急性心肌梗死外周血單個核細(xì)胞中CUX1、CTSD表達(dá)水平及其對預(yù)后的診斷價值

宋寧 石楊 蔡建葉 張曉荷 靳蕊 張秀英 馬培梁

基金項目?甘肅省衛(wèi)生行業(yè)科研計劃項目（No.GSWSKY-201920）

作者單位?1.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九四醫(yī)院（蘭州 730050）；2.甘肅省人民醫(yī)院（蘭州 730000）

通訊作者?馬培梁，E-mail：mpl1232@163.com

引用信息?宋寧，石楊，蔡建葉，等.急性心肌梗死外周血單個核細(xì)胞中CUX1、CTSD表達(dá)水平及其對預(yù)后的診斷價值［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2024，22（7）：1296-1300.

摘要?目的：探討急性心肌梗死（AMI）病人外周血單個核細(xì)胞（PBMC）中剪樣同源盒1（CUT1）、組織蛋白酶D（CTSD）表達(dá)及兩者對AMI預(yù)后的診斷價值。方法：選取2019年2月—2020年2月我院診治的96例AMI病人為研究對象，根據(jù)隨訪1年內(nèi)AMI病人是否發(fā)生主要不良心血管事件（MACE），將AMI病人分為預(yù)后不良組（32例）和預(yù)后良好組（64例）。以同期我院進行健康體檢的60名健康者為對照組。應(yīng)用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測各組病人PBMC中CUX1、CTSD的表達(dá)。比較各組CUX1、CTSD水平、臨床生化指標(biāo)及心功能指標(biāo)。采用Pearson相關(guān)分析法分析AMI病人CUX1、CTSD表達(dá)與臨床生化指標(biāo)及心功能的相關(guān)性。采用多因素Logistic回歸分析AMI病人MACE發(fā)生的影響因素。受試者工作特征（ROC）曲線分析CUX1、CTSD對AMI病人MACE發(fā)生的診斷效能。結(jié)果：與對照組比較，AMI預(yù)后良好組及預(yù)后不良組病人PBMC中CUX1、CTSD表達(dá)明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與預(yù)后良好組比較，預(yù)后不良組AMI病人PBMC中CUX1、CTSD表達(dá)及超敏肌鈣蛋白T（hs-cTnT）、N末端腦鈉肽前體（NT-proBNP）明顯升高，左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左室短軸縮短率（LVFS）及心排血量（CO）明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。AMI病人PBMC中CUX1、CTSD表達(dá)與hs-cTnT、NT-proBNP呈正相關(guān)，與LVEF、LVFS及CO呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。hs-cTnT升高、LVEF降低、CUX1升高及CTSD升高是AMI病人MACE發(fā)生的獨立危險因素（P＜0.05）。CUX1、CTSD及二者聯(lián)合檢測預(yù)測AMI病人MACE的曲線下面積（AUC）分別為0.776、0.874及0.910。二者聯(lián)合檢測預(yù)測AMI病人MACE的AUC顯著高于單一指標(biāo)檢測。結(jié)論：AMI病人PBMC中CUX1、CTSD表達(dá)升高，是影響AMI病人不良預(yù)后的獨立危險因素，兩者聯(lián)合檢測有助于判斷AMI病人臨床預(yù)后。

關(guān)鍵詞?急性心肌梗死；外周血單個核細(xì)胞；剪樣同源盒1；組織蛋白酶D；預(yù)后

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.07.025

急性心肌梗死（acute myocardial infaction，AMI）是常見的心血管系統(tǒng)危急重癥。我國AMI的發(fā)病率為45/10萬，死亡率為32/10萬，且AMI發(fā)病呈年輕化趨勢［1］。AMI可引起乳頭肌功能失調(diào)、心力衰竭、惡性心律失常及心源性死亡等并發(fā)癥，導(dǎo)致病人預(yù)后不良。深入研究AMI的疾病機制，尋找能夠評估AMI的預(yù)后標(biāo)志物，積極采取個體化的防治措施，對改善病人預(yù)后意義重大。剪樣同源盒1（cut like homeobox 1，CUX1）編碼基因位于7號染色體，編碼蛋白屬于DNA結(jié)合蛋白同源域家族成員，在調(diào)節(jié)基因表達(dá)、細(xì)胞形態(tài)發(fā)生和分化及細(xì)胞周期進程中發(fā)揮重要作用［2］。有研究對AMI病人外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）基因表達(dá)進行高通量篩選，發(fā)現(xiàn)CUX1表達(dá)上調(diào)可能是預(yù)測AMI后發(fā)生心力衰竭的潛在生物標(biāo)志物［3］。組織蛋白酶D（cathepsin D，CTSD）是多肽酶A1家族的成員，成熟的CTSD能夠蛋白水解激素和生長因子等多種蛋白質(zhì)產(chǎn)物，參與惡性腫瘤及神經(jīng)退行性疾病等的發(fā)生發(fā)展過程［4-5］。研究發(fā)現(xiàn)，CTSD表達(dá)能夠通過激活心肌細(xì)胞自噬，促進心臟結(jié)構(gòu)重塑，與ST段抬高型心肌梗死（STEM）病人早期發(fā)生心功能障礙密切相關(guān)［6］。因此，本研究通過檢測AMI病人PBMC中CUX1、CTSD的表達(dá)，分析兩者與AMI預(yù)后的關(guān)系。

1?對象與方法

1.1?研究對象

選取2019年2月—2020年2月我院診治的96例AMI病人為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：1）AMI的診斷結(jié)合病人臨床表現(xiàn)、心電圖檢查、心肌損傷標(biāo)志物及冠狀動脈造影等。STEMI的診斷符合2019年中華醫(yī)學(xué)會心血管病學(xué)分會制定的《急性ST 段抬高型心肌梗死診斷和治療指南（2019）》［7］，非STEMI的診斷符合2016年制定的《非ST段抬高型急性冠狀動脈綜合征診斷和治療指南（2016）》［8］。2）臨床及實驗室檢查資料完整。3）病人及家屬對本研究知情同意，能夠配合相關(guān)檢查及隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）伴有先天性心臟病或心肌炎等疾??；2）伴有惡性腫瘤、肝腎功能障礙等疾??；3）伴有自身免疫性疾病或感染性疾病。以同期進行健康體檢的60名健康者作為對照組。本研究經(jīng)本院倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2?隨訪及預(yù)后分組

所有AMI病人確診后開始進行隨訪，每個月隨訪1次，連續(xù)隨訪1年，隨訪內(nèi)容為主要不良心血管事件（major adverse cardiovascular events，MACE）的發(fā)生情況，包括心力衰竭、心源性死亡、再發(fā)性心肌梗死及靶血管血運重建。發(fā)生MACE的AMI病人納入預(yù)后不良組（32例），未發(fā)生MACE的AMI病人納入預(yù)后良好組（64例）。

1.3?研究方法

1.3.1?資料收集

1）收集研究對象的臨床資料，包括性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)、高血壓病史、糖尿病病史、吸煙史。2）收集實驗室檢查指標(biāo)及心肌損傷指標(biāo)，包括肌酸激酶同工酶（CK-MB）、超敏肌鈣蛋白T（hs-cTnT）、N-末端腦鈉肽前體（NT-proBNP）、三酰甘油、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇。收集心臟彩超檢查結(jié)果包括左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左室短軸縮短率（LVFS）及心排血量（CO）。

1.3.2?PBMC中CUX1、CTSD表達(dá)檢測

收集研究對象入院后靜脈血5mL，肝素抗凝，2 500 r/min離心5 min，將下層血細(xì)胞轉(zhuǎn)入15 mL無菌離心管，加入外周血淋巴細(xì)胞分離液3 mL（購自上海愛必信公司，貨號abs930），梯度密度離心法進行離心，2000 r/min，離心20min，吸取中間PBMC層細(xì)胞。應(yīng)用Trizol法提取PBMC中的總RNA。采用NaroDrop1000（美國賽默飛公司）檢測總RNA的濃度和純度，OD260/OD280比值為1.8～2.1。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TAKARA公司）將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后進行實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）。引物由上海生工公司設(shè)計合成。CUX1正向引物為5′-GAAGAACCAAGCCGAAACCAT-3′，反向引物為5′-?AGGCTCTGAACCTTATGCTCA-3′；CTSD正向引物為5′-TGCAAAGGCCGACGAGATT-3′，反向引物為5′-GGTCTCCGCCTCTCTCTGAG-3′；以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，正向引物為5′-TGCTCAAGAACTACATGGACGC-3′ ，反向引物為5′-CGAAGACGACTGTGAAGCACT-3′。反應(yīng)體系包括cDNA 2 μL，正反向引物2 μL和SYBR Premix 10 μL，雙蒸水6 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，62 ℃ 5 s，70 ℃ 10 s，重復(fù)40個循環(huán)。PBMC中CUX1、CTSD的相對表達(dá)量采用2－ΔΔCT法表示。

1.4?統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。定量資料經(jīng)K-S正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，3組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。定性資料以例數(shù)、百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Pearson相關(guān)分析法分析指標(biāo)之間的相關(guān)性。多因素Logistic回歸分析影響AMI病人MACE發(fā)生的因素。采用受試者工作特征（ROC）曲線分析CUX1、CTSD對AMI病人MACE發(fā)生的診斷效能。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2?結(jié)?果

2.1?3組PBMC中CUX1、CTSD表達(dá)比較

與對照組比較，預(yù)后良好組及預(yù)后不良組PBMC中CUX1、CTSD表達(dá)明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與預(yù)后良好組比較，預(yù)后不良組AMI病人PBMC中CUX1、CTSD表達(dá)明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表1。

2.2?不同預(yù)后AMI病人一般資料、臨床生化指標(biāo)及心功能指標(biāo)比較

預(yù)后良好組與預(yù)后不良組AMI病人年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)、吸煙史、高血壓史、糖尿病史、三酰甘油、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇及CK-MB比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與預(yù)后良好組比較，預(yù)后不良組hs-cTnT、NT-proBNP水平明顯升高，LVEF、LVFS及CO明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表2。

2.3?AMI病人PBMC中CUX1、CTSD表達(dá)與臨床生化指標(biāo)及心功能指標(biāo)的相關(guān)性

AMI病人PBMC中CUX1、CTSD表達(dá)與hs-cTnT、NT-proBNP呈正相關(guān)，與LVEF、LVFS及CO呈負(fù)相關(guān)，與CK-MB無明顯相關(guān)性。詳見表3。

以AMI病人是否發(fā)生MACE為因變量（發(fā)生MACE＝1，未發(fā)生MACE＝0），將hs-cTnT、NT-proBNP、LVEF、LVFS、CO、CUX1及CTSD作為自變量，進行多因素Logistic回歸分析。結(jié)果顯示：hs-cTnT升高、LVEF降低、CUX1升高及CTSD升高是AMI病人MACE發(fā)生的獨立危險因素（P＜0.05）。詳見表4。

2.5?AMI病人PBMC中CUX1、CTSD表達(dá)對MACE的預(yù)測價值

ROC曲線顯示，PBMC中CUX1、CTSD及二者聯(lián)合檢測預(yù)測AMI病人MACE的曲線下面積（AUC）分別為0.776（0.705，0.846）、0.874（0.827，0.921）及0.910（0.879，0.941）。二者聯(lián)合檢測預(yù)測AMI病人MACE的AUC顯著高于單一指標(biāo)（Z值分別為4.186，3.469，P均＜0.001）。詳見表5、圖1。

3?討?論

早期識別具有較高MACE風(fēng)險的AMI病人是改善病人臨床預(yù)后的有效策略。近年來，有學(xué)者報道，檢測外周血血小板、缺血修飾白蛋白

等有助于判斷AMI后心力衰竭等MACE的發(fā)生［9-10］。但目前臨床尚無有效的早期生物標(biāo)志物用于預(yù)測AMI病人的臨床預(yù)后。PBMC的主要細(xì)胞成分為單核細(xì)胞，是AMI后心臟重塑的重要調(diào)節(jié)因子［11］。研究表明，在心肌損傷后數(shù)小時以內(nèi)，單核細(xì)胞能夠迅速從骨髓和脾臟轉(zhuǎn)移到外周血中并浸潤心肌梗死區(qū)域，參與炎癥反應(yīng)，雖然單核細(xì)胞有利于促進新生血管生成，但單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞能夠激活心肌細(xì)胞心臟重塑相關(guān)基因的表達(dá)，引起心臟重塑［12］，還可加重斑塊負(fù)荷，降低斑塊穩(wěn)定性。因此，通過檢測PBMC中基因表達(dá)可能有助于早期識別MACE風(fēng)險較高的AMI病人，并作為新的判斷AMI病人預(yù)后的生物標(biāo)志物。

CUX1作為一種轉(zhuǎn)錄因子，具有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，能夠促進DNA糖基化酶-1的表達(dá)。研究表明，CUX1的表達(dá)缺失會導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷修復(fù)延遲并增強輻射敏感性，在腫瘤中發(fā)揮腫瘤抑制因子的作用［13］。研究發(fā)現(xiàn)，CUX1表達(dá)異常下調(diào)抑制心肌細(xì)胞分化過程，與先天性心臟病埃博斯坦畸形的發(fā)生有關(guān)［14］。近年來，有學(xué)者利用高通量二代測序發(fā)現(xiàn)，CUX1在AMI繼發(fā)心力衰竭病人PBMC中表達(dá)明顯升高，可能是一種新的提示AMI病人預(yù)后的生物標(biāo)志物［3］。本研究發(fā)現(xiàn)，AMI病人PBMC中CUX1表達(dá)明顯升高，并且其表達(dá)水平與心肌損傷指標(biāo)hs-cTnT、NT-proBNP呈正相關(guān)，與心功能指標(biāo)LVEF、LVFS及CO呈負(fù)相關(guān)，提示CUX1表達(dá)升高可能加重AMI心肌損傷，降低病人心功能。分析其原因，與CUX1對炎癥微環(huán)境的調(diào)節(jié)有關(guān)。研究表明，CUX1的表達(dá)能夠通過結(jié)合IκBζ，促進巨噬細(xì)胞中腫瘤壞死因子和白細(xì)胞介素17A等細(xì)胞因子及趨化因子如趨化因子配體1（CXCL1）、趨化因子配體2（CXCL2）等的表達(dá)，招募中性粒細(xì)胞及單核巨噬細(xì)胞的募集，促進局部組織的炎癥損傷反應(yīng)，并激活基質(zhì)成纖維細(xì)胞，促進心肌重塑［14］。本研究中，CUX1升高是AMI病人MACE發(fā)生的獨立危險因素，提示檢測CUX1有助于預(yù)測AMI病人不良心血管事件的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，CUX1的表達(dá)上調(diào)能夠激活Jacus相關(guān)激酶2/信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3通路，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大［15］。因此，PBMC中CUX1的表達(dá)升高可通過加重AMI病人的心肌損害，降低斑塊穩(wěn)定性，導(dǎo)致AMI后缺血事件和再梗死事件的發(fā)生。

CTSD編碼蛋白是一種溶酶體天冬氨酰蛋白酶，參與蛋白質(zhì)的代謝分解。CTSD不僅參與生長因子、激素和酶前體的激活、抗原的加工和細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)等多種生理過程，還參與包括動脈粥樣硬化、癌癥、心血管疾病等的發(fā)生過程［16-17］。本研究結(jié)果顯示，AMI病人PBMC中CTSD表達(dá)明顯升高。分析其原因，AMI發(fā)生后單核/巨噬細(xì)胞聚集到動脈粥樣硬化斑塊區(qū)域，在氧化的低密度脂蛋白或7β-羥基膽固醇作用下，巨噬細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡，同時氧化的脂質(zhì)會導(dǎo)致溶酶體不穩(wěn)定，溶酶體酶CTSD滲漏到細(xì)胞質(zhì)中，引起CTSD表達(dá)水平明顯增加［18］。本研究中，CTSD的表達(dá)與hs-cTnT、NT-proBNP呈正相關(guān)，與LVEF、LVFS及CO呈負(fù)相關(guān)，提示CTSD的表達(dá)與AMI的疾病嚴(yán)重程度有關(guān)。研究表明，缺血再灌注損傷后心肌細(xì)胞CTSD表達(dá)升高，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞自噬的發(fā)生，細(xì)胞內(nèi)磷脂酰肌醇3激酶/自噬基因BeclinⅠ途徑顯著激活，加重心肌細(xì)胞的損傷和心肌重塑，促進AMI的進展［19-20］。本研究結(jié)果顯示，CTSD升高是AMI病人MACE發(fā)生的獨立危險因素，表明CTSD有助于預(yù)測AMI病人不良心血管事件的發(fā)生。其原因一方面是CTSD可通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡，進而增加動脈粥樣硬化斑塊易損性［18］；另一方面，CTSD表達(dá)水平升高能夠直接降解纖維帽的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白成分，增加AMI病人再次發(fā)生急性冠脈綜合征的風(fēng)險［21］。

本研究進一步利用ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，PBMC中CUX1、CTSD及二者聯(lián)合檢測預(yù)測AMI病人MACE發(fā)生的AUC顯著高于單一指標(biāo)，二者聯(lián)合診斷的敏感度和特異度分別為0.831，0.802。表明二者聯(lián)合檢測對AMI病人MACE具有較高的預(yù)測價值，可能是新的預(yù)后判斷的生物標(biāo)志物。臨床醫(yī)師可根據(jù)PBMC中CUX1、CTSD水平，對AMI病人的預(yù)后進行評估，以采取相應(yīng)的診治措施，改善AMI病人的臨床預(yù)后。

綜上所述， AMI病人PBMC中CUX1、CTSD表達(dá)升高，兩者表達(dá)與心肌損傷指標(biāo)hs-cTnT、NT-proBNP呈正相關(guān)，與心功能指標(biāo)LVEF、LVFS及CO呈負(fù)相關(guān)，是AMI病人MACE預(yù)后的獨立危險因素。CUX1、CTSD聯(lián)合檢測對AMI病人MACE具有較高的診斷效能。但由于本研究樣本量有限，未能對AMI病人進行分層分析，有待今后設(shè)計多中心的臨床試驗擴大樣本量，深入評估CUX1、CTSD在AMI診斷及預(yù)后評估中的臨床應(yīng)用價值。

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（收稿日期：2022-08-26）

（本文編輯王麗）