，體質(zhì)量、LATS2、p-YAP表達(dá)增加，F(xiàn)BG、VEGF、Ang-2、HIF-1α、VCAM-1、YAP、TAZ、TEAD1表達(dá)降低（P＜0.05），高劑量組效果更明顯，但Verteporfin組與Aca高劑量組對DR大鼠各指標(biāo)的作用效果差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論 Aca能抑制DR大鼠血管生成，改善視網(wǎng)膜病理損傷，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)Hippo信號通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞：糖尿病視網(wǎng)膜病變；視網(wǎng)膜新生血管化；金合歡素；Hippo信號通路

中圖分類號：R774.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.11958/20230889

Effects of acacetin on angiogenesis in diabetes retinopathy rats by

regulating Hippo signaling pathway

CHEN Yujie， HUANG Xia， DENG Bolin， JIA Wenwen△

Department of Ophthalmology， Sichuan Academy of Medical Sciences， Sichuan Provincial People's Hospital，

Chengdu 610000， China

△Corresponding Author E-mail： hailunx60@163.com

Abstract： Objective To investigate the impact of acacetin （Aca） on angiogenesis in diabetes retinopathy （DR） rats by regulating Hippo signaling pathway. Methods Sixty SD rats were grouped into the control group， the DR group， the Aca low dose group （10 mg/kg）， the Aca medium dose group （20 mg/kg）， the Aca high dose group （30 mg/kg） and Hippo-YAP signaling pathway inhibitor Verteporfin group （Aca high dose 30 mg/kg+Verteporfin 0.8 pmol/kg）， with 10 rats in each group. Except the control group， streptozotocin and high-fat feed were used to construct the DR model. Body weight and fasting blood glucose （FBG） levels of rats were measured. Fluorescein angiography （FFA） was applied to observe retinal angiogenesis and fluorescein leakage. Enzyme linked immunosorbent assay was applied to detect serum levels of" vascular endothelial growth factor （VEGF） and angiopoietin-2 （Ang-2）. Pathological changes of retinal tissue were observed by hematoxylin-eosin staining. Western blot assay was applied to detect expression levels of VEGF， hypoxia-inducible factor 1 alpha （HIF-1α）， vascular cell adhesion molecule-1 （VCAM-1） and Hippo signaling pathway proteins. Results Compared with the control group， retinal cells of rats in the DR group were arranged in a disordered and loose manner， with neovascularization and a large amount of fluorescein leakage， and body weight， the expression of large tumor suppressor homolog 2 （LATS2）， p-Yes-associated protein （YAP） were reduced. FBG and expression levels of VEGF， Ang-2， HIF-1α， VCAM-1， YAP， transcription activator with PDZ binding motif （TAZ）， TEA domain family member 1 （TEAD1） were increased （P＜0.05）. Compared with the DR group， retina cells of rats in the Aca low， medium and high-dose groups and the Verteporfin group were arranged neatly， with reduced neovascularization and fluorescence leakage， body weight and the expression levels of LATS2 and p-YAP were increased， and FBG， expression levels of VEGF， Ang-2， HIF-1α， VCAM-1， YAP， TAZ and TEAD1 were reduced （P＜0.05）. The effect was more obvious in the Aca high dose group. However， there was no significant difference in each indicator between the Verteporfin group and the Aca high dose group. Conclusion Aca can inhibit angiogenesis and improve retinal pathological damage in DR rats， and its mechanism of action may be related to regulating the Hippo signaling pathway.

Key words： diabetic retinopathy; retinal neovascularization; acacin; Hippo signaling pathway

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）常見的微血管并發(fā)癥，可引發(fā)嚴(yán)重的視力障礙，病理特征是微動脈瘤形成、血管通透性增加、毛細(xì)血管閉塞以及新生血管生成［1］。DR病變早期無明顯癥狀，晚期病變對患者的視力影響較大。目前，DR治療方法包括激光手術(shù)和眼內(nèi)注射血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）拮抗劑，但這些療法可能導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)元破壞，造成不可逆的視網(wǎng)膜損傷，甚至導(dǎo)致視力喪失［2］。因此，迫切需要發(fā)現(xiàn)新的藥物以改善DR的治療效果。金合歡素（acacetin，Aca）是一種天然類黃酮化合物，具有抗氧化、抗炎、抗感染等作用，在癌癥和心血管疾病等方面具有治療潛力，能改善糖尿病引發(fā)的器官功能障礙［3］。已有研究發(fā)現(xiàn)，Aca作為明目地黃丸的主要活性成分，能有效治療DR［4］。因此，猜測Aca可能通過減少血管生成改善DR。Hippo信號通路是一個高度保守的信號級聯(lián)通路，可控制器官發(fā)育，主要通過調(diào)節(jié)yes相關(guān)蛋白（Yes-associated protein，YAP）、TEA結(jié)構(gòu)域家族成員1（TEA domain family member 1，TEAD1）等轉(zhuǎn)錄因子，從而調(diào)控下游靶基因的表達(dá)，控制細(xì)胞增殖，且與血管生成有關(guān)［5］。DR患者存在血管病變，新生血管伴隨著內(nèi)皮細(xì)胞的增殖是DR的一個重要特征。因此，Hippo信號通路可能在DR中發(fā)揮重要作用。研究顯示，Hippo信號通路的下游效應(yīng)分子YAP參與VEGF誘導(dǎo)的病理性血管生成，敲低或抑制YAP/TAZ可導(dǎo)致VEGF誘導(dǎo)的血管生成顯著減少，YAP可能是DR的潛在治療靶點(diǎn)［6-7］。目前，有關(guān)Aca通過調(diào)節(jié)Hippo信號通路影響DR血管生成的研究鮮見。本研究對此進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 主要材料 SPF級雄性SD大鼠60只，6～8周齡，體質(zhì)量200～230 g，購自四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物研究所，生產(chǎn)許可證號：SCXK（川）2020-0003。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，飼養(yǎng)環(huán)境溫度22 ℃左右，濕度55%，12 h/12 h光暗循環(huán)，不禁水食。本研究通過本院動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器 Aca（純度≥98%）、維替泊芬（Verteporfin）購自上海源葉生物科技有限公司；復(fù)方托吡卡胺購自長春迪瑞制藥有限公司；熒光素鈉溶液購自廣州白云山明興制藥有限公司；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）、蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色試劑盒購自北京索萊寶公司；VEGF、促血管生成素-2（angiopoietin-2，Ang-2）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購自武漢菲恩生物科技公司；兔源VEGF、缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia-inducible factor 1 alpha，HIF-1α）、血管細(xì)胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）、YAP、磷酸化YAP（p-YAP）、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子（transcription activator with PDZ binding motif，TAZ）、TEAD1、大腫瘤抑制激酶2（large tumor suppressor homolog 2，LATS2）、3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）一抗和山羊抗兔IgG二抗購自英國Abcam公司。血糖儀購自瑞士羅氏公司；小動物視網(wǎng)膜顯微成像系統(tǒng)購自英國OPTOPROBE公司；全自動酶標(biāo)儀購自美國Bio-Tek公司；光學(xué)顯微鏡購自德國Lecia公司。

1.3 研究方法

1.3.1 DR模型制作和分組 將60只大鼠隨機(jī)分為對照組（10只）和模型組（50只）。模型組參照文獻(xiàn)［8］制作DM模型，腹腔一次性注射60 mg/kg STZ，溶解在0.1 mL檸檬酸鹽緩沖液（pH=4.5）；對照組注射檸檬酸鹽緩沖液。注射STZ后72 h，血糖儀監(jiān)測大鼠空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG），連續(xù)3次FBG≥16.7 mmol/L即造模成功。所有DM大鼠均造模成功。采用高脂飼料喂養(yǎng)DM大鼠，對照組大鼠用正常飼料喂養(yǎng)。造模12周后，熒光素血管造影（fundus fluorescein angiography，F(xiàn)FA）觀察大鼠眼底出現(xiàn)視網(wǎng)膜出血、血管迂曲、微血管瘤等，表明DR大鼠造模成功。將模型大鼠分為DR組、Aca低劑量組、Aca中劑量組、Aca高劑量組、Verteporfin組（Hippo-YAP信號通路抑制劑），每組10只。Aca低、中、高劑量組分別皮下注射10、20、30 mg/kg的Aca［9］，Verteporfin組皮下注射30 mg/kg Aca和0.8 pmol/kg Verteporfin［10］。對照組和DR組注射相同劑量生理鹽水，每日1次，連續(xù)4周。

1.3.2 體質(zhì)量和FBG水平檢測 給藥結(jié)束后，測定各組大鼠體質(zhì)量變化情況；FBG檢測前1 d大鼠禁食12 h以上，尾靜脈采血1 mL，血糖儀檢測各組大鼠的FBG。

1.3.3 FFA檢查視網(wǎng)膜血管新生 取各組10只大鼠后麻醉，滴注復(fù)方托吡卡胺滴眼液于大鼠右眼，每次1滴，間隔5 min后滴第2次，15～20 min后充分散瞳，將10%的（2 mL/kg）熒光素鈉溶液腹腔注射于大鼠體內(nèi)，30 s后采用小動物視網(wǎng)膜顯微成像系統(tǒng)檢查各組大鼠視網(wǎng)膜血管新生和熒光素滲漏。

1.3.4 ELISA檢測血清VEGF、Ang-2水平 麻醉各組10只大鼠后腹主動脈采血2 mL，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液，按照ELISA試劑盒說明書檢測VEGF、Ang-2水平。

1.3.5 HE染色觀察視網(wǎng)膜組織病理形態(tài)變化 取各組麻醉大鼠并處死，摘除眼球，4只左眼球固定于4%多聚甲醛中，另外6只左眼球-80 ℃保存?zhèn)溆?。?%多聚甲醛固定的4只左眼球去除角膜、虹膜等多余組織，分離出視網(wǎng)膜組織，梯度乙醇脫水，石蠟包埋制成3 μm切片，脫蠟至水、HE染色、脫水封片后在光學(xué)顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜組織切片病理學(xué)變化并拍照。

1.3.6 Western blot檢測VEGF、HIF-1α及Hippo信號通路蛋白表達(dá) 取-80 ℃保存的6只大鼠左眼球，分離出視網(wǎng)膜組織，裂解、提取總蛋白，經(jīng)電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，在4 ℃下加入一抗VEGF、HIF-1α、VCAM-1、YAP、p-YAP、TAZ、TEAD1、LATS2（均1∶1 000）和GAPDH孵育過夜，清洗，在4 ℃下加入山羊抗兔二抗（1∶2 000）孵育2 h。用ECL發(fā)光顯影，觀察拍照，用Image J軟件處理分析各條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0和Graph Pad Prism 7統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)采用[x] ±s表示，多組間比較用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組體質(zhì)量和FBG水平比較 與對照組比較，DR組大鼠體質(zhì)量降低、FBG水平增加（P＜0.05）；與DR組比較，Aca低、中、高劑量組和Verteporfin組體質(zhì)量增加、FBG水平降低，且Aca高劑量組效果更明顯（P＜0.05）；Verteporfin組與Aca高劑量組大鼠體質(zhì)量、FBG水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。[Tab.1 Comparison of body weight and FBG of rats between the six groups

表1 各組大鼠體質(zhì)量、FBG水平比較" " " " " " " " "][（n=10，[x] ±s） ][ ＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與DR組比較，c與Aca低劑量組比較，d與Aca中劑量組比較，P＜0.05。][組別 體質(zhì)量/g FBG/（mmol/L） 對照組 432.68±45.09 5.27±0.62 DR組 285.93±29.65a 23.59±2.61a Aca低劑量組 358.76±36.92b 15.62±1.61b Aca中劑量組 382.05±39.02bc 10.07±1.14bc Aca高劑量組 417.25±42.83bcd 6.37±0.72bcd Verteporfin組 403.86±41.09bcd 6.48±0.68bcd F 28.295＊＊ 253.633＊＊ ]

2.2 各組大鼠視網(wǎng)膜新生血管情況比較 對照組大鼠視網(wǎng)膜血管排列均勻，無熒光素滲漏；DR組大鼠可見新生血管形成，大量熒光素滲漏；相較于DR組，Aca低、中、高劑量組新生血管形成和熒光素滲漏減少，且Aca高劑量組新生血管形成和熒光素滲漏減少最為明顯；Verteporfin組與Aca高劑量組新生血管形成和熒光素滲漏效果相當(dāng)，見圖1。lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image3_13.jpeggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image4_14.jpeggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image5_12.jpeggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image6_9.jpeggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image7_8.jpeggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image8_10.jpeggt;[對照組][DR組][Aca低劑量組][Aca中劑量組][Aca高劑量組][Verteporfin組][Fig.1 Retinal neovascularization in rats of each group （×20）

圖1 各組大鼠視網(wǎng)膜新生血管情況（×20）]

2.3 各組大鼠VEGF、Ang-2水平比較 與對照組比較，DR組大鼠VEGF、Ang-2水平增加（P＜0.05）；與DR組比較，Aca低、中、高劑量組和Verteporfin組VEGF、Ang-2水平降低，且Aca高劑量組效果更明顯（P＜0.05）；Verteporfin組與Aca高劑量組大鼠VEGF、Ang-2水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。[組別 VEGF/（ng/L） Ang-2/（μg/L） 對照組 105.32±10.38 6.38±0.66 DR組 163.58±17.14a 11.92±1.24a Aca低劑量組 139.74±13.18b 9.27±1.01b Aca中劑量組 125.07±12.49bc 8.04±0.91bc Aca高劑量組 109.31±11.26bcd 7.05±0.77bc Verteporfin組 110.83±11.75bcd 7.48±0.78bcd F 30.569＊＊ 47.819＊＊ ][Tab.2 Comparison of VEGF and Ang-2 levels between the six groups

表2 各組大鼠VEGF、Ang-2水平比較" " " " " " " " " " ][（n=10，[x] ±s） ][ ＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與DR組比較，c與Aca低劑量組比較，d與Aca中劑量組比較，P＜0.05。]

2.4 各組大鼠視網(wǎng)膜組織病理變化情況 對照組大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)清晰完整，視網(wǎng)膜細(xì)胞排列有序，分布均勻；DR組大鼠視網(wǎng)膜各層充血，內(nèi)核層與外核層細(xì)胞減少，視網(wǎng)膜細(xì)胞排列混亂、松散；相較于DR組，Aca低、中、高劑量組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)趨于完整，視網(wǎng)膜細(xì)胞排列整齊，且Aca劑量升高視網(wǎng)膜改善更明顯；Verteporfin組與Aca高劑量組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)相似，均趨于完整。見圖2。lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image9_11.jpeggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image10_10.jpeggt;[對照組][DR組]lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image11_9.jpeggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image12_6.jpeggt;[Aca低劑量組][Aca中劑量組]lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image13_6.jpeggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image14_4.jpeggt;[Aca高劑量組][Verteporfin組][Fig.2 HE staining of retinal tissue in each group （×200）

圖2 各組大鼠視網(wǎng)膜組織HE染色圖（×200）]

2.5 各組大鼠VEGF、HIF-1α、VCAM-1蛋白表達(dá)比較 與對照組比較，DR組大鼠VEGF、HIF-1α、VCAM-1蛋白相對表達(dá)水平增加（P＜0.05）；與DR組比較，Aca低、中、高劑量組和Verteporfin組VEGF、HIF-1α、VCAM-1蛋白表達(dá)相對表達(dá)水平降低，且Aca高劑量組效果更明顯（P＜0.05）；Verteporfin組與Aca高劑量組大鼠VEGF、HIF-1α、VCAM-1蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖3、表3。lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image15_10.jpeggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image16_8.jpeggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image17_8.jpeggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image18_7.jpeggt;[VEGF][HIF-1α][VCAM-1][GAPDH][A][B][C][D][E][F][ A：對照組；B：DR組；C：Aca低劑量組；D：Aca中劑量組；E：Aca高劑量組；F：Verteporfin組。][Fig.3 The expression levels of VEGF， HIF-1α and VCAM-1

protein in each group of rats detected by Western blot assay

圖3 Western blot檢測各組大鼠VEGF、HIF-1α、VCAM-1蛋白表達(dá)][組別 VEGF HIF-1α VCAM-1 對照組 0.42±0.09 0.58±0.06 0.38±0.04 DR組 1.43±0.15a 1.26±0.12a 1.36±0.18a Aca低劑量組 0.91±0.09b 0.95±0.09b 0.99±0.10b Aca中劑量組 0.73±0.07bc 0.73±0.08bc 0.61±0.07bc Aca高劑量組 0.52±0.06bcd 0.61±0.07bcd 0.45±0.05bcd Verteporfin組 0.59±0.06bcd 0.63±0.08bcd 0.43±0.04bcd F 95.456＊＊ 57.885＊＊ 103.997＊＊ ][Tab.3 Comparison of VEGF， HIF-1α and VCAM-1 protein expression between six groups of rats

表3 各組大鼠VEGF、HIF-1α、VCAM-1蛋白相對表達(dá)

水平比較][（n=6，[x] ±s） ][ ＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與DR組比較，c與Aca低劑量組比較，d與Aca中劑量組比較，P＜0.05。]

2.6 各組大鼠Hippo信號通路蛋白表達(dá)比較 與對照組比較，DR組大鼠YAP、TAZ、TEAD1蛋白相對表達(dá)水平增加，LATS2、p-YAP降低（P＜0.05）；與DR組比較，Aca低、中、高劑量組和Verteporfin組YAP、TAZ、TEAD1蛋白相對表達(dá)水平降低，LATS2、p-YAP增加，且Aca高劑量組效果更明顯（P＜0.05）；Verteporfin組與Aca高劑量組上述蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖4、表4。lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image19_8.jpeggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image20_7.jpeggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image21_7.jpeggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image22_5.jpeggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image23_5.jpeggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image24_3.jpeggt;[A][B][C][D][E][F][ A：對照組；B：DR組；C：Aca低劑量組；D：Aca中劑量組；E：Aca高劑量組；F：Verteporfin組。][p-YAP][YAP][LATS2][TAZ][TEAD1][GAPDH][Fig.4 Hippo signaling pathway protein expression results of rats in each group detected by Western blot assay

圖4 Western blot檢測各組大鼠Hippo信號通路蛋白表達(dá)]

3 討論

DR由DM誘發(fā)，可引發(fā)視網(wǎng)膜毛細(xì)血管、小動脈和小靜脈病變以及小血管滲漏或閉塞［1］。高血糖是DR的主要驅(qū)動因素，會導(dǎo)致嚴(yán)重的代謝、生化異常［11］。VEGF是與DR發(fā)展有關(guān)的血管生長因子，在高血糖環(huán)境下的視網(wǎng)膜細(xì)胞中VEGF高水平表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致視網(wǎng)膜內(nèi)皮通透性增加和增殖異常，促進(jìn)視網(wǎng)膜血管滲漏和血管生成［12］。已有研究發(fā)現(xiàn)，抑制DR大鼠VEGF的表達(dá)可減少血管形成［11］。HIF-1α水平增加與視網(wǎng)膜血管生成密切相關(guān)，DR可誘導(dǎo)HIF-1α表達(dá)增加，從而促進(jìn)VEGF的表達(dá)［14］。Ai等［15］發(fā)現(xiàn)，通過抑制HIF-1α/VEGF途徑可緩解DR血管生成。Ang-2參與血管生成和血管修復(fù)的血管生長因子，可與VEGF以協(xié)同方式促進(jìn)血管通透性并刺激視網(wǎng)膜血管生成［16］。DR早期階段，在眼外和視網(wǎng)膜血管中VCAM-1表達(dá)水平增加，導(dǎo)致白細(xì)胞黏附增加，促進(jìn)血管生成［17］。本研究結(jié)果顯示，DR大鼠VEGF、Ang-2、HIF-1α、VCAM-1表達(dá)水平較對照組顯著增加，表明DR大鼠模型構(gòu)建成功，提示高血糖導(dǎo)致血管生成相關(guān)因子水平升高，促進(jìn)DR大鼠血管生成。

Aca對糖尿病及其并發(fā)癥也具有一定的治療作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，Aca通過抑制氧化應(yīng)激和能量代謝可減輕DM引起的心肌?。?］；Aca還可能通過促進(jìn)足細(xì)胞增殖改善糖尿病腎病的發(fā)展［18］。此外，Aca還能抑制肝癌細(xì)胞增殖、存活，并下調(diào)血管生成相關(guān)蛋白VEGF的表達(dá)［19］；Aca通過靶向抑制VEGF，對多種癌癥表現(xiàn)出治療作用［20］。本研究結(jié)果顯示，Aca干預(yù)后大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞排列整齊，新生血管形成和熒光素滲漏減少，體質(zhì)量顯著增加，F(xiàn)BG、VEGF、Ang-2、HIF-1α表達(dá)顯著降低，且Aca高劑量改善效果優(yōu)于低、中劑量，表明Aca可以降低DR大鼠視網(wǎng)膜血管通透性，降低血管生成因子的水平，進(jìn)而減輕DR大鼠視網(wǎng)膜損傷，抑制血管生成，提示Aca可通過抑制血管生成來治療DR。

已知Hippo通路可通過控制YAP來調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和器官發(fā)育，LATS2是YAP的上游調(diào)節(jié)器，可通過激活Hippo通路來激活LATS2，進(jìn)而磷酸化YAP、TAZ［21］。已有研究表明，Hippo通路通過增加VEGF表達(dá)參與細(xì)胞增殖和血管生成，YAP激活進(jìn)入細(xì)胞核后與其配體TEAD結(jié)合，促進(jìn)參與細(xì)胞遷移和血管生成的相關(guān)信號因子的生成［7］。Hippo信號通路中LATS2過表達(dá)會導(dǎo)致VEGF低表達(dá)，抑制YAP/TAZ可抑制VEGF表達(dá)，減少血管生成，因此Hippo信號通路對VEGF有調(diào)節(jié)作用［22］。Zhu等［23］研究發(fā)現(xiàn)，川芎嗪通過抑制VEGF/Hippo/YAP信號通路減少腹膜血管生成，改善腹膜纖維化。Feng等［24］研究顯示，抑制YAP可顯著抑制視網(wǎng)膜病變小鼠模型中的新生血管生長。本研究發(fā)現(xiàn)，DR組大鼠較對照組YAP、TAZ、TEAD1蛋白相對表達(dá)水平顯著增加，LATS2、p-YAP顯著降低，表明Hippo通路參與DR大鼠的血管生成；而Aca干預(yù)后YAP、TAZ、TEAD1蛋白表達(dá)顯著降低，LATS2、p-YAP表達(dá)增加，表明Aca可能通過調(diào)節(jié)Hippo信號通路來減少DR大鼠血管生成。為進(jìn)一步驗(yàn)證Aca對Hippo信號通路有無干預(yù)作用，選用Hippo信號通路抑制劑Verteporfin干預(yù)大鼠，發(fā)現(xiàn)Aca對DR大鼠血管生成的改善作用與Verteporfin結(jié)果相似，提示Aca對DR大鼠血管生成的改善作用可能是通過調(diào)節(jié)Hippo/YAP信號通路來實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，Aca能抑制DR大鼠血管生成，改善視網(wǎng)膜病理損傷，有望成為治療DR的藥物，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)Hippo信號通路有關(guān)。本研究為改善DR大鼠血管生成提供了新思路，但Aca對DR血管生成的其他分子機(jī)制仍有待闡明。

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（2023-06-12收稿 2023-08-30修回）

（本文編輯 陸榮展）