橡膠樹膠孢炭疽菌自噬相關基因ATG20的功能

黃志睿 廖至雯 羅紅麗

摘要：膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）是引起橡膠樹炭疽病的優(yōu)勢小種，橡膠樹感染后會大量減產(chǎn)。自噬現(xiàn)象是植物病原真菌中普遍存在的生理過程，自噬過程會受到多個自噬相關基因（ATG）的調(diào)控，在病原真菌對逆境的響應、生長發(fā)育和致病性方面具有重要作用。本研究克隆了橡膠樹膠孢炭疽菌的ATG20同源基因CgATG20，構建了該基因的敲除突變株△CgATG20，并對其致病性、孢子產(chǎn)量、組織侵染情況和自噬情況等進行分析。結果顯示，與野生型相比，△CgATG20的致病性、分生孢子產(chǎn)量和對植物的入侵率顯著降低。在缺氮條件下，△CgATG20菌絲體中自噬小體的數(shù)量顯著少于野生型。以上結果表明ATG20在膠孢炭疽菌的生長發(fā)育、致病性和自噬中發(fā)揮重要作用，這為尋找有效阻斷病原真菌發(fā)育和侵染途徑的防治策略提供了新的靶點。

關鍵詞：橡膠樹；膠孢炭疽菌；自噬；ATG20；致病力

中圖分類號：S432.4+4文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2024）04-0636-09

Function of the autophagy-related gene ATG20 in Colletotrichum gloeosporioides in Hevea brasiliensis

HUANG Zhi-rui1，LIAO Zhi-wen2，LUO Hong-li 1

（1.Sanya Institute of Breeding and Multiplication， Hainan University， Sanya 572000， China;2.Hainan Yazhou Bay Seed Laboratory， Sanya 572000， China）

Abstract：Colletotrichum gloeosporioides is the dominant race that causes anthracnose on rubber trees， resulting in substantial reduction in rubber production. Autophagy is a common physiological process in plant pathogenic fungi， which is regulated by multiple autophagy related genes （ATG） and plays an important role in stress response， growth and pathogenicity of pathogenic fungi. In this study， the ATG20 homologous gene in C. gloeosporioides of rubber tree was cloned and named as CgATG20， and the CgATG20 gene knockout mutant △CgATG20 was constructed. The pathogenicity， spore production， tissue infection and autophagy of the mutant △CgATG20 were analyzed. The results showed that the pathogenicity， conidium production and plant invasion rate of △CgATG20 were significantly reduced compared with wild type. Under the condition of nitrogen deficiency， the number of autophagosomes in △CgATG20 mycelium was significantly less than that of wild type. The above results indicate that ATG20 plays an important role in the growth and development， pathogenicity and autophagy of C. gloeosporioides， which provides a new target for finding control strategies that can effectively block the development and infection pathways of pathogenic fungi.

Key words：rubber tree；Colletotrichum gloeosporioides;autophagy;ATG20;pathogenicity

細胞自噬是真核細胞中在進化上高度保守的、用于降解并利用細胞內(nèi)過多或異常的蛋白質(zhì)或細胞器的過程[1]。當自噬被誘導后，首先自噬膜在自噬體組裝位點（PAS）處延伸形成自噬泡，隨后多種蛋白質(zhì)和膜材料參與自噬膜的延伸、融合和擴張，最終形成雙層膜的自噬體，自噬體捕獲需降解的蛋白質(zhì)、細胞器等物質(zhì)，將其內(nèi)容物運送至溶酶體腔降解成小分子物質(zhì)[2]。

根據(jù)對降解底物的選擇性的不同，自噬可分為非選擇性自噬和選擇性自噬，其中非選擇性自噬隨機對底物進行降解，而選擇性自噬是與特定的底物結合并將其降解，有利于維持細胞器的完整性和數(shù)量[3]。細胞質(zhì)空泡靶向（Cvt）途徑、線粒體自噬、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬、過氧化物酶體自噬、核糖體自噬等都屬于選擇性自噬[4]。在選擇性自噬中，一類具有磷酸肌醇結合PX（Phox結構域同源）結構域的蛋白質(zhì)被稱為分選連接蛋白質(zhì)（SNX），該蛋白質(zhì)對于貨物蛋白質(zhì)的識別和運輸起著重要作用[5]。在酵母中，自噬相關基因（ATG）ATG20編碼一種分選連接蛋白質(zhì)，在該蛋白質(zhì)的缺失突變體中幾乎檢測不到成熟的氨基肽酶（Ape1），導致Cvt途徑缺陷[6-7]。而且，酵母的ATG20與ATG24蛋白存在功能冗余，不僅影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬和線粒體自噬過程中的液泡運輸[8]，還影響非選擇性自噬的液泡運輸和自噬小體的形成[9-10]。在稻瘟病病菌（Magnaporthe oryzae）中MoSnx41與酵母ATG20同源，MoSnx41缺失突變體表現(xiàn)出產(chǎn)孢能力減弱、致病性減弱和過氧化物酶體自噬缺陷[11]。在禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）中，F(xiàn)gATG20被證明不僅參與自噬小體的形成和Cvt途徑，而且調(diào)控病菌的生長、孢子產(chǎn)量和致病性[12]。在玉米小斑病病原菌異旋孢腔菌（Cochliobolus heterostrophus）中，ChATG20參與病菌正常無性生長和致病力的調(diào)控[5]。由此可見，不同真菌中ATG20的功能存在差異。

天然橡膠是重要的工業(yè)原料和戰(zhàn)略資源，由膠孢炭疽菌引起的橡膠樹炭疽病是導致橡膠減產(chǎn)的重要因素之一[13]。自噬對植物病原真菌的生長發(fā)育和致病性具有重要影響，深入研究自噬的機制和影響因素能為研發(fā)可有效阻斷病原真菌發(fā)育和侵染途徑的防治策略提供新的靶點[14-15]，但是目前對于膠孢炭疽菌自噬機理和自噬相關基因的研究不多，僅對CgAtg4和CgATG8進行了克隆和初步的功能分析[16-17]。本研究擬克隆和分析膠孢炭疽菌中的CgATG20基因，構建該基因的2個敲除突變株△CgATG20-1和△CgATG20-2，分析CgATG20對膠孢炭疽菌致病力、分生孢子產(chǎn)量和附著胞生長發(fā)育以及自噬的影響，為解析膠孢炭疽菌自噬機理提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

膠孢炭疽菌菌株由本實驗室分離保存；致病性分析所用的巴西橡膠樹品種為熱研7-33-97。

試驗中用于進行目的片段擴增的高保真酶購自北京全式金生物技術有限公司；用于目的片段檢測的2×Taq Master Mix購自近岸蛋白質(zhì)科技股份有限公司；用于原生質(zhì)體轉化試驗的PEG4000、氯嘧磺隆和用于自噬染色的單丹磺酰尸胺（MDC）購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基購自北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；羧芐青霉素（Car）和卡那霉素（Kan）購自賽國生物科技有限公司；鈣熒光白（CFW）購自源葉生物有限公司；十二烷基硫酸鈉（SDS）購自北京美萊博醫(yī)學科技有限公司；剛果紅（CR）購自北京索萊寶科技有限公司；苯甲基磺酰氟（PMSF）購自蘭杰柯科技有限公司。

CM培養(yǎng)基：葡萄糖10 g、微量元素1 ml、維生素1 ml、硝酸鹽50 ml、蛋白胨2 g、酵母提取物1 g、酸水解酪蛋白1 g，加 ddH2O定容到1 L，121 ℃高壓滅菌20 min。MM培養(yǎng)基：氯化鉀0.50 g、硝酸鈉2.00 g、磷酸二氫鉀1.00 g、七水硫酸鎂0.50 g、七水硫酸亞鐵0.01 g、蔗糖30.00 g、微量元素200 μl，加 ddH2O 定容到1 L，121 ℃高壓滅菌20 min。在MM培養(yǎng)基配方的基礎上去除硝酸鈉即為MM-N缺氮培養(yǎng)基。

1.2試驗方法

1.2.1生物信息學分析引物設計采用Primer Premier 5.0 軟件，引物合成由北京擎科生物科技股份有限公司完成。使用美國國家生物技術信息中心蛋白質(zhì)注釋資源（NCBI CDD）分析蛋白質(zhì)的保守結構域，使用在線工具NovoPro（https：//novopro.cn/tools/signalp.html）和DeepTMHMM（https：//dtu.biolib.com/DeepTMHMM）預測蛋白質(zhì)信號肽和跨膜結構域，使用DNAMAN軟件對蛋白質(zhì)進行序列對比，使用MEGA 4.0軟件進行系統(tǒng)進化樹的構建。

1.2.2敲除突變體的構建根據(jù)同源重組敲除原理，利用融合PCR擴增目的基因的上下游同源臂和抗性基因的融合片段，使用聚乙二醇（PEG）介導的轉化法將融合片段轉入到膠孢炭疽菌的原生質(zhì)體中[18]，對獲得的抗性轉化子進行單孢分離和PCR檢測。PCR檢測結果顯示上游、下游片段擴增結果呈陽性而目的基因擴增結果呈陰性的轉化子為純合的敲除突變株。

1.2.3生長速率分析參照Liu等[19]的方法進行。將生長狀況一致的待測菌株用無菌打孔器打出相同大小的菌塊，將其分別接種在PDA培養(yǎng)基中央，置于28 ℃培養(yǎng)6 d，用十字交叉法測量菌落直徑并拍照，對數(shù)據(jù)進行生物統(tǒng)計學分析。試驗獨立重復3次且每次有3個以上重復。

1.2.4分生孢子產(chǎn)量分析參照Liu等[19]的方法進行。將待測菌株置于完全培養(yǎng)基（CM培養(yǎng)基）中，在28 ℃ 120 r/min條件下培養(yǎng)2 d，用濾膜過濾1 ml新鮮孢子懸浮液，8 000 r/min離心1 min獲得橙黃色分生孢子沉淀，倒掉上清液，加入1 ml ddH2O振蕩混勻，重復以上步驟，清洗2遍分生孢子后加1 ml ddH2O振蕩混勻，使用顯微鏡計數(shù)，將孢子含量調(diào)整到1 ml 1×103個，往30 ml CM培養(yǎng)基中加入羧芐青霉素、卡那霉素和1 ml稀釋好的孢子液，在28 ℃ 120 r/min條件下培養(yǎng)3 d，過濾孢子液，使用血球計數(shù)板在顯微鏡下對分生孢子計數(shù)。試驗獨立重復3次且每次有3個以上重復。

1.2.5致病性分析參照Gao等[20]的方法進行。將重懸于CM培養(yǎng)基的新鮮的菌液孢子含量調(diào)整至1 ml 2×105個，采集生長狀態(tài)相對一致的橡膠樹苗葉片，接種5 μl菌液在完整葉片或預先刺傷的葉片上，保濕并做好標記，在28 ℃黑暗條件下培養(yǎng)3 d后拍照留存并測量病斑直徑進行統(tǒng)計分析。試驗獨立重復3次且每次有3個以上重復。

1.2.6細胞壁應激分析參照Liu等[19]的方法進行。將待測菌株培養(yǎng)5～6 d，用無菌打孔器打出相同大小的菌塊，將菌塊分別轉接于添加了SDS（0.005%）、CFW（200 μg/ml）和剛果紅（250 μg/ml）的PDA培養(yǎng)平板中央，置于28 ℃培養(yǎng)6 d。測量菌落直徑并拍照，計算并分析生長抑制率。每個樣品至少設置3個重復。

1.2.7附著胞形成分析參照Gao等[20]的方法進行。將重懸于新鮮的CM液體培養(yǎng)基中的菌液孢子含量調(diào)整至1 ml 5×105個，接種5 μl在聚苯乙烯板上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)，于不同時間點在顯微鏡下觀察，拍照并進行附著胞形成率的統(tǒng)計分析。試驗獨立重復3次。

1.2.8洋蔥表皮穿透力分析參照Gao等[20]的方法進行。將新鮮的孢子懸浮液稀釋至1 ml 2.5×105個的孢子含量，小心揭下洋蔥內(nèi)表皮，將其置于培養(yǎng)皿中，接種5 μl稀釋的孢子懸浮液在洋蔥內(nèi)表皮上，于28 ℃保濕培養(yǎng)12 h后觀察并拍照，統(tǒng)計穿透洋蔥內(nèi)表皮的附著胞比例。試驗獨立重復3次。

1.2.9氮饑餓誘導自噬參照廖至雯等[21]改良的Veneault-Fourrey等[22]的方法進行。用CM液體培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得新鮮的孢子懸浮液，稀釋至1 ml 5×105個，將20 ml孢子液在28 ℃ 120 r/min的條件下培養(yǎng)24 h獲得菌絲體，將培養(yǎng)獲得的菌絲體吸取出來平均分裝到不同離心管中，然后加入1 ml ddH2O輕搖混勻，重復以上步驟，用離心水洗2遍以洗去CM培養(yǎng)基營養(yǎng)，再將菌絲體加入到不同培養(yǎng)基中進行處理，并加入PMSF溶液（終濃度4 mmol/L）使其發(fā)生氮饑餓誘導的自噬，在28 ℃ 120 r/min條件下培養(yǎng)3 h后，加入MDC染液（終濃度100 μmol/L）避光染色30 min，洗去營養(yǎng)和MDC染液，在熒光顯微鏡下觀察和統(tǒng)計自噬小體的數(shù)目。試驗獨立重復3次。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用 Graphpad prism 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計及差異分析，單變量數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，采用Duncans多重范圍檢驗。在P<0.05時的差異被認為是顯著的。

2結果與分析

2.1CgATG20的基因擴增和生物信息學分析

在膠孢炭疽菌的轉錄組中，我們發(fā)現(xiàn)了一個編碼自噬相關蛋白質(zhì)ATG20的基因（XP_045265376.1），將其命名為CgATG20。通過RT-PCR技術擴增了該基因的編碼區(qū)并進行了測序驗證，結果表明該基因編碼了1條含有 636 個氨基酸的多肽鏈，相對分子質(zhì)量約為70 300，等電點（pI）為5.41。該蛋白質(zhì)序列與酵母（Saccharomyces cerevisiae）ScATG20（AJV07481.1）、稻瘟病病菌（Magnaporthe oryzae）MoATG20（MGG_12832）和禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）FgATG20（FGSG_06950）的一致性分別為28.65%、75.08%和75.31%。NCBI CDD分析結果顯示，CgATG20 蛋白含有位于第117～227 aa處的PX保守結構域和第308～629 aa處的 BAR （Bin/Amphiphysin/Rvs）保守結構域。使用在線工具NovoPro 和DeepTMHMM預測，結果表明，CgATG20蛋白不含信號肽和跨膜結構域。利用DNAMAN軟件對CgATG20和其他幾個主要植物病原真菌的ATG20進行多序列對比，結果顯示，CgATG20與其他同源蛋白質(zhì)在結構域PX和BAR處高度保守（圖1A）。利用MEGA 4.0軟件對CgATG20與其他同源蛋白質(zhì)和禾谷鐮刀菌的28個ATG蛋白的氨基酸序列進行系統(tǒng)進化樹的構建，結果（圖1B）顯示，CgATG20與來自稻瘟病病菌的MoATG20、禾谷鐮刀菌的FgATG20和煙曲霉菌的AfATG20位于同一分支，其中與禾谷鐮刀菌FgATG20的親緣關系最近。以上結果表明，CgATG20是膠孢炭疽菌中ATG20的同源蛋白質(zhì)。

2.2CgATG20敲除突變體的構建

為了研究CgATG20的生物學功能，我們根據(jù)同源重組原理構建膠孢炭疽菌的敲除突變株（圖2A）。利用PCR技術分別擴增了CgATG20的上游同源臂（702 bp）、下游同源臂（804 bp）和氯嘧磺隆抗性基因SUR（2 807 bp），用融合PCR的方法得到帶有氯嘧磺隆的片段，使用PEG介導法將片段轉入膠孢炭疽菌野生型的原生質(zhì)體中，利用抗性篩選出陽性轉化子并進行單孢分離，獲得2個純合株系，通過PCR技術檢測，在2個純合株系的基因組中均可以檢測到上游片段（圖2B）和下游片段（圖2C），但檢測不到目的基因的存在（圖2D），說明CgATG20基因已經(jīng)被成功敲除。將這2個純合株系分別命名為△CgATG20-1和△CgATG20-2。

2.3CgATG20對膠孢炭疽菌致病力影響

為了探究CgATG20對膠孢炭疽菌致病力的影響，用野生型（WT）、△CgATG20-1和△CgATG20-2的孢子懸浮液分別接種離體橡膠樹葉片，3 d后觀察到WT、△CgATG20-1和△CgATG20-2都能夠引起典型的病斑，且△CgATG20-1和△CgATG20-2引起的病斑明顯小于WT引起的病斑（圖3A），進一步測量并統(tǒng)計分析病斑直徑，結果顯示，△CgATG20-1和△CgATG20-2引起的病斑直徑顯著小于WT引起的病斑直徑（圖3B），說明CgATG20的缺失導致膠孢炭疽菌對橡膠樹葉片的致病能力顯著降低，CgATG20能夠影響膠孢炭疽菌對橡膠樹的致病力。

2.4CgATG20對菌落生長和產(chǎn)孢能力的影響

為了探究CgATG20是否影響膠孢炭疽菌的生長發(fā)育，將WT和△CgATG20接種在PDA培養(yǎng)基上，6 d后觀察到△CgATG20-1和△CgATG20-2的菌落形態(tài)與WT沒有明顯差異（圖4A），菌落直徑統(tǒng)計分析結果顯示，△CgATG20-1和△CgATG20-2的菌落直徑分別比WT減少了11.5%和12.3%，具有顯著差異（圖4B）。對孢子產(chǎn)量的統(tǒng)計結果表明，△CgATG20-1和△CgATG20-2的孢子產(chǎn)量顯著低于WT的孢子產(chǎn)量（圖4C）。以上結果說明CgATG20參與調(diào)控病菌的產(chǎn)孢能力和菌落的放射性生長。

2.5CgATG20對細胞壁完整性的影響

為了探究CgATG20對細胞壁完整性的影響，我們將WT和△CgATG20接種在添加了SDS（0.005%）、CFW（200 μg/ml）和CR（250 μg/ml）的PDA培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，6 d后觀察，結果顯示，△CgATG20-1和△CgATG20-2的菌落形態(tài)與WT沒有明顯差異（圖5A）。抑制率分析結果顯示，這幾種藥劑對△CgATG20-1和△CgATG20-2的生長抑制率與對WT的生長抑制率也沒有明顯差異（圖5B）。以上結果說明，CgATG20不參與細胞壁應激反應，與膠孢炭疽菌的細胞壁完整性無關。

2.6CgATG20對膠孢炭疽菌侵染結構形成的影響

為了探究CgATG20是否影響膠孢炭疽菌侵染結構的形成，我們觀察并分析了分生孢子在疏水聚苯乙烯板表面形成附著胞的過程（圖6A）和對洋蔥表皮的侵染過程。結果表明，WT、△CgATG20-1和△CgATG20-2的孢子形態(tài)和附著胞形成率沒有顯著差異（圖6B、圖6C）。洋蔥表皮接種試驗結果顯示，在侵染過程中附著胞存在2種類型，我們將其分為TypeⅠ和TypeⅡ，其中TypeⅠ可以形成正常的侵染菌絲，TypeⅡ不能形成侵染菌絲（圖6D）。在WT菌株侵染過程中，約有80%的附著胞可以形成正常的侵染菌絲（TypeⅠ），而在△CgATG20-1和△CgATG20-2菌株侵染過程中，形成正常侵染菌絲的附著胞只占不到20%，大部分為TypeⅡ（圖6C、圖6D）。以上結果表明，CgATG20并不影響附著孢的形成，但在侵染過程中發(fā)揮重要作用。

2.7CgATG20參與氮饑餓誘導的自噬

根據(jù)文獻報道，禾谷鐮刀菌中ATG20在自噬過程中參與了自噬小體的形成[12]。為了探究CgATG20是否參與膠胞炭疽菌自噬小體的形成，我們將WT和△CgATG20菌株的菌絲在氮缺失培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 h后進行MDC染色。結果顯示，WT菌株在CM培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下，菌絲體中熒光強度較弱且?guī)缀跤^察不到自噬小體，在基本培養(yǎng)基（MM培養(yǎng)基）和氮饑餓條件下，WT菌株熒光亮度增強且形成明顯的自噬小體；而△CgATG20-1和△CgATG20-2菌絲體中熒光強度普遍弱于WT且沒有明顯的自噬小體形成（圖7A）。進一步對不同菌株中自噬小體的數(shù)目進行統(tǒng)計分析，結果表明，2個突變體菌株中的自噬小體數(shù)量顯著低于野生型中的自噬小體數(shù)量（圖7B）。以上結果說明CgATG20參與了自噬小體的形成。

3討論

自噬現(xiàn)象是植物病原真菌中普遍存在的生理過程，該過程由多個自噬相關基因參與。ATG20原名Cvt20，因從酵母Cvt途徑缺陷突變體中篩選出來而得名，后來被統(tǒng)一命名為ATG20[6]。目前，真菌中已經(jīng)被鑒定的ATG20蛋白并不多，主要包括釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、稻瘟病病菌（Magnaporthe oryzae）和禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）、玉米旋孢腔菌（Cochliobolus heterostrophus）和煙曲霉（Aspergillus fumigatus）的同源蛋白質(zhì)，這些不同真菌的ATG20同源蛋白質(zhì)結構中都含有保守的PX和BAR結構域[5，10-11，23-24]。本研究的生物信息學分析結果表明，CgATG20蛋白同樣含有PX和BAR保守結構域，同時系統(tǒng)進化樹的分析結果也顯示CgATG20與來自其他真菌的ATG20位于同一分支，與禾谷鐮刀菌FgATG20的親緣關系最近。因此，從蛋白質(zhì)結構和進化關系上來說CgATG20應該就是膠孢炭疽菌中ATG20的同源蛋白質(zhì)。

已有的研究結果證明，自噬相關基因在植物病原真菌的生長發(fā)育和致病性中起著關鍵作用，而且同一自噬相關同源基因在不同病原真菌中的功能也存在差異[25]。例如：在稻瘟病病菌中，MoATG20的缺失導致分生孢子的形成缺陷和致病力減弱，說明MoATG20與稻瘟病病菌的分生孢子的產(chǎn)生和致病力有關[11]；在禾谷鐮刀菌中，F(xiàn)gATG20的敲除突變體表現(xiàn)為病菌營養(yǎng)生長緩慢、病菌在寄主組織中的傳播和癥狀的發(fā)展受阻，但無性孢子的形成率沒有改變，證明FgATG20在病菌的營養(yǎng)生長和致病性調(diào)控中發(fā)揮重要作用，但對有性孢子的發(fā)育影響不大[23]；在玉米旋孢腔菌中，ChATG20/ChSNX41的缺失影響病菌的營養(yǎng)生長和分生孢子的產(chǎn)量，同時導致病菌對玉米的致病力顯著降低，而且病菌對氧化脅迫、細胞壁完整性應激、殺菌劑和異硫氰酸酯的敏感性顯著增強[5]；在煙曲霉中，AfATG20受到蛋白激酶A（PKA）的磷酸化調(diào)節(jié)，對煙曲霉生長、病菌細胞壁應激反應和病菌毒力有重要影響[24]。我們發(fā)現(xiàn)CgATG20與其他病原真菌中的同源蛋白質(zhì)一樣影響病菌營養(yǎng)生長、分生孢子產(chǎn)量和對寄主的致病性，盡管CgATG20對膠孢炭疽菌的附著胞形成和發(fā)育沒有影響，但能調(diào)控侵染菌絲的產(chǎn)生和入侵，說明CgATG20影響膠孢炭疽菌的侵染過程，但其對侵染過程的調(diào)控機制還需要進一步的解析。

如前所述，CgATG20的蛋白質(zhì)結構中存在PX和BAR保守結構域。已有的研究結果表明，PX結構域是一個磷酸肌苷結合結構域，含有該類結構域的蛋白質(zhì)在與分泌和內(nèi)吞作用相關的膜運輸、細胞信號轉導和脂質(zhì)代謝中具有多種功能，多被稱為分類連接蛋白質(zhì)（SNX）[26-27]。ATG20的PX結構域能夠與磷脂酰肌醇3-單磷酸（PI3P）結合參與前自噬體結構的形成[28]。BAR 結構域是一種存在于多種蛋白質(zhì)中的膜脂結合結構域，它不僅與脂質(zhì)雙分子層結合，還具有膜雕刻能力，能夠直接控制生物膜的拓撲結構，誘導膜彎曲[5，29]。ATG20與同屬于分類連接蛋白質(zhì)的ATG24可以通過BAR結構域相互作用組裝成異源二聚體，是內(nèi)吞體循環(huán)所必需的[8，30]。因此，自噬相關蛋白質(zhì)ATG20是分類連接蛋白質(zhì)家族的關鍵成員，其中的PX和BAR結構域均參與自噬和膜重塑過程[10]，在細胞質(zhì)-液泡靶向（Cvt）途徑介導的選擇性自噬過程中發(fā)揮重要作用[7，31-32]。在本研究中，我們通過MDC染色的方法分析了CgATG20對膠孢炭疽菌自噬的影響，發(fā)現(xiàn)在經(jīng)過氮饑餓誘導自噬的WT菌絲體中，形成自噬小體的數(shù)量顯著多于CgATG20敲除突變體中形成的自噬小體的數(shù)量，證明了CgATG20參與自噬小體的形成，與膠孢炭疽菌的自噬過程有關。在酵母和禾谷鐮刀菌中的研究結果已經(jīng)證明Atg20與Atg24、Atg11和Atg17直接相互作用形成蛋白質(zhì)復合物參與自噬起始系統(tǒng)[6，12，33-34]，那么CgATG20是否以同樣的作用方式發(fā)揮作用？這還需要進一步的試驗證明。

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（責任編輯：陳海霞）

收稿日期：2023-09-17

基金項目：國家自然科學基金項目（32260716、32060591）

作者簡介：黃志睿（2000-），男，河南許昌人，碩士研究生，主要從事膠孢炭疽菌的自噬相關基因功能研究。（E-mail）1657072859@qq.com

通訊作者：羅紅麗，（E-mail）hlluo@hainanu.edu.cn