玉米ZmZIM家族基因鑒定及其對(duì)氮素的響應(yīng)特征

孫揚(yáng)名 張明亮 葛敏 鄔奇 趙涵

摘要：為明確玉米ZmZIM家族基因結(jié)構(gòu)、位置、編碼蛋白質(zhì)性質(zhì)及其對(duì)氮素的響應(yīng)特征，本研究利用TBtools、MEGA X等軟件分析玉米ZmZIM家族基因的結(jié)構(gòu)、染色體位置、順式作用元件及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系及其編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域及基序，結(jié)合玉米不同發(fā)育時(shí)期不同器官的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及充足氮與低氮水平下四葉一心期玉米地上部轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)解析玉米ZmZIM家族基因的表達(dá)模式及差異。結(jié)果表明：從玉米全基因組中共鑒定到32個(gè)玉米ZmZIM基因，主要分布于1號(hào)、2號(hào)、5號(hào)和7號(hào)染色體， 8號(hào)和10號(hào)染色體上無ZmZIM基因。32個(gè)ZmZIM基因可劃分為4個(gè)亞類，其編碼蛋白質(zhì)由134～467個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，均為親水性蛋白質(zhì)且全部定位在細(xì)胞核中。32個(gè)ZmZIM基因啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件主要有調(diào)控元件、光信號(hào)響應(yīng)元件、激素信號(hào)響應(yīng)元件、脅迫響應(yīng)元件、生長發(fā)育元件及蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)等6大類。不同發(fā)育時(shí)期，ZmZIM基因在玉米不同器官中存在差異性表達(dá)；在充足氮與低氮處理下，隨著處理時(shí)間的增加，玉米植株地上部12個(gè)ZmZIM基因無表達(dá)或相對(duì)表達(dá)量較低，6個(gè)ZmZIM基因相對(duì)表達(dá)量較高且穩(wěn)定，其余的14個(gè)ZmZIM基因的相對(duì)表達(dá)量差異較大；ZmZIM5、ZmZIM16、和ZmZIM31 3個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量普遍高于其他基因。充足氮條件下，ZmZIM8、ZmZIM15、ZmZIM20、ZmZIM24、ZmZIM29和ZmZIM31基因的相對(duì)表達(dá)量普遍高于低氮條件。本研究結(jié)果為玉米氮高效吸收利用基因篩選和利用奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：玉米；ZIM轉(zhuǎn)錄因子；基因家族分析；氮響應(yīng)

中圖分類號(hào)：S513文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-4440（2024）04-0577-14

Identification of ZmZIM family genes and their response to nitrogen in maize

SUN Yang-ming1，2，ZHANG Ming-liang2，GE Min2，WU Qi2，ZHAO Han2

（1.College of Agriculture， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China;2.Institute of Germplasm Resources and Biotechnology， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China）

Abstract：In order to clarify the structure， location， encoded protein properties and response characteristics of maize ZmZIM family genes to nitrogen， this study used TBtools， MEGA X and other softwares to analyze the structure， chromosome location， cis-acting elements and phylogenetic relationships of maize ZmZIM family genes and the physical and chemical properties， conserved domain and motifs of their encoded proteins. The expression patterns and differences of maize ZmZIM family genes were analyzed by combining the transcriptome data of different organs at different development stages of maize and the transcriptome data of maize shoots at four-leaf and one-heart stage under sufficient nitrogen and low nitrogen levels. The results showed that a total of 32 ZmZIM genes were identified from the whole genome of maize， which were mainly distributed on chromosomes 1， 2， 5 and 7， and no ZmZIM genes were found on chromosomes 8 and 10. The 32 ZmZIM genes could be divided into four subclasses， and the encoded proteins were composed of 134-467 amino acid residues， all of which were hydrophilic proteins and located in the nucleus. The cis-acting elements in the promoter region of 32 ZmZIM genes were mainly divided into six categories： regulatory elements， light signal response elements， hormone signal response elements， stress response elements， growth and development elements and protein binding sites. At different developmental stages， ZmZIM gene was differentially expressed in different organs of maize. Under sufficient nitrogen and low nitrogen treatments， with the increase of treatment time， the 12 ZmZIM genes in the aboveground part of maize plants had no expression or low relative expression， the relative expression of six ZmZIM genes was high and stable， and the relative expression of the remaining 14 ZmZIM genes varied greatly. The relative expression levels of ZmZIM5， ZmZIM16， and ZmZIM31 were generally higher than other genes. Under sufficient nitrogen conditions， the relative expression levels of ZmZIM8， ZmZIM15， ZmZIM20， ZmZIM24， ZmZIM29 and ZmZIM31 were generally higher than those under low nitrogen conditions. The results of this study lay a foundation for the screening and utilization of nitrogen efficient absorption and utilization genes in maize.

Key words：maize;ZIM transcription factors;gene family analysis;nitrogen response

ZIM（Zinc-finger protein expressed in Inflorescence Meristem）轉(zhuǎn)錄因子含有C2C2-GATA鋅指結(jié)構(gòu)（CX2CX20CX2C，其中X代表任意氨基酸），由Nishii等[1]從擬南芥花序分生組織中發(fā)現(xiàn)，因此被命名為ZIM。隨后GATA鋅指結(jié)構(gòu)在其他蛋白質(zhì)中也被發(fā)現(xiàn)，相應(yīng)的蛋白質(zhì)被歸入植物特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA家族[2-3]。ZIM蛋白除了含鋅指結(jié)構(gòu)域外，還包含一段由36個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的結(jié)構(gòu)域（T[I/L]F[F/Y]XG，其中X代表任意氨基酸），但該結(jié)構(gòu)域在各數(shù)據(jù)庫中使用的基序略有不同。White[4]報(bào)道了擬南芥中另外兩個(gè)分別由AT4G14713和AT4G14720基因編碼的PEAPOD1蛋白和PEAPOD2蛋白，含有TIFY及一段特殊結(jié)構(gòu)域。與ZIM蛋白不同的是，PEAPOD蛋白不存在GATA結(jié)構(gòu)域，因此將其歸類為C2C2-GATA家族并不準(zhǔn)確，Vanholme等[5]認(rèn)為應(yīng)將其重新命名并歸類為TIFY家族。在TIFY超轉(zhuǎn)錄因子家族中僅含有TIFY結(jié)構(gòu)域的蛋白劃分為TIFY亞族，含有TIFY結(jié)構(gòu)域和Jas結(jié)構(gòu)域的劃分為JAZ亞族，同時(shí)含有TIFY、GATA和CCT結(jié)構(gòu)域的劃分為ZML亞族，在N端包含一段PEAPOD蛋白且序列中含有TIFY結(jié)構(gòu)域的劃分為PPD亞族[4，6-9]。本研究沿用以ZIM命名的蛋白質(zhì)進(jìn)行研究。玉米是世界上最主要的糧食作物之一，在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、食品等行業(yè)都起著重要的作用[10-11]，但生產(chǎn)中由于氮肥的過度施用，導(dǎo)致玉米的氮肥利用效率較低[12]。ZIM家族在植物生長發(fā)育、非生物脅迫（高鹽、低溫和干旱）應(yīng)對(duì)及茉莉酸信號(hào)通路調(diào)控等多種反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[13-14]。因此研究玉米ZIM基因家族的特征、表達(dá)模式，解析玉米ZIM基因家族在氮素響應(yīng)中的分子機(jī)制對(duì)選育氮高效玉米品種具有重要意義。

自2000年Nishii等[1]從擬南芥中首次鑒定到AtZIM1基因以來，水稻[15]、葡萄[16]、二穗短柄草[13]、大豆[17]、棉花[18-19]、小麥[20]、西瓜[21]、木薯[22]、番茄[6]、杜仲[14]、柑橘[23]等植物中的ZIM基因繼續(xù)得到了鑒定。同時(shí)ZIM家族基因的功能也得到了廣泛研究。擬南芥JAZ蛋白可與AtMYB21和AtMYB24的R2R3結(jié)構(gòu)域結(jié)合導(dǎo)致擬南芥雄性不育，接收到茉莉酸信號(hào)后COI1結(jié)合JAZ蛋白并被泛素化降解使AtMYB21和AtMYB24激活下游基因表達(dá)調(diào)控雄蕊發(fā)育[24]；蘋果MdABI4蛋白與ICE1和JAZ蛋白互作形成JAZ-ABI4-ICE1-CBF模塊調(diào)控ABA（脫落酸）信號(hào)介導(dǎo)的蘋果耐冷性[25]； SlJAZ10和SlJAZ11蛋白不僅可通過茉莉酸信號(hào)來抑制番茄葉片衰老，還可通過協(xié)同電信號(hào)、鈣離子信號(hào)等調(diào)控番茄再生[26]；丙烯可誘導(dǎo)MaTIFY1基因表達(dá)，加快香蕉果實(shí)成熟[27]；小麥TaZIM-A1基因的表達(dá)量有明顯的晝夜節(jié)律，且過表達(dá)TaZIM-A1基因會(huì)下調(diào)部分關(guān)鍵開花調(diào)控基因的表達(dá)量進(jìn)而導(dǎo)致小麥開花時(shí)間的推遲[28]；鹽脅迫下過表達(dá)TdTIFY11a基因可使小麥在高滲透壓條件下仍保持較高的成活率及發(fā)芽率[29]，同樣PnJAZ1蛋白賦予核桃種子較高的萌發(fā)率及耐鹽性[30]；TIFY家族基因積極參與毛果楊對(duì)高鹽、極端溫度、干旱等非生物脅迫的調(diào)控過程[31]。

雖然ZIM家族基因及其功能在多種植物中得到了研究，但玉米ZIM家族基因的鑒定及氮素響應(yīng)特征研究還鮮見報(bào)道。本研究基于玉米V5版本的基因組數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)及TBtools軟件鑒定玉米ZmZIM基因家族成員，從基因的結(jié)構(gòu)、染色體位置、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、啟動(dòng)區(qū)域順式作用元件及表達(dá)模式及其編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、保守基序等角度解析ZmZIM基因家族的特性，并通過充足氮及低氮水平下玉米地上部的轉(zhuǎn)錄組測序，進(jìn)一步分析玉米ZmZIM家族基因的表達(dá)量差異，旨在為ZmZIM家族基因?qū)Φ氐捻憫?yīng)機(jī)制挖掘及氮高效利用玉米種質(zhì)選育提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1玉米ZmZIM家族基因的鑒定及其在染色體上的分布

從MaizeGDB網(wǎng)站和EnsemblPlant數(shù)據(jù)庫分別下載玉米B73_RefGen_V5版本ZIM家族蛋白質(zhì)氨基酸序列和全部蛋白質(zhì)氨基酸序列，利用TBtools提取ZIM家族的蛋白質(zhì)氨基酸序列，通過氨基酸序列比對(duì)后保留序列相同的蛋白質(zhì)氨基酸序列，并在NCBI網(wǎng)站下載玉米ZIM家族蛋白質(zhì)氨基酸序列，將兩種方式獲得的ZIM家族蛋白質(zhì)氨基酸序列再次進(jìn)行比對(duì)，選擇兩次比對(duì)結(jié)果中氨基酸序列均一致的蛋白質(zhì)氨基酸序列作為玉米ZIM家族蛋白質(zhì)氨基酸序列用于后續(xù)分析。使用TBtools軟件的Gene Location Visualize from GXF模塊分析玉米ZmZIM家族基因在染色體上的位置[32]。

1.2玉米ZmZIM基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析及亞細(xì)胞定位

采用TBtools軟件中Protein Parameter Calc程序進(jìn)行ZIM家族基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸數(shù)目、理論等電點(diǎn)（PI）、不穩(wěn)定指數(shù)、脂肪系數(shù)、平均親水系數(shù)等理化性質(zhì)分析。根據(jù)蛋白質(zhì)氨基酸序列采用Cell-PLoc2.0網(wǎng)站進(jìn)行玉米ZIM蛋白的亞細(xì)胞定位。

1.3基因結(jié)構(gòu)分析及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

利用TBtools軟件結(jié)合保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫（CDD）和基因編碼蛋白質(zhì)氨基酸序列進(jìn)行玉米ZIM家族保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測。設(shè)置保守基序（Motif）最大數(shù)值為20，采用TBtools軟件的Simple MEME Wrapper模塊進(jìn)行玉米ZIM家族蛋白質(zhì)保守基序預(yù)測。根據(jù)ZmZIM家族基因的編號(hào)（ID）下載對(duì)應(yīng)的基因序列，利用TBtools軟件的Gene Structures View模塊對(duì)下載的ZmZIM基因序列進(jìn)行基因非編碼區(qū)（UTR）及編碼序列（CDS）分析。

1.4啟動(dòng)子順式作用元件分析

首先利用TBtools軟件的GXF Sequences Extract模塊提取玉米基因組全部基因CDS上游2 000 bp的序列，隨后使用TBtools中Fasta Extract模塊提取ZmZIM家族基因CDS上游2 000 bp序列，再利用PlantCARE在線網(wǎng)站預(yù)測啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件，對(duì)各個(gè)基因中存在的無過多生物學(xué)意義的元件如TATA-box、CAAT-box等元件進(jìn)行刪減后，保留注釋文件中具有抗逆、光響應(yīng)、激素響應(yīng)等功能的順式作用元件，利用TBtools中Basic BioSequence View模塊對(duì)玉米ZmZIM家族基因啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件可視化。

1.5系統(tǒng)發(fā)育樹分析

采用MEGA-X軟件的MUSCLE模塊對(duì)玉米ZmZIM蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)[33]，設(shè)置Bookstrap值為1 000，利用鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，并利用iTOL在線網(wǎng)站進(jìn)行進(jìn)化樹的可視化。

1.6表達(dá)模式分析

以玉米自交系B73為試驗(yàn)材料，先在育苗盤中育苗，待發(fā)芽后選取長勢相近的個(gè)體移栽至人工攪拌均勻的基質(zhì)中，每3 d補(bǔ)水1次，保證基質(zhì)水分適宜，期間適當(dāng)施加尿素及復(fù)合肥保證植株正常生長。在玉米生長發(fā)育的不同階段對(duì)不同組織取樣并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，每樣品3個(gè)重復(fù)。利用FastQC v11.9[34]和Fastp軟件進(jìn)行測序結(jié)果的質(zhì)量控制，按照默認(rèn)參數(shù)去除重復(fù)和低質(zhì)量的read，得到高質(zhì)量序列（Clean data）。利用Hisat2 v2.2.1[35]將Clean data比對(duì)到玉米參考基因組（B73_RefGen_v5），然后利用Samtools v1.19[36]軟件將SAM文件轉(zhuǎn)化成BAM文件并排序，參考基因組數(shù)據(jù)和注釋信息下載自MaizeGDB數(shù)據(jù)庫。提取玉米ZmZIM家族基因的FPKM值，統(tǒng)計(jì)獲得ZmZIM家族基因的相對(duì)表達(dá)量。利用TBtools軟件進(jìn)行不同生長發(fā)育階段不同組織ZmZIM家族基因表達(dá)量的熱圖（Heat map）制作與分析。

1.7ZmZIM家族基因?qū)Φ氐捻憫?yīng)

以玉米自交系B73為試驗(yàn)材料，于2023年3月進(jìn)行水培處理。種子發(fā)芽后移入含2 mmol/L KNO3的Hoagland培養(yǎng)液中，每3 d更換1次培養(yǎng)液，待植株長至四葉一心時(shí)移入充足氮（50 mmol/L KNO3）和低氮（05 mmol/L KNO3+45 mmol/L KCl）的水培液中進(jìn)行不同氮素水平培育，并于處理后0 h、05 h、10 h、15 h、20 h、30 h、40 h、60 h、80 h時(shí)進(jìn)行地上部取樣，取得樣品采用植物總RNA提取試劑盒（南京諾唯贊醫(yī)療科技有限公司產(chǎn)品）提取RNA后，送北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，測序結(jié)果參照材料與方法16中的方法進(jìn)行質(zhì)量控制與表達(dá)量分析，進(jìn)而得到不同氮素水平下ZmZIM家族基因表達(dá)量的熱圖。

2結(jié)果與分析

2.1玉米ZIM家族基因的鑒定及分析

根據(jù)MaizeGDB網(wǎng)站及NCBI網(wǎng)站比對(duì)后共鑒定出32個(gè)玉米ZIM基因。將獲得的32個(gè)ZIM基因按照其在染色體分布位置依次命名為ZmZIM1～ZmZIM32。32個(gè)ZIM基因不均勻分布在玉米8條染色體上（圖1）。其中1號(hào)染色體含有10個(gè)ZmZIM基因，2號(hào)、5號(hào)染色體各分布6個(gè)ZmZIM基因，3號(hào)、7號(hào)染色體分別分布2個(gè)和5個(gè)ZmZIM基因，4號(hào)、6號(hào)、9號(hào)染色體各分布1個(gè)ZmZIM基因。值得注意的是ZmZIM基因有時(shí)在染色體上成簇分布，每簇包含3個(gè)ZmZIM基因，如1號(hào)染色體含有2個(gè)ZmZIM基因簇（ZmZIM1、ZmZIM2、ZmZIM3和ZmZIM6、ZmZIM7、ZmZIM8），5號(hào)染色體含有1個(gè)ZmZIM基因簇（ZmZIM22、ZmZIM23、ZmZIM24）。32個(gè)ZmZIM基因的編碼蛋白質(zhì)共鑒定出3個(gè)典型的特征結(jié)構(gòu)域（圖2），其中含TIFY結(jié)構(gòu)域的共27個(gè)，含CCT結(jié)構(gòu)域的共31個(gè)，僅ZmZIM4基因的編碼蛋白質(zhì)不含有CCT結(jié)構(gòu)域，同時(shí)含鋅指結(jié)構(gòu)域GATA、TIFY結(jié)構(gòu)域和CCT結(jié)構(gòu)域的編碼蛋白質(zhì)共4個(gè)（ZmZIM9、ZmZIM20、ZmZIM25及ZmZIM26）。

上述32個(gè)ZmZIM蛋白由134～467個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，相對(duì)分子質(zhì)量為14 161.23～52 501.39，理論等電點(diǎn)（PI）為4.60～1018，其中等電點(diǎn)大于70的蛋白質(zhì)有23個(gè)，表明大多數(shù)ZmZIM蛋白偏堿性，32個(gè)ZmZIM蛋白均為親水性蛋白（表1）。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示，32個(gè)蛋白質(zhì)均定位在細(xì)胞核中。

2.2玉米ZmZIM家族基因結(jié)構(gòu)分析及編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域預(yù)測

32個(gè)ZmZIM基因中ZmZIM13、ZmZIM17和ZmZIM27沒有非編碼區(qū)（UTR），其余29個(gè)ZmZIM基因均含1～2個(gè)UTR及多個(gè)編碼序列（CDS）。ZmZIM14、ZmZIM19、ZmZIM25、ZmZIM26、ZmZIM28、ZmZIM20和ZmZIM9含有不少于7個(gè)CDS（圖3），這些基因形成剪切體的潛在能力較高。ZIM31和ZIM5具有較為相似的結(jié)構(gòu)，表明這2個(gè)基因的進(jìn)化過程可能較為相似。

32個(gè)ZmZIM基因編碼的蛋白質(zhì)均含有多個(gè)保守基序（Motif）（圖4）。其中，Motif1、Motif3、Motif4出現(xiàn)次數(shù)較多，表明ZmZIM家族基因可能具有較為相似的功能，一些基因編碼的蛋白質(zhì)獨(dú)有特定的Motif說明這些基因可能有特殊的功能?；蚓幋a的蛋白質(zhì)保守基序的多樣性與基因編碼的蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域多樣化基本一致。

2.3玉米ZIM家族基因啟動(dòng)子順式作用元件

32個(gè)ZmZIM基因啟動(dòng)子區(qū)域包含的順式作用元件主要有6大類：調(diào)控元件、光信號(hào)響應(yīng)元件、激素信號(hào)響應(yīng)元件、脅迫響應(yīng)元件、生長發(fā)育元件及蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)等（圖5）。其中，光信號(hào)響應(yīng)元件和激素信號(hào)響應(yīng)元件數(shù)量最多，分別出現(xiàn)453次及341次，且每個(gè)ZmZIM中均有1個(gè)以上的光信號(hào)響應(yīng)元件。這表明ZmZIM家族可能調(diào)控多種信號(hào)通路，從而對(duì)玉米生長發(fā)育及多種脅迫作出應(yīng)答。同時(shí)，ZmZIM家族可能受光信號(hào)通路的影響從而存在表達(dá)的周期性。脅迫響應(yīng)元件出現(xiàn)141次。上述結(jié)果說明ZmZIM家族可能在調(diào)控玉米脅迫應(yīng)答、激素調(diào)節(jié)和光信號(hào)響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

2.4玉米ZIM蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹分析

玉米ZmZIM家族蛋白質(zhì)系統(tǒng)發(fā)育樹顯示32個(gè)ZmZIM蛋白可以劃分為S1、S2、S3、S4 4個(gè)亞類。其中，S4亞類包含19個(gè)基因的編碼蛋白質(zhì)，S1亞類包含3個(gè)基因的編碼蛋白（ZmZIM14、ZmZIM19、ZmZIM28），S2和S3亞類各含有5個(gè)基因的編碼蛋白質(zhì)，分別是ZmZIM9、ZmZIM12、ZmZIM20、ZmZIM25、ZmZIM26和ZmZIM11、ZmZIM18、ZmZIM21、ZmZIM30、ZmZIM32（圖6）。

2.5玉米ZIM家族基因表達(dá)模式分析

不同生長發(fā)育時(shí)期，玉米自交系B73不同組織ZmZIM基因的表達(dá)模式如圖7所示。從圖中可以看出，32個(gè)ZmZIM基因的表達(dá)差異顯著。15個(gè)基因（ZmZIM1、ZmZIM2、ZmZIM4、ZmZIM9、ZmZIM10、ZmZIM12、ZmZIM13、ZmZIM14、ZmZIM17、ZmZIM18、ZmZIM22、ZmZIM23、ZmZIM26、ZmZIM27、ZmZIM32）在玉米生長過程中多個(gè)組織中幾乎不表達(dá)或低表達(dá)，ZmZIM21、ZmZIM25和ZmZIM30在玉米生長過程中相對(duì)表達(dá)量基本穩(wěn)定，其余14個(gè)基因在玉米生長過程中相對(duì)表達(dá)量存在較大差異。在第9葉片展開期第8葉中ZmZIM8、ZmZIM15、ZmZIM24、ZmZIM28和ZmZIM29等基因的相對(duì)表達(dá)量較高，在第14葉片展開期第13葉中ZmZIM7、ZmZIM11、ZmZIM19、ZmZIM29、ZmZIM30和ZmZIM31等基因的相對(duì)表達(dá)量較高。

2.6玉米ZIM家族基因?qū)Φ氐捻憫?yīng)

充足氮和低氮處理后，玉米自交系B73地上部ZmZIM基因表達(dá)量的變化分別如圖8和圖9所示。從圖中可以看出，2種氮素水平下，隨著氮素處理時(shí)間的增加，32個(gè)ZmZIM基因的相對(duì)表達(dá)量出現(xiàn)不同的變化特征：12個(gè)ZmZIM基因（ZmZIM4、ZmZIM6、ZmZIM10、ZmZIM12、ZmZIM13、ZmZIM17、ZmZIM18、ZmZIM21、ZmZIM22、ZmZIM27、ZmZIM30和ZmZIM32）在2種氮素水平下均不表達(dá)或表達(dá)量極低；ZmZIM9、ZmZIM11、ZmZIM19、ZmZIM20、ZmZIM25和ZmZIM26 6個(gè)ZmZIM基因相對(duì)表達(dá)量較高，且變化比較穩(wěn)定，其余14個(gè)ZmZIM基因的相對(duì)表達(dá)量差異較大。與處理初始相比，充足氮處理8 h后ZmZIM1、ZmZIM3、ZmZIM8、ZmZIM29和ZmZIM31基因的相對(duì)表達(dá)量提高了4倍以上。2種氮素水平下，ZmZIM5、ZmZIM16和ZmZIM31基因的相對(duì)表達(dá)量普遍高于其他基因。充足氮處理下，ZmZIM8、ZmZIM15、ZmZIM20、ZmZIM24、ZmZIM29和ZmZIM31基因的相對(duì)表達(dá)量普遍高于低氮處理，這表明該家族基因?qū)Φ刈兓捻憫?yīng)較為明顯。因此，可以認(rèn)為玉米ZmZIM基因在氮素響應(yīng)調(diào)控中確實(shí)發(fā)揮了重要功能。

3討論

轉(zhuǎn)錄因子參與生物體眾多生理生化過程的調(diào)控，從基因組及轉(zhuǎn)錄組水平入手解析轉(zhuǎn)錄因子家族結(jié)構(gòu)和功能有助于明確轉(zhuǎn)錄因子基因家族的特性[37-39]。ZIM蛋白是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，在植物應(yīng)對(duì)非生物脅迫、光響應(yīng)、激素信號(hào)傳導(dǎo)等方面起著重要的作用。本研究通過挖掘ZmZIM家族基因的染色體位置、結(jié)構(gòu)、順式作用元件、表達(dá)模式及其對(duì)氮素的響應(yīng)特征，初步明確了ZmZIM基因的功能及對(duì)氮素的響應(yīng)機(jī)制。

本研究基于最新版本玉米基因組信息鑒定出玉米全基因組中含有32個(gè)ZmZIM基因，對(duì)前人研究結(jié)果進(jìn)行了補(bǔ)充與完善[40]。玉米ZmZIM基因在染色體上的分布較為分散，在1號(hào)染色體及5號(hào)染色體有成簇密集分布的現(xiàn)象，這可能與基因的重復(fù)、互補(bǔ)功能相關(guān)。根據(jù)ZmZIM家族成員結(jié)構(gòu)相似程度及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系將32個(gè)玉米ZmZIM基因分為4個(gè)亞類。本研究中對(duì)該家族成員的分類標(biāo)準(zhǔn)和范疇與其他學(xué)者研究有所不同。其他學(xué)者[5]側(cè)重TIFY家族的分類 ，而本研究則是重點(diǎn)關(guān)注蛋白質(zhì)中是否存在TIFY結(jié)構(gòu)域、CCT結(jié)構(gòu)域及GATA鋅指結(jié)構(gòu)域而進(jìn)行分類。盡管本研究中ZmZIM4蛋白僅含TIFY結(jié)構(gòu)域，但多次驗(yàn)證后本研究認(rèn)為該蛋白質(zhì)仍屬于ZIM家族，這為ZIM家族的進(jìn)化分析提供了基礎(chǔ)。

Shikata等[3]研究結(jié)果表明長日照條件下（16 h光照/8 h黑暗）過表達(dá)AtZIM可使擬南芥細(xì)胞增大進(jìn)而導(dǎo)致擬南芥下胚軸及葉柄伸長，短日照條件下（8 h光照/16 h黑暗）過表達(dá)AtZIM則使擬南芥葉片變小，這說明光周期能影響到該家族基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控植株形態(tài)。本研究中ZmZIM基因啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件預(yù)測結(jié)果顯示，ZmZIM基因中光信號(hào)響應(yīng)元件數(shù)量最多，每個(gè)ZmZIM基因至少含有1個(gè)脅迫響應(yīng)元件及激素相應(yīng)元件，這表明該家族在響應(yīng)外源激素及非生物脅迫的過程中發(fā)揮重要功能。此外，ZmZIM家族基因在玉米葉片中表達(dá)量普遍較高，且在不同生長發(fā)育期表達(dá)量有顯著差異，推測ZmZIM基因可能與其他基因互作來調(diào)控玉米葉片的發(fā)育。

在充足氮及低氮環(huán)境下，隨著氮素處理時(shí)間的增加，12個(gè)ZmZIM基因不表達(dá)或表達(dá)量極低，ZmZIM9、ZmZIM11、ZmZIM19、ZmZIM20、ZmZIM25和ZmZIM26等6個(gè)ZmZIM基因相對(duì)表達(dá)量較高，且變化比較穩(wěn)定，其余14個(gè)ZmZIM基因的相對(duì)表達(dá)量差異較大；ZmZIM5、ZmZIM16、和ZmZIM31等3個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量普遍高于其他基因。充足氮條件下，ZmZIM8、ZmZIM15、ZmZIM20、ZmZIM24、ZmZIM29和ZmZIM31等基因的相對(duì)表達(dá)量普遍高于低氮條件下相對(duì)表達(dá)量。上述結(jié)果說明ZmZIM基因可積極響應(yīng)氮素條件的變化，一些成員在低氮條件下高表達(dá)以增強(qiáng)玉米對(duì)外界氮素的吸收、同化及轉(zhuǎn)運(yùn)用來維持植株自身的生長，而另一部分成員在充足氮素條件下高表達(dá)一方面促進(jìn)氮素的同化及轉(zhuǎn)運(yùn)，另一方面通過其生長發(fā)育響應(yīng)元件與其他基因互作來調(diào)控玉米的生長發(fā)育來維持玉米植株碳氮平衡。因此，可以認(rèn)為玉米ZmZIM家族基因在氮代謝過程中可能發(fā)揮重要作用，在未來的研究中可通過ZmZIM基因的過表達(dá)試驗(yàn)、敲除突變體試驗(yàn)及共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析，從表型及遺傳角度進(jìn)一步驗(yàn)證和解析ZmZIM基因的功能，明確ZmZIM基因在玉米氮代謝中的作用。

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（責(zé)任編輯：石春林）

收稿日期：2023-05-09

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（32272133）；江蘇省種業(yè)振興“揭榜掛帥”項(xiàng)目[JBGS（2021）012]

作者簡介：孫揚(yáng)名（1998-），男，吉林長春人，博士研究生，主要從事玉米氮素吸收及高效利用研究。（Tel）18151665609;（E-mail）Sunyangming9808@163.com

通訊作者：趙涵，（E-mail）zhaohan@jaas.ac.cn