CAHB誘導(dǎo)成人急性淋巴細胞白血病Jurkat細胞凋亡機制的研究

[摘要]"目的"探討二乙酰己二胺（diacetyl"hexamethylene"diamine，CAHB）誘導(dǎo)成人急性淋巴細胞白血病Jurkat細胞凋亡的機制，為CAHB應(yīng)用于臨床提供理論依據(jù)。方法"采用流式細胞儀分析CAHB處理后Jurkat細胞AnnexinⅤ+/PI-細胞率，觀察應(yīng)用胱天蛋白酶（caspase）-9抑制劑Z-LEHD-FMK處理后AnnexinⅤ+/PI-細胞率的變化；蛋白質(zhì)印跡法觀察凋亡相關(guān)蛋白caspase-8、caspase-9、caspase-3的表達變化。結(jié)果"CAHB誘導(dǎo)后Jurkat細胞體積縮小、胞膜皺縮、染色質(zhì)濃染、核固縮或碎裂等，可見典型凋亡小體。CAHB通過激活caspase-9、caspase-3誘導(dǎo)Jurkat細胞發(fā)生凋亡，其作用呈明顯的量效關(guān)系和時間依賴性，caspase-9抑制劑可在一定程度上抑制CAHB的凋亡誘導(dǎo)作用。結(jié)論"CAHB誘導(dǎo)Jurkat細胞凋亡與激活caspase-9及caspase-3有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]"二乙酰己二胺；急性淋巴細胞白血??；Jurkat細胞；凋亡

[中圖分類號]"R733.71""""""[文獻標識碼]"A""""[DOI]"10.3969/j.issn.1673-9701.2024.10.010

Study"on"apoptosis"mechanism"of"Jurkat"cells"induced"by"CAHB"in"adult"acute"lymphoblastic"leukemia

ZHANG"Jia，"HONG"Ye，"CHEN"Baoguo，"LUO"Wenda

Department"of"Haematology，"Taizhou"Hospital"of"Zhejiang"Province，"Linhai"317000，"Zhejiang，"China

[Abstract]"Objective"To"explore"the"mechanism"of"apoptosis"induced"by"diacetyl"hexamethylene"diamine"（CAHB）"in"adult"acute"lymphoblastic"leukemia"Jurkat"cells，"and"to"provide"theoretical"basis"for"the"clinical"application"of"CAHB."Methods"Annexin"V+/PI-"cell"rate"of"Jurkat"cells"after"CAHB"induction"was"analyzed"by"flow"cytometry."The"Annexin"V+/PI-"cell"rate"was"observed"after"treatment"with"caspase-9"inhibitor"Z-LEHD-FMK."The"expressions"of"apoptosis-related"proteins"caspase-8，"caspase-9"and"caspase-3"were"observed"by"Western"blotting."Results"After"CAHB"induction，"Jurkat"cells"were"reduced"in"size，"cell"membrane"crinkling，"chromatin"thickening，"nuclear"pyknosis"or"fragmentation，"etc."Typical"apoptotic"bodies"could"be"seen."CAHB"induced"Jurkat"cell"apoptosis"by"activating"caspase-9"and"caspase-3"in"a"dose-effect"and"time-dependent"manner."Caspase-9"inhibitors"could"inhibit"apoptosis"induction"of"CAHB"to"a"certain"extent."Conclusion"CAHB"induced"Jurkat"cell"apoptosis"was"related"to"caspase-9"and"caspase-3"activation.

[Key"words]"Diacetyl"hexamethylene"diamine;"Acute"lymphoblastic"leukemia;"Jurkat"cell;"Apoptosis

成人急性淋巴細胞白血病（acute"lymphoblastic"leukemia，ALL）是一組血液系統(tǒng)惡性腫瘤，其特點是骨髓、外周血和髓外的淋巴樣祖細胞克隆分化受損和高度增殖[1]。第5版世界衛(wèi)生組織造血與淋巴組織腫瘤分類將其分為急性B淋巴細胞白血?。˙-acute"lymphoblastic"leukemia，B-ALL）和急性T淋巴細胞白血?。═-acute"lymphoblastic"leukemia，T-ALL）[2]。其中T-ALL由T系前體細胞惡性轉(zhuǎn)化及克隆性擴增引起，在兒童病例中占10%～15%，在成人病例中占25%[3]。盡管T-ALL的治療在過去幾十年取得重大進展，但耐藥性仍是影響療效的一個主要問題，特別是在成年患者中，而加大化療藥物劑量則增加急性或慢性藥物毒性[4-5]。因此，尋找低毒高效的藥物并探討其作用機制是目前的研究重點。二乙酰己二胺（diacetyl"hexamethylene"diamine，CAHB）是我國自主研發(fā)的新藥，目前已完成骨髓增生異常綜合征為適應(yīng)證的Ⅰ期（批件號：1999XL0059）和ⅡA期臨床試驗（批件號：2005L02959）。本課題組前期已證實CAHB可作用于T-ALL"Jurkat細胞抑制蛋白激酶B（protein"kinase"B，Akt）磷酸化，下調(diào)磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide"3-kinase，PI3K）/Akt信號通路的活性，然后作用于下游的Bcl-2家族相關(guān)因子并激活胱天蛋白酶（caspase）-3發(fā)揮其誘導(dǎo)凋亡作用[6]，但未進一步研究具體的凋亡路徑。本研究對CAHB誘導(dǎo)Jurkat細胞可能的凋亡通路進行探討。

1""材料與方法

1.1""材料

T-ALL"Jurkat細胞株購自中科院上海細胞庫。CAHB原藥由無錫山禾制藥有限公司提供，caspase-3、caspase-8、caspase-9購自Cell"Signaling公司，AnnexinⅤ/PI凋亡檢測試劑盒購自Molecular"Probes公司，Z-LEHD-FMK購自R＆D公司，F(xiàn)ACS"caliber流式細胞儀購自美國BD公司，RT-6000酶標分析儀購自德國Rayto公司，半干蛋白轉(zhuǎn)膜儀、電泳儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2""方法

1.2.1""細胞培養(yǎng)""Jurkat細胞用含10%胎牛血清的RPMI"1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中。每隔2～3d傳代1次，收集生長狀態(tài)良好并處于對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

1.2.2""細胞形態(tài)觀察""將細胞以5×105個/孔接種于六孔板，其一為空白對照組，另一組細胞經(jīng)20mmol/L的CAHB誘導(dǎo)培養(yǎng)24h后，收集細胞，用磷酸鹽緩沖液（phosphate"buffer"solution，PBS）離心洗滌2次，加入70%無水乙醇室溫固定1h，PBS重懸，4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）室溫避光染色10min，制作細胞薄片，熒光顯微鏡下觀察細胞核形態(tài)變化。

1.2.3""流式細胞術(shù)檢測Annexin-Ⅴ陽性細胞表達""收集對數(shù)生長期Jurkat細胞，以5×105個/孔接種于六孔板，加入CAHB，使藥物終濃度分別為0、5、10、20、40mmol/L，24h后收集細胞，PBS漂洗2遍后，按Annexin-Ⅴ-FITC/PI試劑盒操作說明使用流式細胞術(shù)進行檢測分析。

1.2.4""蛋白質(zhì)印跡法分析caspase-8、caspase-9、caspase-3的表達""4×106個細胞接種于培養(yǎng)瓶，同上以CAHB誘導(dǎo)24h后收集各組培養(yǎng)細胞，用PBS洗滌2遍后用RIPA裂解，4℃"12"000×g離心，收集細胞裂解液。將細胞裂解液于12%聚丙烯酰胺電泳分離后，使用半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)至PVDF膜，用3%"BSA室溫封閉2h，然后加入一抗4℃過夜后，用PBST室溫清洗3遍，加入二抗，室溫2h，PBST洗滌3遍，DAB顯色。內(nèi)參：GAPDH。

1.2.5""caspase-9抑制劑對細胞凋亡的影響""取對數(shù)生長期細胞，配成2.5×105/ml細胞懸液，接種于六孔板中，分為對照組和處理組，每組設(shè)3個復(fù)孔，其中處理組加入終濃度為80μmol/L的caspase-9抑制劑Z-LEHD-FMK，兩組均以20mmol/L"CAHB誘導(dǎo)24h后使用流式細胞術(shù)進行檢測分析。

1.3""統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS"17.0軟件分析數(shù)據(jù)。所有實驗至少重復(fù)3次，計量資料以均數(shù)±標準差（"）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2""結(jié)果

2.1""CAHB誘導(dǎo)Jurkat細胞凋亡的形態(tài)改變

使用20mmol/L的CAHB誘導(dǎo)24h后Jurkat細胞出現(xiàn)凋亡，細胞體積縮小、胞膜皺縮、染色質(zhì)濃染、核固縮或碎裂等，可見典型凋亡小體，對照組Jurkat細胞胞膜完整，胞核占據(jù)細胞大部分、染色質(zhì)分布均勻，見圖1。

2.2""細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的變化

Jurkat細胞經(jīng)不同濃度CAHB誘導(dǎo)24h后，caspase-8蛋白表達變化不大（Pgt;0.05）。pro-caspase-9蛋白表達隨濃度升高明顯下降，cleaved"caspase-9、cleaved"caspase-3蛋白表達隨濃度升高逐漸上升（Plt;0.01），見圖2。

2.3""CAHB誘導(dǎo)后AnnexinⅤ+/PI-細胞率的變化

經(jīng)不同濃度CAHB誘導(dǎo)24h后，AnnexinⅤ+/PI-細胞率隨藥物濃度的升高而增加，呈劑量依賴性。除5mmol/L組外，其余試驗組與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05），見圖3。

2.4""caspase-9抑制劑對細胞凋亡的影響

caspase-9抑制劑顯著降低處理組AnnexinⅤ+/PI-細胞率（Plt;0.01），減少細胞凋亡，見圖4。

3""討論

凋亡是細胞在一定的生理或病理條件下的程序性死亡過程[7]。細胞凋亡及其相關(guān)的信號通路對腫瘤發(fā)展有著深遠的影響，因此，誘導(dǎo)細胞凋亡是抗腫瘤的理想目標。

本課題組已證實CAHB對T-ALL"Jurkat細胞有強烈的誘導(dǎo)凋亡作用，并呈現(xiàn)出明顯的濃度-時間依賴性[6]。Jurkat細胞經(jīng)CAHB誘導(dǎo)后細胞體積縮小、染色質(zhì)濃縮、核固縮或碎裂，可見典型的凋亡小體。使用不同濃度的CAHB處理Jurkat細胞24h后，通過流式細胞術(shù)分析細胞凋亡情況，進一步證實CAHB對Jurkat細胞的凋亡誘導(dǎo)作用，且細胞凋亡率隨著CAHB濃度的增高顯著增加。

細胞凋亡通過兩個主要途徑觸發(fā)，即外在途徑和內(nèi)在途徑[8]。外在途徑又稱死亡受體途徑，主要由細胞表面死亡受體介導(dǎo)，主要通過腫瘤壞死因子受體超家族成員的配體激活，這些家族成員具有細胞內(nèi)死亡結(jié)構(gòu)域，促進死亡誘導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物的形成，導(dǎo)致caspase-8和下游效應(yīng)器的激活從而促使細胞凋亡。而內(nèi)在途徑是化療藥物誘導(dǎo)細胞凋亡的核心通路之一，在各種凋亡因子的作用下，Bcl-2家族蛋白表達發(fā)生改變，將凋亡信號傳遞至線粒體，造成線粒體損傷并誘導(dǎo)其激發(fā)線粒體通透性轉(zhuǎn)運孔不可逆過度開放、線粒體膜電位持續(xù)性降低等。緊接著細胞色素C釋放入胞漿，與Apaf-1結(jié)合形成Apaf-1-細胞色素C多聚復(fù)合體，通過半胱氨酸蛋白酶募集域的作用，Apaf-1和caspase-9酶原結(jié)合后活化為有活性的caspase-9，啟動caspase級聯(lián)反應(yīng)，激活下游的凋亡執(zhí)行者caspase-3，完成對其相應(yīng)底物的切割，引起細胞凋亡[9-10]。前期研究結(jié)果表明CAHB可抑制Akt磷酸化，下調(diào)PI3K/Akt信號通路的活性，進而下調(diào)下游Bcl-2家族的凋亡相關(guān)因子，降低線粒體膜電位，證實CAHB誘導(dǎo)Jurkat細胞凋亡可通過線粒體通路，但未進一步對凋亡蛋白進行研究。

caspase家族在細胞凋亡中發(fā)揮重要作用[11]。caspase-8和caspase-9可通過caspase-3啟動caspase級聯(lián)反應(yīng)促進細胞凋亡[12]。caspase-8已被證明可通過外在途徑誘導(dǎo)細胞凋亡[13]；而caspase-9是內(nèi)在凋亡途徑的啟動者。本研究發(fā)現(xiàn)caspase-8蛋白表達無明顯改變，推測CAHB誘導(dǎo)Jurkat細胞凋亡可能不通過外在途徑。這與Ruefli等[14]研究證實的六亞甲基二乙酰胺也能通過活化caspase-8誘導(dǎo)凋亡的結(jié)果不同。同時，本研究發(fā)現(xiàn)CAHB通過激活caspase-9誘導(dǎo)細胞凋亡，使用caspase-9抑制劑Z-LEHD-"FMK進行驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這種凋亡可被Z-LEHD-"FMK一定程度抑制，表明CAHB可通過激活caspase-"9，最終激活下游的caspase-3導(dǎo)致Jurkat細胞凋亡，同時也提示CAHB促Jurkat細胞凋亡可能還存在其他作用機制。

綜上所述，CAHB通過誘導(dǎo)凋亡發(fā)揮抗淋巴細胞白血病的作用，其主要通過內(nèi)在途徑誘導(dǎo)凋亡，與激活caspase-9及caspase-3相關(guān)，這可為CAHB用作臨床抗癌藥物提供理論依據(jù)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2023–05–16）

（修回日期：2024–03–07）