噬菌體裂解酶基因Lys BT1在普通小球藻中的表達

束忠濤 王冉 沈元朝 張漢澤 朱樹嬌 王姝璇 孫利廠

摘要：噬菌體裂解酶因高效、安全的殺菌特性成為潛在的抗菌藥物，并受到廣泛關注。本試驗在前期通過基因表達制備高效噬菌體裂解酶Lys BT1的基礎上，深度解析Lys BT1與細菌上裂解酶受體相互作用的結構特點，成功構建出質粒pCAMBIA 1301-BT1。將該質粒通過電轉化的方式導入普通小球藻中，電轉條件為：電場強度1.5 kV、脈沖距離2 mm、脈沖時間0.2 ms，瞬時表達后成功進行了活性測定，從而驗證了普通小球藻作為裂解酶表達載體的可行性，為噬菌體裂解酶的表達系統(tǒng)研發(fā)提供了一條可行路徑。

關鍵詞：噬菌體裂解酶；小球藻;電轉化；抗菌藥物

中圖分類號：Q939.48文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2024）04-0734-06

Expression of bacteriophage lyase gene Lys BT1 in Chlorella vulgaris

SHU Zhong-tao1，2，WANG Ran2，SHEN Yuan-chao2，ZHANG Han-ze1，2，ZHU Shu-jiao2，WANG Shu-xuan2，SUN Li-chang2

（1.School of Food and Biological Engineering， Jiangsu University， Zhenjiang 212013， China;2.Institute of Food Safety and Nutrition， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China）

Abstract：Bacteriophage lyase has become a potential antibacterial drug due to its high efficiency and safe bactericidal properties， and has been widely concerned. In this study， based on the preparation of high-efficiency bacteriophage lyase Lys BT1 by gene expression in the early stage， we deeply analyzed the structural characteristics of Lys BT1 interacting with the lyase receptor on bacteria， and successfully constructed the plasmid pCAMBIA 1301-BT1. The plasmid was introduced into Chlorella vulgaris by electrotransformation. The electrotransformation conditions were as follows： electric field intensity of 1.5 kV， pulse distance of 2 mm， and pulse time of 0.2 ms. After transient expression， the activity determination was successfully carried out. Therefore， the feasibility of Chlorella vulgaris as a lyase expression vector was verified， which provided a feasible path for the development of bacteriophage lyase expression system.

Key words：bacteriophage lyase;Chlorella vulgaris;electrotransformation

噬菌體裂解酶（Bacteriophage lyase）現(xiàn)已在多個領域顯示其優(yōu)越性和獨特性，有望成為后抗生素時代控制食源性致病菌、腐敗菌，保障食品安全的有效殺菌劑[1]。目前使用較多的外源表達系統(tǒng)主要有大腸桿菌[2]和酵母[3]等，但這些表達系統(tǒng)仍存在安全性不高、易污染、表達量低等問題?；蚬こ讨参锞哂胁煌谂囵B(yǎng)細胞的性能特征，如光合生長和易于分級，然而，由于繁瑣的遺傳方法、緩慢的生長速度、較低的產量以及監(jiān)管方面的限制等，其發(fā)展?jié)摿€沒有得到充分實現(xiàn)。微藻的生長條件要求簡單，且微藻具備植物基因組轉錄后翻譯處理能力，同時微藻具備微生物快速生長和高密度培養(yǎng)特性[4]。目前作為表達載體的微藻有萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）[5]、杜氏鹽藻（Dunaliella salina）[6]、三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）[7]、普通小球藻（Chlorella vulgaris）[8]等。

普通小球藻是小球藻中目前最廣泛培養(yǎng)的藻種之一[9]，富含蛋白質和各種其他營養(yǎng)物質，蛋白質含量超過50%[10]，具有重要的商業(yè)價值，也是目前研究和認證的人類食品之一[11]。因其生長速度快、易培養(yǎng)和可塑性強的特性，常被作為外源基因表達平臺的首選。Hawkins和Nakamura[12]1999年使用PEG轉化法將人生長激素基因（hGH）在普通小球藻中成功進行了瞬時表達。Koo等[13]采用電擊法將牛乳鐵蛋白N-端肽段成功在普通小球藻中獲得表達。Ng等[14]通過農桿菌介導的方法在普通小球藻中成功誘導表達YoeBSpn-GFP和PezT-GFP融合基因，并測試了其致病性。Shin[8]2020年在氮缺失的條件下成功誘導表達獲得hG-cSf多肽。

本試驗在前期表達制備高效噬菌體裂解酶LysBT1（廣譜噬菌體裂解酶）的基礎上，采用噬菌體基因組深度解析及高分辨率X射線晶體和冷凍電鏡技術，深度解析裂解酶Lys BT1與細菌上裂解酶受體互作的酶活性結構特點、決定裂解譜的關鍵結構、酶結構功能的鑒定與預測。針對超級耐藥細菌寬譜裂解酶的設計，本研究以細菌上裂解酶的受體為靶標，基于酶結構的分子改良、修飾和裂解酶活性中心定向設計，研制出對耐藥菌的寬譜裂解酶，并提高裂解酶的穩(wěn)定性和抑菌活性;通過CRISPR定點基因編輯技術在普通小球藻中進行基因改造，成功構建質粒pCAMBIA 1301-BT1，并在普通小球藻中完成表達。

1材料及方法

1.1試驗材料

普通小球藻、TreliefTM5α感受態(tài)細胞、大腸桿菌ATCC 25922等均由筆者所在實驗室保存;高純度質粒DNA小量提取試劑盒購自北京擎科生物科技股份有限公司;LB肉湯培養(yǎng)基購自BD Difco公司。

1.2試驗方法

1.2.1藻種的培養(yǎng)和生長曲線的測定將對數(shù)生長末期的小球藻培養(yǎng)液按10％的接種量接入裝有50 ml培養(yǎng)基的150 ml錐形瓶中，置于光照培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：光照度2 640 lx，濕度72%，光/暗周期12 h/12 h，培養(yǎng)溫度為（28.0±0.5） ℃。定期測定藻液560 nm處的吸光度（OD），檢測小球藻的生長速度。

1.2.2質粒構建參照本研究室前期方法[15]進行試驗。裂解酶基因克隆及表達載體構建方法如下：首先，提取噬菌體V-EcoM-C1 的基因組，然后以其為模板、以Lys BT1-F、Lys BT1-R為引物擴增噬菌體裂解酶基因。擴增程序：預變性溫度95 ℃，持續(xù)5 min;變性溫度95 ℃，持續(xù)30 s，退火溫度62 ℃，持續(xù)30 s，延伸溫度72 ℃，持續(xù)1 min，共30個循環(huán);最后延伸溫度72 ℃，持續(xù)10 min?；厥漳康钠魏笥肊coRⅠ和 NotⅠ進行雙酶切。將雙酶切后的目的片段連接至經(jīng)Eco RⅠ和NotⅠ雙酶切后的pCAMBIA 1301載體，再將構建好的重組質粒pCAMBIA 1301-BT1轉化至TreliefTM5α感受態(tài)細胞中，篩選陽性克隆并測序驗證表達載體pCAMBIA 1301-BT1。

1.2.3重組克隆轉化取兩支100 μl冰上融化的TreliefTM5α感受態(tài)細胞，分別加入10 μl構建好的重組質粒pCAMBIA 1301-BT1，溫和吹打混勻后轉移至冰上，靜置30 min;在42 ℃水浴鍋中熱激45～60 s，然后迅速轉移至冰浴中，靜置2 min。向離心管中加入700 μl無抗性LB培養(yǎng)液，37 ℃ 200 r/min復蘇60 min，再吸取80 μl復蘇液均勻涂布到含有50 μg/ml卡那霉素的LB固體平板上，將平板倒置放于37 ℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，在10 ml的EP管中加入5 ml的LB培養(yǎng)基，挑取抗性平板上的單菌落在培養(yǎng)基中攪拌，過夜培養(yǎng)。

1.2.4質粒的提取及驗證采用北京擎科生物科技股份有限公司高純度質粒DNA小量提取試劑盒提取，并進行核酸驗證。

1.2.5瞬時轉化取對數(shù)生長期的小球藻，稀釋含量梯度至1×108左右;取藻液3～5 ml用BG11洗滌3次，5 000 r/min 5 min;加入山梨醇和甘露醇各100 μl;3 000 r/min離心5 min收集菌體，加入HEPES緩沖液（2.38 g溶于9 ml）混勻，提前用PE紫外燈處理電轉杯（注意是否吹干），預冷備用，將電轉杯冰浴30 min后放入電擊轉化儀中進行電擊轉化，電場強度為1.5 kV，脈沖距離2 mm，脈沖時間為0.2 ms，立即加入100 μl預冷的BG11液體培養(yǎng)基，將混合液轉入無菌離心管中，再加入0.9 ml BG11培養(yǎng)基，然后在光照條件下恢復培養(yǎng)48 h。

1.2.6熒光顯微鏡鏡檢取20 μl恢復后的藻液在熒光顯微鏡下觀察。在無光和有光兩種不同條件下觀察、對比熒光顯微鏡下的小球藻。

1.2.7噬菌體裂解酶活性測定將恢復24 h后的小球藻放入離心機中按12 000 r/min離心2 min，收集上清液。將沉淀的藻體用BG11懸浮，再放入超聲波破碎儀中按 300 W 15 min破碎，離心收集上清液。通過點樣雙層（底層為1.2% LB，上層為0.6% LB和菌液的混合物）方式檢驗上清液中酶的活性，本次所選菌株為大腸桿菌ATCC 25922。

1.2.8最小抑菌濃度測定將ATCC 25922以挑取單菌落的方式接種于LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)4～6 h至對數(shù)期，用PBS洗滌3次，調整至OD600為0.6，再用LB培養(yǎng)基按照1∶100稀釋后備用。將分離、純化、濃縮后的噬菌體裂解酶質量濃度調整至512 μg/ml，在96孔板前3排的第1列加入200 μl裂解酶，第2～12列各加入100 μl PBS，從第1孔吸取100 μl裂解酶依次向后倍比稀釋至第10孔，1～11孔添加100 μl稀釋后的菌液，12孔加100 μl LB。每梯度裂解酶濃度設置3組對照，并設置空白對照和陽性對照，在37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h，以完全不生長細菌的裂解酶質量濃度為最小抑菌濃度。

2結果與分析

2.1小球藻的生長曲線

按10%的接種量培養(yǎng)，培養(yǎng)21 d，如圖1所示，在培養(yǎng)的第14～15 d生長速率達到最快，認為此期處于對數(shù)生長期。

2.2表達的陽性克隆篩選

正常的TreliefTM5α感受態(tài)細胞對卡那霉素敏感，在培養(yǎng)基中無法生長，只有攜帶重組質粒pCAMBIA 1301-BT1的TreliefTM5α感受態(tài)細胞能成功在卡那霉素抗性培養(yǎng)基中生長，圖2顯示，在含卡那霉素培養(yǎng)基（100 μg/ml）上有單菌落生長，因此可以推斷，重組質粒pCAMBIA 1301-BT1在TreliefTM5α感受態(tài)細胞中轉染成功。

2.3陽性克隆的核酸分析

試驗通過提取過夜培養(yǎng)的TreliefTM5α感受態(tài)細胞DNA做電泳，從圖3可以看出試驗組在12 000 bp附近有條帶，與擬轉染的噬菌體裂解酶相對分子質量相符。

2.4轉染后小球藻的熒光反應

以轉入質粒的小球藻作為試驗組，未導入質粒的小球藻作為空白對照組，將兩組小球藻在白光和激發(fā)光的條件下于熒光顯微鏡下觀察，在白光條件下，兩組均能看到清晰藻體;在激發(fā)光條件下，試驗組有明顯的紅色熒光，而對照組一片黑暗（圖4）。重組質粒pCAMBIA 1301-BT1有熒光標簽，故推斷試驗組成功表達了質粒pCAMBIA 1301-BT1。

2.5噬菌體裂解酶的活性

取適量成功轉染陽性的小球藻液，離心分離藻液上清液和小球藻破碎后上清液來檢測小球藻表達的噬菌體裂解酶的活性。如圖5所示，離心分離藻液的上清液對大腸桿菌ATCC 25922無明顯的殺菌效果，小球藻破碎后離心后的上清液對大腸桿菌ATCC 25922有良好的殺菌效果。試驗結果表明，小球藻系統(tǒng)表達的噬菌體裂解酶能成功裂解致病菌，且該裂解酶殺菌活性良好。

2.6噬菌體裂解酶的最小抑菌質量濃度

如圖6所示，質量濃度在32 μg/ml時有明顯分界點，在大于該質量濃度時有明顯的抑菌效果，小于該質量濃度時則抑菌效果較差，由此得出最小抑菌質量濃度為32 μg/ml。

3討論

自從科研人員首次嘗試在小球藻中表達異源蛋白質以來，相關研究已經(jīng)取得一定進展。盡管異源蛋白質的產量相對較低，但小球藻具有快速生長、易于培養(yǎng)以及進行翻譯后修飾的能力等顯著優(yōu)勢，因此發(fā)展前景廣闊。當前如何提高生產能力仍然是小球藻異源蛋白質商業(yè)化的主要挑戰(zhàn)，這取決于開發(fā)用于改進蛋白質表達、培養(yǎng)系統(tǒng)和下游基于生物煉制的綜合生產的新型遺傳工具箱方面的重大研究進展。這些領域的創(chuàng)新和突破將大大提高生產能力、降低生產成本，從而使小球藻成為異源蛋白質表達的競爭宿主。目前已報道的小球藻有效遺傳轉化方法主要有農桿菌侵染法[16]、基因槍法[17]、電擊轉化法[18]、聚乙二醇融合法[19]等。電擊轉化法是小球藻轉化系統(tǒng)中較為常用的轉化方法[20]，牟云等[21]成功通過構建電擊轉化體系在沙漠小球藻中表達人乳鐵蛋白;Zhang等[22]以電穿孔的方式將來自大豆的轉錄因子基因GmDof4轉化到小球藻中。普通小球藻作為可持續(xù)的、安全的生物制造商業(yè)理想分子平臺，盡管目前遺傳工具的開發(fā)略顯落后，沒有能進行商業(yè)化的生物治療平臺[23]，但在這一領域普通小球藻具有不可替代的潛力。近年來，雖然關于外源基因在小球藻中轉化表達的研究不斷取得進展[24]，但是仍然存在很難進行基因工程改良、外源蛋白質表達水平低且不穩(wěn)定[25-26]等問題。

Lys BT1作為一種嵌合式廣譜噬菌體裂解酶，在通過基因分析、篩選和預測后，剪切出具有所需能力的基因片段，并利用CRISPR定點基因編輯技術在小球藻中進行基因改造，實現(xiàn)裂解酶基因多拷貝整合和小球藻、枯草芽孢桿菌高效表達裂解酶代謝工程改造，實現(xiàn)裂解酶基因高效表達，并以小球藻構建微藻載藥系統(tǒng)。將含有Lys BT1基因片段進行整合，構建出質粒pCAMBIA 1301-BT1，通過克隆和驗證后，利用電轉化法將質粒導入普通小球藻，通過熒光顯微鏡鏡檢證明噬菌體裂解酶基因在小球藻中表達成功，并通過對目標菌的殺菌活性和最小抑菌質量濃度試驗驗證表達的裂解酶有著良好的抑菌殺菌效果。本試驗為噬菌體裂解酶的表達系統(tǒng)研發(fā)提供了一條新思路。不過，目前該表達系統(tǒng)只能瞬時表達裂解酶基因，后續(xù)仍需要進一步完善。

4結論

本試驗利用普通小球藻作為表達平臺，成功表達了具備良好活性的裂解酶Lys BT1。這為裂解酶大規(guī)模生產提供了一種可能，但目前仍處于待完善階段，未來可研發(fā)穩(wěn)定轉化裂解酶Lys BT1的普通小球藻系統(tǒng)，應用于食品和醫(yī)藥行業(yè)。

參考文獻：

[1]黃振華，張昭寰，吳倩，等. 噬菌體及其裂解酶：后抗生素時代的有效殺菌劑[C]. 中國食品科學技術學會. 中國食品科學技術學會第十八屆年會摘要集. 北京：中國食品科學技術學會，2022：146-147.

[2]王瑜欣， 李靜， 付開來，等. 噬菌體裂解酶Lysin1902原核表達及其與ε-聚賴氨酸聯(lián)用效果評價[J]. 微生物學報，2023，63（2）：834-844.

[3]繆西鵬. 產氣莢膜梭菌多重PCR檢測方法的建立及其噬菌體裂解酶在真核系統(tǒng)中的表達[D]. 銀川：寧夏大學，2022.

[4]WALKER T L， PURTON S， BECKER D K， et al. Microalgae as bioreactors[J]. Plant Cell Reports，2005，24（11）：629-641.

[5]楊澤熵，張雨靖，高文英，等. gpd1基因萊茵衣藻表達載體構建及農桿菌介導轉化萊茵衣藻[J]. 西北大學學報，2017，47（1）：75-81.

[6]AKBARI F， ESKANDANI M， KHOSROUSHAHI A Y. The potential of transgenic green microalgae; a robust photobioreactor to produce recombinant therapeutic proteins[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology，2014，30（11）：2783-2796.

[7]HEMPEL F， MAIER U G. An engineered diatom acting like a plasma cell secreting human IgG antibodies with high efficiency[J]. Microbial Cell Factories，2012，11（1）：126.

[8]SHIN J H， CHOI J， JEON J， et al. The establishment of new protein expression system using N starvation inducible promoters in Chlorella[J]. Scientific Reports，2020，10（1）：12713.

[9]楊博. 普通小球藻穩(wěn)定遺傳體系的建立及基因改造其光合固碳效率的研究[D]. 廣州：華南理工大學，2016.

[10]TAN C H， SHOW P L， LAM M K， et al. Examination of indigenous microalgal species for maximal protein synthesis[J]. Biochemical Engineering Journal，2020，154（15）：107425.

[11]AHMED J， KUMAR V. Effect of high-pressure treatment on oscillatory rheology， particle size distribution and microstructure of microalgae Chlorella vulgaris and Arthrospira platensis[J]. Algal Research，2022，62：102617.

[12]HAWKINS R L， NAKAMURA M. Expression of human growth hormone by the eukaryotic alga， Chlorella[J]. Current Microbiology，1999，38（6）：335-341.

[13]KOO J， PARK D， KIM H. Expression of bovine lactoferrin N-lobe by the green alga， Chlorella vulgaris[J]. Algae，2013，28（4）：379-387.

[14]NG S L， HARIKRISHNA J A， BAKAR F A， et al. Heterologous expression of the Streptococcus pneumoniae yoeB and pezT toxin genes is lethal in Chlorella vulgaris[J]. Algal Research，2016，19：21-29.

[15]孫利廠，龐茂達，何靈塵，等. 腸出血性大腸埃希菌噬菌體裂解酶的畢赤酵母重組表達及裂解活性分析[J]. 揚州大學學報，2018，39（4）：1-6.

[16]CHA T S， YEE W， AZIZ A. Assessment of factors affecting agrobacterium-mediated genetic transformation of the unicellular green alga， Chlorella vulgaris[J]. World Journal of Microbiology & Biotechnology，2012，28（2）：1771-1779.

[17]GONG Y， HU H， GAO Y， et al. Microalgae as platforms for production of recombinant proteins and valuable compounds： progress and prospects[J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology，2011，38（12）：1879-1890.

[18]MORRIS H J， CARRILLO O V， ALMARALES ， et al. Protein hydrolysates from the alga Chlorella vulgaris 87/1 with potentialities in immunonutrition[J]. Biotecnologia Aplicada，2009，26（2）：162-165.

[19]KIM D H， KIM Y T， CHO J J， et al. Stable integration and functional expression of flounder growth hormone gene in transformed microalga， Chlorella ellipsoidea[J]. Marine Biotechnology，2002，4（1）：63-73.

[20]曹蘇珊，薛靜，王倩楠，等. 小球藻遺傳轉化技術研究進展[J]. 水產科學，2021，40（2）：294-300.

[21]牟云，汪文倫，許萬云，等. 人乳鐵蛋白的沙漠小球藻表達系統(tǒng)的構建與鑒定[J]. 江蘇農業(yè)科學，2017，45（19）：138-142.

[22]ZHANG J， HAO Q， BAI L， et al. Overexpression of the soybean transcription factor GmDof4 significantly enhances the lipid content of Chlorella ellipsoidea[J]. Biotechnology for Biofuels，2014，7（1）：128.

[23]JESTER B W， ZHAO H， GEWE M， et al. Development of spirulina for the manufacture and oral delivery of protein therapeutics[J]. Nature Biotechnology，2022，40：956-964.

[24]曹蘇珊，薛靜，王倩楠，等. 小球藻遺傳轉化技術研究進展[J]. 水產科學，2021，40（2）：294-300.

[25]RASALA B A， MUTO M， LEE P A， et al. Production of therapeutic proteins in algae， analysis of expression of seven human proteins in the chloroplast of Chlamydomonas reinhardtii[J]. Plant Biotechnology Journal，2010，8（6）：719-733.

[26]YANG B， LIU J， JIANG Y， et al. Chlorella species as hosts for genetic engineering and expression of heterologous proteins： Progress， challenge and perspective[J]. Biotechnology Journal，2016，11（10）：1244-1261.

（責任編輯：黃克玲）

收稿日期：2023-08-31

基金項目：江蘇省農業(yè)科技自主創(chuàng)新基金項目[CX（22）2017];江蘇省政策引導類計劃一帶一路創(chuàng)新合作項目（BZ2021009）;國家重點研發(fā)計劃項目（2021YFE0101800）

作者簡介：束忠濤（1996-），男，安徽安慶人，碩士研究生，主要從事食品安全研究；（E-mail）404339600@qq.com。王冉為共同第一作者。

通訊作者：孫利廠，（E-mail）sunlc@jaas.ac.cn