高氨氮沼液浸種強(qiáng)化小球藻對沼液廢水的處理效果

譚 順，莫創(chuàng)榮，許雪棠，龐瑞林，王露潔，陸祖逸

(1.廣西大學(xué)資源環(huán)境與材料學(xué)院，南寧 530004；2.廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，南寧 530004)

【研究意義】隨著我國沼氣工程擴(kuò)大化和規(guī)模化的實施，大量產(chǎn)生的沼液也逐漸成為我國污水來源的重要組成部分[1]。相關(guān)統(tǒng)計結(jié)果表明，我國沼氣工程產(chǎn)生的沼液每年超過10億t[2]。通過厭氧發(fā)酵技術(shù)處理牲畜糞便可產(chǎn)生沼氣等清潔能源[3-4]，但發(fā)酵產(chǎn)生的沼液仍存在產(chǎn)量大、不易儲存和不易達(dá)標(biāo)排放等問題。沼液屬于高濃度有機(jī)廢水，具有含氮量高、生物降解性差及碳氮比低等特點[5]，而目前用于凈化沼液的序批式反應(yīng)器對沼液中污染物的去除效率僅20%左右[6]。已有研究表明，微藻生物質(zhì)培養(yǎng)技術(shù)能實現(xiàn)高效脫氮除磷[7]，利用固定化污泥和固定化小球藻(Chlorella)共培養(yǎng)處理，經(jīng)Up-flow Anaerobic Sludge Bed/Blanket(USAB)工藝處理的真實畜禽養(yǎng)殖廢水，48 h時對氮和磷的去除率均在80%以上[8]；利用微藻處理沼液，既能達(dá)到廢水處理的目的，也能收獲并創(chuàng)造附加值。因此，利用高氨氮沼液直接浸種強(qiáng)化小球藻，對實現(xiàn)沼液資源化利用具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】國內(nèi)外學(xué)者為提高微藻在沼液中的適應(yīng)性和對營養(yǎng)物質(zhì)的去除效果，利用多種方式對微藻進(jìn)行了篩選和強(qiáng)化。馮思然等[9]開展奶牛場沼液資源化處理研究，發(fā)現(xiàn)小球藻在低濃度(25%～50%)沼液中生長狀態(tài)良好，對污染物有較高的去除率，同時能產(chǎn)生更多高能量組分的生物質(zhì)，經(jīng)處理的沼液適用于生物燃料開發(fā)。孫宏等[10]采用稀釋5倍沼液原位富集篩選分離方法得到4株微藻，并通過比較不同微藻對沼液的處理效果確定目標(biāo)微藻。Chen等[11]研究表明，小球藻在經(jīng)厭氧消化的豬場廢水中具有更好的生長性能、更高的廢水耐受性(廢水含量達(dá)100%)和更好的養(yǎng)分去除能力。葉慶等[12]采用經(jīng)輻射誘變得到的藻種ChlorellaPY-ZU1處理沼液，獲得了高效凈化效果。孫盛進(jìn)等[13]利用從同為高色、高濁、高鹽廢水垃圾滲濾液中得到的小球藻處理稀釋10倍的沼液，沼液經(jīng)電場預(yù)處理后，小球藻對沼液中總磷的去除率最高可達(dá)99.5%。為獲得能耐受高CO2濃度并具有高CO2固定能力的微藻藻株，Li等[14]分別在10%和20% CO2條件下經(jīng)過31個適應(yīng)性實驗室進(jìn)化循環(huán)后獲得2株進(jìn)化小球藻，命名為藻株AE10和AE20，二者均可在高CO2條件下快速生長，其中，AE10的最大生物量濃度為3.68 g/L，分別是AE20和原藻株的1.22和2.94倍；黃俊霖等[15]采用逐步提高沼液含量來適應(yīng)性馴化小球藻，發(fā)現(xiàn)用50%沼液馴化后的小球藻可直接處理絮凝預(yù)處理后的沼液；Wang等[16]也采用逐步提高沼液含量來馴化小球藻，經(jīng)過5個梯度馴化，在64 L開放式水道池中可去除沼液中幾乎100%的氮磷；Li等[17]將小球藻依次接種到25%、50%、75%和100%高氮磷模擬廢水中進(jìn)行馴化，馴化后的小球藻生物量和葉綠素積累率及氨氮和磷的去除率顯著提高。【本研究切入點】沼液的成分復(fù)雜且多變[1]，利用經(jīng)沼液濃度梯度馴化后的小球藻處理不同特性沼液時，還需再次馴化小球藻，耗時且復(fù)雜，需尋找一種高效且簡易的方法以強(qiáng)化小球藻對沼液的處理效果，但目前國內(nèi)外對利用高氨氮沼液直接浸種強(qiáng)化小球藻作用的研究鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】利用高氨氮沼液直接浸種小球藻，探究沼液浸種對小球藻生長、光合色素和脫氮除磷效果的影響，并利用最佳浸種時間小球藻處理實際廢水以檢驗沼液浸種對小球藻的強(qiáng)化作用，以期確定沼液浸種強(qiáng)化小球藻的可行性，為小球藻處理沼液技術(shù)的大規(guī)模推廣應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

所用微藻為實驗室馴化后保存的普通小球藻(Chlorellavulgaris)，藻種編號為FACHB-8[14]。原始藻種購自中國科學(xué)院(武漢)淡水藻種庫。藻種使用前用BG11培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

豬場沼液采集于廣西南寧市某養(yǎng)豬場厭氧發(fā)酵工藝初沉池出水處，采集后用8層紗布過濾去除不溶性大顆粒物，4 ℃冷藏保存。臨用時，11 000 r/min離心10 min去除大部分小顆粒物和大部分微生物。預(yù)測定經(jīng)處理沼液的相關(guān)水質(zhì)指標(biāo)，其化學(xué)需氧量(CODcr)為460.0 mg/L，總磷為12.3 mg/L，氨氮為1640.0 mg/L，色度為1957度，pH為8.49。

含氨氮培養(yǎng)基采用BG11培養(yǎng)基加0.45 g/L氯化銨進(jìn)行設(shè)計，其氨氮初始濃度達(dá)126.3 mg/L。實際廢水培養(yǎng)基為無硝態(tài)氮和雙倍磷酸氫二鉀的改良BG11培養(yǎng)基與含7%沼液的混合液，并加入0.27 g/L葡萄糖補(bǔ)充碳源，其中的總磷和氨氮初始濃度分別為11.47和120.76 mg/L。含氨氮培養(yǎng)基和實際廢水用1.0 mol/L NaOH和HCl調(diào)節(jié)初始pH為(7.00±0.02)。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設(shè)計 ①沼液浸種及擴(kuò)培：取9.0 mL擴(kuò)大培養(yǎng)后的藻液，4000 r/min離心8 min，去除上清，用預(yù)處理后的沼液定容至9.0 mL，搖勻，對小球藻分別進(jìn)行0、4、8和12 h浸泡預(yù)處理后，接種至工作容積為400.0 mL的柱狀光反應(yīng)器(直徑為5.0 cm，高為33.0 cm)中，培養(yǎng)基為BG11培養(yǎng)基，曝氣量為1.0 L/min，光照強(qiáng)度為4000 lx，光暗比為24∶0，室溫培養(yǎng)。②含氨氮培養(yǎng)基篩選藻種：將浸種后培養(yǎng)7 d的小球藻離心收集，接種至含氨氮培養(yǎng)基、工作容積為1.0 L的柱狀光反應(yīng)器(直徑為6.0 cm，高為42.0 cm)中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件與①相同。③處理實際廢水：將篩選獲得8 h浸種處理的小球藻培養(yǎng)至對數(shù)期后離心收集，以未浸種小球藻為對照，分別接種到實際廢水中，光暗比為12∶12，其他培養(yǎng)條件與②相同。

1.2.2 測定項目及方法 生物量和比生長速率：生物量采用光密度法[18]進(jìn)行測定。取小球藻藻液，使用紫外可見分光光度計測定樣品在680 nm下的吸光度(OD值)，以此衡量小球藻在培養(yǎng)過程中的相對生長量。通過OD值和時間計算小球藻的比生長速率[19]。比生長速率μ= ( lnN1-lnN0)/(t1-t0)(t0為初始時刻，t1為不斷增加的時間，N1與N0為對應(yīng)t1和t0時刻的OD值)。

光合色素濃度或含量測定：參考Li等[14]、Pruvost等[20]的方法提取小球藻的色素并計算其濃度或含量。新鮮小球藻藻液離心后直接用于測定色素濃度(mg/L)，以真空冷凍干燥機(jī)干燥24 h后的小球藻用于測定色素含量(mg/g)。通過甲醇法提取的色素用紫外可見分光光度計測定480、652和665 nm下的OD值，利用相應(yīng)的公式，分別計算總光合色素濃度及葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量。

Chl-a(mg)=(-8.096×A652+16.517×A665)×n×V1

(1)

Chl-b(mg)=(27.441×A652-12.169×A665)×n×V1

(2)

E160A(mg)=4×A480×n×V1

(3)

總光合色素濃度(mg/L)=(Chl-a+Chl-b+E160A)/V

(4)

葉綠素a含量(mg/g)=Chl-a/m

(5)

葉綠素b含量(mg/g)=Chl-b/m

(6)

類胡蘿卜素含量(mg/g)=E160A/m

(7)

式中，Chl-a、Chl-b和E160A分別為提取的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素量，A480、A652和A665分別為色素提取液在波長480、652和665 nm下的OD值，n為提取液稀釋倍數(shù)，V1為提取液體積，V為用于提取的藻液樣本體積，m為稱取的干燥樣品重量。

水質(zhì)指標(biāo)：將收集的水樣11 000 r/min離心8 min后，用0.45 μm 醋酸纖維素濾膜進(jìn)行過濾，濾液進(jìn)行以下水質(zhì)指標(biāo)測定。CODcr采用重鉻酸鹽法(GB 11914—1989《水質(zhì)—化學(xué)需氧量的測定》)進(jìn)行測定，氨氮濃度采用納氏試劑分光光度法(HJ 535—2009《水質(zhì)—氨氮的測定》)進(jìn)行測定，總磷含量采用鉬酸銨分光光度法(GB 11893—1989《水質(zhì)—總磷的測定》)進(jìn)行測定，色度采用分光光度法[21]進(jìn)行測定，pH用SevenCompact pH計測定。

1.3 統(tǒng)計分析

采用Excel 2010和Origin 2019b對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析和制圖，以SPSS 26.0進(jìn)行單因素ANOVA檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 沼液浸種對小球藻生長的影響

2.1.1 小球藻的生長狀況 通過預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)，沼液浸種時間過長會導(dǎo)致小球藻培養(yǎng)過程中細(xì)胞變黃變白，在短期內(nèi)死亡，因此本研究選擇4、8和12 h為浸種時間，以浸種0 h為對照。從圖1-A可看出，在BG11培養(yǎng)基中培養(yǎng)的前4 d，浸種時間越長的小球藻其OD值增長速度越慢，而未浸種小球藻生長最快，說明沼液浸種時間越長，對小球藻生長的抑制作用越明顯；從培養(yǎng)的第5天開始，浸種8 h小球藻的OD值逐漸大于浸種4和12 h小球藻的OD值，說明浸種時間長短對小球藻生長的影響存在差異。從圖1-B可看出，在BG11培養(yǎng)基中培養(yǎng)的第1和第2天，浸種時間越長小球藻的比生長速率越小，浸種4和8 h小球藻的比生長速率分別在培養(yǎng)的第3和第4天最接近未浸種小球藻的比生長速率，而浸種12 h小球藻在培養(yǎng)7 d后其比生長速率才與未浸種小球藻接近，說明沼液浸種時間對受損藻細(xì)胞恢復(fù)正常生長所需時間具有不同程度影響，浸種時間越長，小球藻恢復(fù)正常生長所需時間越長。

2.1.2 微藻總色素濃度和葉綠素a/b的變化情況 對BG11培養(yǎng)基中小球藻總色素濃度(圖2-A)和BG11培養(yǎng)基中小球藻生長變化曲線(圖1-A)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)浸種小球藻在生長過程中總色素濃度與OD值變化趨勢相似，說明小球藻總色素濃度變化也能反映小球藻的生長狀況。從圖2-B可看出，在BG11培養(yǎng)基中培養(yǎng)第1天，浸種時間越長對小球藻葉綠素a的損害越大，其葉綠素a/b下降越明顯；葉綠素a/b下降后，在BG11培養(yǎng)基中培養(yǎng)的第2天，浸種4和8 h小球藻的葉綠素a/b達(dá)峰值，浸種12 h小球藻的葉綠素a/b在培養(yǎng)第3天時達(dá)峰值，其中，浸種4和12 h小球藻的葉綠素a/b峰值比相同時期未浸種小球藻大，說明小球藻浸種時間越長，葉綠素a/b達(dá)到峰值所需時間越長；從在BG11培養(yǎng)基中培養(yǎng)的第4天開始，浸種0、4、8和12 h小球藻的葉綠素a/b差異較小，保持在3.57～3.89。

2.2 最佳浸種小球藻的確定

2.2.1 浸種小球藻的生長狀況 由圖3-A可看出，在含氨氮培養(yǎng)基中培養(yǎng)前2 d，浸種0、4、8和12 h小球藻的OD值差異不明顯，但從培養(yǎng)的第3天開始，浸種8 h小球藻的OD值明顯大于其他小球藻，培養(yǎng)7 d后，其OD值較未浸種小球藻提高17.3%，分別較浸種4和12 h小球藻提高10.4%和6.0%，說明沼液浸種8 h對小球藻的生長具有明顯促進(jìn)作用。由圖3-B可知，在含氨氮培養(yǎng)基中培養(yǎng)的第1天，浸種8、4和12 h小球藻的比生長速率分別為未浸種小球藻的1.27倍、1.23倍和94%，在培養(yǎng)的第2天，浸種8、4和12 h小球藻的比生長速率分別是未浸種小球藻的1.19、1.15和1.09倍，其中，浸種12 h小球藻的比生長速率在培養(yǎng)第1天時小于未浸種小球藻，而在培養(yǎng)第2天時大于未浸種小球藻，說明浸種12 h的藻細(xì)胞在BG11培養(yǎng)基中擴(kuò)培1周后未能完全修復(fù)，在含氨氮培養(yǎng)基中培養(yǎng)至第2天時才恢復(fù)正常生長；從培養(yǎng)第3天開始，浸種4和12 h小球藻的比生長速率差異不明顯，但均大于未浸種小球藻；浸種8 h小球藻的比生長速率一直比其他浸種時間小球藻大，說明其生物量增長最快。綜上所述，沼液浸種可促進(jìn)小球藻生長，浸種8 h小球藻在含氨氮培養(yǎng)基中生長狀況最佳。

2.2.2 氨氮的去除效果 由圖4-A可知，在含氨氮培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d后，浸種8 h小球藻所在含氨氮培養(yǎng)基中的氨氮濃度一直低于其他浸種時間小球藻所在的含氨氮培養(yǎng)基。由圖4-B可知，在含氨氮培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d后，浸種0、4、8和12 h小球藻對氨氮的去除率分別為46.47%、49.58%、50.85%和47.47%，其中，浸種8 h小球藻對氨氮的去除率顯著高于其他浸種時間小球藻對氨氮的去除率(P<0.05，下同)?？梢姡N8 h小球藻對培養(yǎng)基中氨氮的去除效果最佳。

2.2.3 小球藻的色素含量 從圖5可看出，各浸種時間小球藻在含氨氮培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d后，其葉綠素a/b在5.54～5.82，相互間差異不顯著(P>0.05，下同)，說明小球藻細(xì)胞中葉綠素a/b的大小不是影響小球藻生長的關(guān)鍵因素；葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量在不同浸種時間小球藻間存在差異，其中，浸種8 h小球藻的葉綠素a含量和類胡蘿卜素含量與浸種0和4 h小球藻之間的葉綠素a含量和類胡蘿卜素含量差異顯著，浸種8 h小球藻各光合色素含量和浸種12 h小球藻間無顯著差異，葉綠素b含量在不同浸種時間小球藻之間無顯著差異。各浸種時間小球藻的葉綠素a含量在37.6～44.2 mg/g，類胡蘿卜素含量在8.7～10.3 mg/g，其中，浸種8 h小球藻細(xì)胞的葉綠素a含量是浸種0、4和12 h小球藻的1.17、1.15和1.05倍，浸種8 h小球藻細(xì)胞的類胡蘿卜素含量是浸種0、4和12 h小球藻的1.19、1.19和1.06倍，說明浸種8 h小球藻細(xì)胞的葉綠素a含量比類胡蘿卜素含量更高，也高于其他浸種時間小球藻細(xì)胞的葉綠素a含量?？梢姡瑢π∏蛟迳L具有重要影響的光合色素是葉綠素a，沼液浸種可提高小球藻細(xì)胞的葉綠素a含量。

2.3 利用最佳浸種小球藻處理實際廢水的效果

2.3.1 小球藻的生長狀況 浸種8 h小球藻在含氨氮培養(yǎng)基中的生長狀況和脫氮效果最好，因此以浸種8 h小球藻為藻種開展實際廢水處理試驗。由圖6可知，在實際廢水培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 d后，浸種8 h小球藻的OD值大于未浸種小球藻；在培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d后，浸種8 h小球藻的OD值比未浸種小球藻提高26.0%，說明沼液浸種8 h可促進(jìn)小球藻在實際廢水培養(yǎng)基中生長；浸種8 h和未浸種小球藻在實際廢水培養(yǎng)基中的pH均保持在7.00～8.20，該pH范圍較適合小球藻生長，說明pH對小球藻生長影響較小。

2.3.2 氨氮和總磷的去除效果 從圖7-A可看出，浸種8 h和未浸種小球藻對廢水中的總磷均有較高的去除率，從培養(yǎng)第3天開始，小球藻對總磷的去除率均保持在95.0%以上，說明未浸種小球藻的除磷能力已經(jīng)很好，沒有強(qiáng)化潛力。由圖7-B可知，浸種8 h小球藻比未浸種小球藻具有更高的氨氮去除率，隨著培養(yǎng)時間的延長，廢水中的氨氮濃度逐漸下降，培養(yǎng)第7天時，浸種8 h小球藻對氨氮的去除率達(dá)95.0%，較未浸種小球藻對氨氮的去除率提高13.1%，說明沼液浸種可明顯提高小球藻對氨氮的去除效果。

3 討 論

本研究中，在BG11培養(yǎng)基中培養(yǎng)的前4 d，沼液浸種小球藻時間越長的小球藻受到傷害越大，小球藻生長受到抑制越明顯，其比生長速率越小。沼液中的氨氮可能是對小球藻產(chǎn)生毒害作用的主要成分，已有研究表明，當(dāng)氨氮濃度超過微藻承受限值時，氨氮即可直接進(jìn)入藻細(xì)胞內(nèi)對微藻光合作用相關(guān)酶產(chǎn)生毒害作用，嚴(yán)重時會導(dǎo)致微藻細(xì)胞死亡[22-23]。本研究結(jié)果表明，高氨氮沼液直接浸種小球藻的生長曲線和總色素濃度變化曲線大體吻合，說明葉綠素濃度的變化情況能反映小球藻在培養(yǎng)基中的生長狀況[24]；高氨氮沼液浸種小球藻的時間越長，在BG11培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 d后的葉綠素a/b越低，達(dá)到葉綠素a/b峰值所需時間越長，說明沼液對小球藻的光合系統(tǒng)產(chǎn)生了影響；在BG11培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 d后，浸種8 h小球藻表現(xiàn)出與前4 d不同的生長規(guī)律，其OD值逐漸超過浸種4和12 h小球藻，說明浸種8 h小球藻能修復(fù)藻細(xì)胞的損傷，達(dá)到強(qiáng)化小球藻的目的，而浸種4 h時間過短，對小球藻的影響較小，浸種12 h時間過長，對小球藻的損害過大?？梢?，氨氮進(jìn)入小球藻細(xì)胞作用時間的長短對其細(xì)胞的影響強(qiáng)度存在差異，因此，可通過控制浸種時間來控制沼液影響小球藻的強(qiáng)度。

本研究中，在含氨氮培養(yǎng)基中浸種8 h小球藻的適應(yīng)性更強(qiáng)，具有更高的相對生長量和氨氮去除率，同時，培養(yǎng)7 d后小球藻細(xì)胞中的葉綠素a和類胡蘿卜素含量更高。史飛飛等[25]研究指出，在抗逆性馴化或鍛煉過程中，微藻抗逆性相關(guān)基因被誘導(dǎo)激活表達(dá)，其細(xì)胞生理相應(yīng)地發(fā)生適應(yīng)性改變。Li等[14]通過實驗室適應(yīng)性進(jìn)化得到的耐高CO2濃度和高產(chǎn)量藻株，其細(xì)胞中的光合色素含量相比原始藻株更高，因此推測，高氨氮沼液浸種的小球藻在含氨氮培養(yǎng)基中具有更好的生長狀況是因為沼液浸種可促使小球藻合成色素相關(guān)基因的表達(dá)，并提高藻細(xì)胞中光合色素含量，這可進(jìn)一步解釋本研究中浸種8 h的受損小球藻會在增殖過程中朝著對生長更有利的方向改變，從而得到浸種8 h小球藻較其他浸種時間小球藻生長狀況更佳的研究結(jié)果。Wang等[16]、韓浩[26]通過逐步提高沼液百分含量來馴化微藻，需4～5周才能達(dá)到馴化目的，這對于馴化小球藻來說既復(fù)雜且耗時，而本研究利用沼液直接浸種以強(qiáng)化小球藻所需時間更短，說明通過沼液直接浸種強(qiáng)化小球藻的方法可很好地解決小球藻強(qiáng)化問題。

本研究利用浸種小球藻處理實際廢水以檢驗沼液浸種小球藻的強(qiáng)化效果，結(jié)果顯示浸種8 h小球藻更適應(yīng)在實際廢水中生長，相比未浸種小球藻生長狀況更佳；浸種8 h小球藻繼承了未浸種小球藻的高效除磷性，對初始總磷濃度為11.47 mg/L的實際廢水進(jìn)行3 d處理后的總磷去除率均在95.0%以上，與Wang等[16]的研究結(jié)果一致，而葉慶等[12]利用誘變得到的小球藻在未滅菌沼液中培養(yǎng)11 d對總磷濃度為12.21 mg/L的磷去除率僅為62.7%，王忠江等[18]利用未馴化小球藻在含20%沼液和BG11培養(yǎng)基的混合液中培養(yǎng)12 d，使其總磷濃度從14.0 mg/L下降至5.0 mg/L以下需6 d，培養(yǎng)結(jié)束時總磷去除率僅為92.0%，說明本研究的強(qiáng)化小球藻具有很好的除磷效果；微藻在廢水(pH 7.00～8.20)中生長速率較快[27]，對氨氮去除的主要方式為吹脫分子態(tài)氨氮和生物吸收離子態(tài)氨氮，而實際廢水中主要存在離子態(tài)氨氮[28]。因此，本研究浸種8 h小球藻更高的相對生長量可促進(jìn)小球藻對氨氮的吸收同化。

4 結(jié) 論

利用高氨氮沼液浸種小球藻、通過控制浸種時間來強(qiáng)化小球藻處理沼液效果的方法可行。其中，以高氨氮沼液直接浸種小球藻8 h對小球藻的強(qiáng)化效果最佳，可提高小球藻細(xì)胞的葉綠素a含量，促進(jìn)小球藻生長并收獲更多的生物量；浸種8 h小球藻更適應(yīng)在廢水中生長，對污染物的去除效率得到提高，可在實際廢水處理中推廣應(yīng)用。