從江香豬睪丸支持細(xì)胞分離培養(yǎng)與鑒定

高 藝，黃 泳，馮賢辀，王維勇，徐永健，龔 婷

(1.貴州大學(xué)高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州省動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550025；2. 貴州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴陽 550025)

【研究意義】從江香豬(Congjiang Xiang pigs)是我國(guó)珍貴的微型地方豬種，主產(chǎn)于貴州省黔東南州從江縣，被列為國(guó)家二級(jí)珍稀保護(hù)畜種。睪丸支持細(xì)胞(Sertoli cells，SCs)位于生精小管中，是唯一直接與生精細(xì)胞接觸的體細(xì)胞。支持細(xì)胞具有不斷改變其功能、細(xì)胞骨架、粘附連接以及基因和蛋白質(zhì)表達(dá)以協(xié)調(diào)精子發(fā)生過程的能力，與處在不同時(shí)期的生精細(xì)胞接觸，使生精細(xì)胞從最不成熟的精原細(xì)胞發(fā)育成高度特化的細(xì)長(zhǎng)精子細(xì)胞，最終從生精小管釋放成為精子，支持細(xì)胞對(duì)睪丸的發(fā)育和精子的形成至關(guān)重要[1-2]。卵泡刺激素(Follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)和睪酮通過支持細(xì)胞的FSH受體和雄激素受體結(jié)合蛋白傳遞激素信號(hào)調(diào)節(jié)精子發(fā)生[3]。支持細(xì)胞還可分泌雄激素結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、抑制素等調(diào)節(jié)生精細(xì)胞周圍微環(huán)境的因子[4]，對(duì)生精細(xì)胞發(fā)揮增殖分化、凋亡、吞噬等調(diào)節(jié)作用[5-7]。睪丸支持細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)，對(duì)于研究哺乳動(dòng)物雄性生殖機(jī)能具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】從江香豬早期生長(zhǎng)迅速且性成熟早，公豬30 d時(shí)生精小管出現(xiàn)游離精子進(jìn)入初情期，65～75 d出現(xiàn)爬跨行為，170 d可初配，且其基因純合，與人類基因相似度優(yōu)于小鼠、大鼠等常見動(dòng)物[16-17]，體外培養(yǎng)支持細(xì)胞可為從江香豬性早熟機(jī)制形成奠定基礎(chǔ)。目前，分離支持細(xì)胞的方法主要有組織塊培養(yǎng)法、酶消化法和機(jī)械分離法，酶消化法又分為單一酶消化法、組合酶法等，較常用的方法是組合酶法，常見的消化酶有膠原酶Ⅳ、透明質(zhì)酸酶、胰酶及DNAseⅠ等[13]。組合酶法相較于單一酶消化法提高了支持細(xì)胞成活率和數(shù)量，相較于組織塊培養(yǎng)法和機(jī)械分離法具有簡(jiǎn)便、節(jié)省時(shí)間且不易污染的優(yōu)點(diǎn)[14-15]。不同種屬動(dòng)物睪丸組織結(jié)構(gòu)差別大，在酶和消化時(shí)間的選擇上仍需探索?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已在小鼠[8]、大鼠[9]、牛[10]、羊[11]、馬[12]等動(dòng)物和家畜上建立了睪丸支持細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，但在豬上特別是地方特色小型豬種上支持細(xì)胞的分離培養(yǎng)鑒定仍較少。【擬解決的關(guān)鍵問題】建立從江香豬睪丸支持細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系，為研究從江香豬支持細(xì)胞具體功能提供材料，并促進(jìn)香豬雄性繁殖特性機(jī)制的后續(xù)研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試動(dòng)物 從江香豬睪丸樣采集于貴州大學(xué)香豬場(chǎng)，2月齡香豬，體況健康，發(fā)育良好。香豬進(jìn)行保定麻醉后，手術(shù)法取出兩側(cè)睪丸，樣品置于含3%雙抗的生理鹽水中冰上運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。試驗(yàn)香豬按照中國(guó)農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物福利行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行飼養(yǎng)管理。

1.1.2 主要儀器與試劑 正置熒光顯微鏡(ECLIPSE-Ni+DS-Ri2)購自Nikon公司，PCR擴(kuò)增儀購自Bio-rad公司，電泳儀購自六一儀器廠，膠原酶Ⅳ型購自Biofroxx公司，青—鏈霉素(雙抗)、磷酸鹽緩沖液、胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%)、HE染色試劑盒、5%牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)、4%多聚甲醛和Triton X-100均購自Solarbio公司，胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基購自Gibco公司，TRIzol RNA抽提試劑、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo公司，一抗GATA4購自Affinity公司，熒光二抗FITC標(biāo)記驢抗兔IgG購自Bioss公司，WT1、SOX9、ACTB引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 睪丸組織切片HE染色 從江香豬睪丸組織新鮮樣品使用酒精消毒表面，用含3%雙抗磷酸鹽緩沖鹽溶液(Phosphate buffered saline，PBS)清洗干凈后，將睪丸組織置于4%多聚甲醛溶液中浸泡4 ℃過夜，經(jīng)修塊、脫水、透明、透蠟、石蠟包埋、切片、展片、烤片等步驟制作睪丸組織石蠟切片，再經(jīng)脫蠟水化、HE染色、脫水透明、中性樹脂封片完成石蠟切片HE染色。

1.2.2 SCs的分離與培養(yǎng) 組織處理：用含3%雙抗PBS清洗睪丸樣3次后，去除附睪、血管、脂肪等組織，剝離睪丸白膜及睪丸內(nèi)明顯的血管及間質(zhì)，分離睪丸生精小管后轉(zhuǎn)移到新培養(yǎng)皿中，組織剪碎至無顆粒感后轉(zhuǎn)移到50 mL離心管。酶消化：離心管中加8倍組織體積的0.1%膠原酶Ⅳ，37 ℃震蕩孵育50～60 min，1200 r/min離心5 min去上清液，DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸1次去上清液；加3倍體積0.25%胰酶消化10 min，期間滴幾滴細(xì)胞液到載玻片上鏡檢，大部分成單細(xì)胞時(shí)加等體積含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化；為進(jìn)一步分散細(xì)胞團(tuán)，使用200和400目鋼篩過濾，濾液1000 r/min離心5 min棄上清液，加入沉淀2倍體積紅細(xì)胞裂解液冰浴15 min，充分去除紅細(xì)胞；1000 r/min離心5 min棄上清液，加含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基入瓶置于33 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。差速貼壁：原代細(xì)胞培養(yǎng)5 h后棄上清液，加入含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2.3 SCs的形態(tài)學(xué)觀察及HE染色 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SCs以1×106個(gè)/mL接種于鋪有細(xì)胞爬片的6孔板中，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)80%～90%時(shí)棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗3次后，用4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞20 min，再用蘇木精染色15～20 min，若染色過深則用分色液分色，伊紅染色2 min，將細(xì)胞爬片取出置于顯微鏡下觀察。

表1 引物序列信息

1.2.4 SCs生長(zhǎng)曲線繪制 將培養(yǎng)的原代SCs調(diào)整原始濃度為1×104個(gè)/mL于24孔板中，每2 d更換細(xì)胞培養(yǎng)液，每天進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，連續(xù)檢測(cè)8 d。

1.2.5 SCs特異性基因檢測(cè) 當(dāng)培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞匯合度達(dá)80%～90%時(shí)，棄去培養(yǎng)基PBS，清洗細(xì)胞3次，加入Trizol試劑裂解細(xì)胞提取總RNA，測(cè)定RNA濃度和純度后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR。PCR反應(yīng)體系為：rTaq酶10 μL，cDNA 1 μL，上、下游引物各1 μL(10 μmol/L)，ddH2O 7 μL。PCR 反應(yīng)條件為: 95 ℃ 5 min; 95 ℃ 60 s，59 ℃ 60 s，72 ℃ 1 min，33個(gè)循環(huán); 72 ℃ 5 min，用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，引物序列見表1。

1.2.6 SCs免疫熒光檢測(cè) 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的支持細(xì)胞以1×106個(gè)/mL接種于鋪有細(xì)胞爬片的6孔板中，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)80%時(shí)棄去培養(yǎng)基用PBS清洗3次(均在恒速搖床上輕柔清洗，每次5 min)，4% PFA固定細(xì)胞20 min，加入0.5% Triton X-100處理20 min，3% BSA封閉30 min，以上步驟均在室溫下進(jìn)行；每張細(xì)胞爬片加300 μL GATA-4抗體(1∶200)4 ℃孵育過夜；加入FITC標(biāo)記的對(duì)應(yīng)種屬熒光二抗(1∶300)37 ℃避光孵育2 h；加入終濃度為5 μg/mL DAPI染色1 min，將細(xì)胞爬片置于正置熒

光顯微鏡下拍照觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 SCs形態(tài)學(xué)分析

從圖1看出，2月齡香豬的睪丸發(fā)育正常，睪丸切面清晰可見完整生精小管截面和間質(zhì)區(qū)域。支持細(xì)胞位于生精小管生精上皮中，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，一側(cè)緊貼小管基膜，另一側(cè)延伸至不同發(fā)育級(jí)別的生精細(xì)胞周圍，多數(shù)細(xì)胞染色較生精細(xì)胞淺，細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則。生精小管腔面可見整齊排列的生精細(xì)胞，小管管腔出現(xiàn)變形精子細(xì)胞，小管之間廣泛分布間質(zhì)細(xì)胞。

2.2 組合酶消化分離培養(yǎng)SCs

0.1%Ⅳ型膠原酶和0.25%胰酶-EDTA消化后得到大量單細(xì)胞混懸液，包括各級(jí)生精細(xì)胞、支持細(xì)胞、睪丸間質(zhì)細(xì)胞、少量細(xì)胞團(tuán)塊及組織碎片等(圖2)。利用差速貼壁法進(jìn)行支持細(xì)胞純化后，多數(shù)支持細(xì)胞5 h貼壁，但仍有生精細(xì)胞附著在支持細(xì)胞上或懸浮于培養(yǎng)基，此時(shí)可換液去除雜細(xì)胞(圖3)。經(jīng)分離的SCs貼壁性良好，普通光學(xué)顯微鏡下可見其形態(tài)呈梭形或不規(guī)則形，每2 d進(jìn)行細(xì)胞換液，培養(yǎng)3 d后SCs呈單層鋪滿瓶底(圖4-A)。此時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，相鄰細(xì)胞緊密連接，可清晰觀察到細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中的顆粒狀物質(zhì)或小空泡(圖4-B)。

2.3 從江香豬睪丸支持細(xì)胞HE染色

從圖5看出，分離的支持細(xì)胞經(jīng)過HE染色可見其形態(tài)不規(guī)則，胞質(zhì)完全鋪開，胞體寬大，胞質(zhì)染色呈淡紫紅色；細(xì)胞核及衛(wèi)星小體位于細(xì)胞中央或邊緣呈不規(guī)則形狀，染為深紫色。

2.4 從江香豬睪丸支持細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

從圖6看出，細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，從江香豬SCs分離后1～2 d增殖速度緩慢，培養(yǎng)3～6 d細(xì)胞增殖速度加快，活性增強(qiáng)，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；培養(yǎng)7～8 d后細(xì)胞增長(zhǎng)速度下降。整個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)周期呈“S”形曲線，符合一般細(xì)胞生長(zhǎng)規(guī)律。

2.5 SCs 特異性基因鑒定

利用RT-PCR方法檢測(cè)SCs標(biāo)志基因，凝膠電泳分析結(jié)果(圖7)顯示，SCs分子標(biāo)記WT1、SOX9均表達(dá)。

2.6 SCs免疫熒光染色

從GATA-4單克隆抗體進(jìn)行支持細(xì)胞免疫熒光鑒定結(jié)果(圖8)看出，GATA-4特異性染色為綠色，DAPI細(xì)胞核染色為藍(lán)色，合并圖像顯示淡藍(lán)色。經(jīng)顯微鏡計(jì)數(shù)GATA-4抗體免疫陽性率達(dá)90%以上。

3 討 論

支持細(xì)胞通過直接接觸生精細(xì)胞和控制生精小管內(nèi)環(huán)境，促進(jìn)生精細(xì)胞向精子的發(fā)展。支持細(xì)胞參與胚胎發(fā)育時(shí)期睪丸索形成，且出生后作為保育細(xì)胞影響精子發(fā)生中的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)、胞間連接以及參與調(diào)控生精細(xì)胞的有絲分裂和減數(shù)分裂[18-20]。支持細(xì)胞參與形成的血—睪屏障，通過提供有效的免疫調(diào)節(jié)，維持睪丸中生精細(xì)胞的免疫特權(quán)和免疫保護(hù)，形成適于精子發(fā)生的局部免疫豁免區(qū)域，若血—睪屏障結(jié)構(gòu)受損則會(huì)發(fā)生自身免疫性睪丸炎，導(dǎo)致雄性不育[21-22]。支持細(xì)胞也參與其他睪丸體細(xì)胞發(fā)育和功能的調(diào)節(jié)，包括支持青春期前睪丸管周肌樣細(xì)胞和睪丸脈管系統(tǒng)發(fā)育以及通過調(diào)控類固醇生成影響胎兒和成人睪丸間質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育和功能從而影響其雄激素分泌水平[23]。

哺乳動(dòng)物雄性生殖系統(tǒng)的發(fā)育分化和精子發(fā)生過程中基因表達(dá)受多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)，鑒定支持細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子選擇的SOX9、Wt1、GATA4。Y染色體性別決定區(qū)基因盒9(Sex determining region Y，SRY-box 9，SOX9)是胚胎發(fā)育和成體階段多種組織細(xì)胞分化所必需的，睪丸發(fā)育的整個(gè)過程中SOX9 持續(xù)表達(dá)在支持細(xì)胞中[24]，SOX9作為SRY的直接靶點(diǎn)，在哺乳動(dòng)物的胚胎發(fā)育性別決定中起關(guān)鍵作用[25]。在豬上，有研究表明SOX9在支持細(xì)胞中呈發(fā)育階段依賴性表達(dá)，推測(cè)SOX9在早期睪丸發(fā)育中起著關(guān)鍵作用[26]。威廉姆斯瘤基因(Wilms tumor suppressor 1，Wt1)是一種抑癌基因，Wt1通過調(diào)節(jié)支持細(xì)胞極性調(diào)節(jié)精子發(fā)生，Wt1敲除會(huì)導(dǎo)致生精細(xì)胞大量死亡，與人類的非梗阻性無精子癥相似[27]。有研究表明Wt1在豬胚胎60 d前主要分布在支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中，而在新生和成年豬睪丸的生精上皮中廣泛表達(dá)，而在附睪及輸精管中未檢測(cè)到Wt1的表達(dá)[28]。GATA 家族蛋白是一組含鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，在哺乳動(dòng)物器官形態(tài)發(fā)生、細(xì)胞增殖和性別分化中起重要作用，GATA 結(jié)合蛋白 4(GATA-4)通過調(diào)節(jié)介導(dǎo)苗勒氏管退化和睪酮產(chǎn)生來促進(jìn)胎兒男性性腺發(fā)育[4]，GATA-4在睪丸發(fā)育的整個(gè)胎兒期和青春期前期在支持細(xì)胞的細(xì)胞核中大量表達(dá)[29]。

生精小管上皮單細(xì)胞懸液制備的關(guān)鍵點(diǎn)在于盡可能去除間質(zhì)組織和其他雜細(xì)胞，在支持細(xì)胞分離過程中，可能有管周肌樣細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞混雜其中，利用不同細(xì)胞貼壁能力的不同，可以采用差速貼壁的方法盡可能去除雜細(xì)胞[30-31]，而生精細(xì)胞不易貼壁處于懸浮狀態(tài)，換液即可去除。若仍有少量生精細(xì)胞附著于支持細(xì)胞上換液不易去除，則可利用生精細(xì)胞對(duì)低滲液耐受程度較差的特性，使用低滲Tris-HCL溶液使其懸浮后換液繼續(xù)培養(yǎng)[13]。不同種屬不同日齡的動(dòng)物睪丸內(nèi)各種細(xì)胞數(shù)量占比不同，可根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)需求選擇不同日齡的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。筆者前期通過觀察從江香豬不同日齡的睪丸組織切片發(fā)現(xiàn)生精小管面積隨年齡的增長(zhǎng)而增加，若無特殊需求應(yīng)在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的年齡上選擇間質(zhì)組織較少的兩月齡以上的香豬[32]。支持細(xì)胞鑒定的特異性標(biāo)記因子并不單一，還可以選擇膠質(zhì)細(xì)胞源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)[33]、雄激素結(jié)合蛋白(Androgen binding protein，ABP)[34]等，在特異性抗體的選擇上還有WT1[35]、Vimentin[36]等可用于支持細(xì)胞的免疫熒光染色檢測(cè)。

4 結(jié) 論

通過使用0.1%膠原酶Ⅳ和0.25%胰蛋白酶-EDTA的兩步酶消化法以及差速時(shí)間貼壁的方法，分離2月齡香豬睪丸支持細(xì)胞，利用此方法獲得呈梭形或不規(guī)則形，形態(tài)大小較均一，細(xì)胞匯合后生長(zhǎng)連接緊密呈鋪路石狀的細(xì)胞，約3～4 d即可鋪滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶底，可進(jìn)行傳代或凍存。對(duì)獲得的細(xì)胞進(jìn)行鑒定，獲得的細(xì)胞呈SOX9+/WT1+，GATA-4免疫熒光陽性表達(dá)，符合支持細(xì)胞的特征。試驗(yàn)成功建立了從江香豬睪丸支持細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)鑒定方法。