急性心肌梗死患者內(nèi)臟素mRNA基因表達(dá)及臨床相關(guān)性的研究

何皓+黃海峰+符福強(qiáng)+李筱敏+徐曉云

【摘要】 目的：探討急性心肌梗死患者內(nèi)臟素基因在脂肪組織中表達(dá)情況，以及內(nèi)臟素mRNA基因表達(dá)與患者臨床相關(guān)性研究，為急性心肌梗死患者防治提供新的方法。方法：根據(jù)臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)將80例急性心肌梗死患者作為急性心肌梗死組，將100例正常人作為對(duì)照組。用RT-PCR方法檢測(cè)內(nèi)臟素mRNA的水平和基因的表達(dá)水平，并同時(shí)收集比較兩組的臨床檢查數(shù)據(jù)指標(biāo)。結(jié)果：急性心肌梗死患者組的血清內(nèi)臟素濃度及脂肪組織中的內(nèi)臟素mRNA基因表達(dá)均高于對(duì)照組（P<0.05）。急性心肌梗死患者脂肪組織的mRNA的表達(dá)量與WHR、膽固醇、甘油三酯均呈正相關(guān)性（P<0.05）。急性心肌梗死患者內(nèi)臟素的量與機(jī)體臨床的甘油三酯、膽固醇、LDL-C均呈正相關(guān)性（P<0.05）。結(jié)論：急性心肌梗死患者中內(nèi)臟素基因與濃度表達(dá)增高，可能是急性心肌梗死的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

【關(guān)鍵詞】 急性心肌梗死； 內(nèi)臟素； mRNA基因表達(dá)； 脂肪組織

【Abstract】 Objective：To investigate the expression of mRNA gene in the adipose tissue of patients with acute myocardial infarction，and to provide a new method for the prevention and treatment of patients with acute myocardial infarction.Method：According to the criteria of clinical diagnosis，80 patients with acute myocardial infarction were enrolled as acute myocardial infarction group， and 100 normal people were served as control group.RT-PCR method was used to detect the level of mRNA and the expression level of gene，and the clinical data of the two groups were collected and compared.Result：The plasma visfatin level and the quantitaitive of visfatin mRNA expression adipose tissues of acute myocardial infarction of patients were significantly higher than those in control group（P<0.05）.The expression of mRNA in adipose tissue of patients with acute myocardial infarction was positively correlated with WHR，TG，TC（P<0.05）. The amount of internal organs in patients with acute myocardial infarction was positively correlated with the clinical TG，TC，and LDL-C（P<0.05）.Conclusion：In patients with acute myocardial infarction， the increased expression of the internal organs and the concentration of the internal organs may be an independent risk factor for acute myocardial infarction.

【Key words】 Acute myocardial infarction； Visfatin； mRNA expression； Adipose tissues

First-authors address：Nanhai Hospital of the Southern Medical University，F(xiàn)oshan 528200，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.30.003

急性心肌梗死屬于急性冠脈綜合征一種類(lèi)型，急性心肌梗死有急性ST段抬高性心肌梗死和急性非ST段抬高性心肌梗死，臨床上發(fā)病急、死亡率高，而心肌梗死發(fā)病證明與許多的機(jī)體內(nèi)細(xì)胞因子有關(guān)，內(nèi)臟素就是其中的一種，日本學(xué)者Fukuhara在2005年研究中發(fā)現(xiàn)了它，許多的研究證明內(nèi)臟素來(lái)源機(jī)體內(nèi)各種脂肪組織，不同的是有的人認(rèn)為來(lái)源腹部脂肪，有的人認(rèn)為來(lái)源內(nèi)臟脂肪。歐美的科學(xué)家研究證明內(nèi)臟素作為一種脂肪分泌細(xì)胞因子，是一種能夠降低機(jī)體中血管血液血糖值的擬胰島素活性的物質(zhì)，同時(shí)也能促進(jìn)機(jī)體體內(nèi)的各種脂肪組織的合成與聚集，尤其與腹部脂肪的分布關(guān)系密切，后來(lái)的研究同時(shí)也證明內(nèi)臟素合成與分泌同機(jī)體體內(nèi)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)有關(guān)，所以認(rèn)為其可能參與心肌梗死患者的心臟冠狀動(dòng)脈的炎癥反應(yīng)，推斷可能和急性心肌梗死患者發(fā)生和發(fā)展有關(guān)[1]。目前該方向的研究在國(guó)內(nèi)國(guó)外不多，且爭(zhēng)議太多，但是內(nèi)臟素是如何造成急性梗死患者的冠脈血管炎癥反應(yīng)，仍需要更多的研究和實(shí)驗(yàn)去證明。本研究通過(guò)測(cè)定急性心肌梗死患者內(nèi)臟素的血清水平及基因表達(dá)，來(lái)分析急性心肌梗死患者發(fā)生與發(fā)展是否與患者的脂肪組織分泌的內(nèi)臟素存在某種必然的聯(lián)系[2]。筆者大膽假設(shè)：內(nèi)臟素可以造成急性心肌梗死發(fā)生，針對(duì)內(nèi)臟素的控制則有可能成為急性心肌梗死患者的預(yù)防及治療的新靶點(diǎn)，從而減少一部分急性梗死患者發(fā)生?，F(xiàn)階段，國(guó)內(nèi)外研究這方面的不多，尤其在急性心肌梗死方面研究是空白。所以本課題組第一次在進(jìn)行內(nèi)臟素基因在中國(guó)漢族人群分布研究，分析急性心肌梗死患者內(nèi)臟素在機(jī)體的表達(dá)研究，以及與臨床檢查結(jié)果等相關(guān)性研究，來(lái)為急性心肌梗死患者提供一種可能的新的預(yù)防及治療方法，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年1月-2015年4月在南方醫(yī)科大學(xué)南海醫(yī)院腹外科100例膽石癥患者作為對(duì)照組，排除一切臨床心腦血管病患者；另選取2013年12月-2015年4月在廣東省人民醫(yī)院及南方醫(yī)科大學(xué)南海醫(yī)院急性心肌梗死患者80例作為急性心肌梗死組，患者均經(jīng)心肌酶三項(xiàng)、肌鈣蛋白、心電圖、動(dòng)態(tài)心電圖及冠狀動(dòng)脈造影的結(jié)果確診。排除惡性腫瘤、血液病、各種急慢性炎癥期、各種急慢性心、腦血管病及其他相關(guān)的內(nèi)分泌疾病。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本留取 急性心肌梗死的患者急診抽取靜脈血5 mL，膽石癥患者在術(shù)晨抽取空腹靜脈血5 mL，在醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室高速離心機(jī)中分離研究對(duì)象的血清，分離出來(lái)的血清標(biāo)本立即送檢驗(yàn)科予FINS、血糖、FBG、甘油三酯、膽固醇、游離脂肪酸等基本臨床指標(biāo)測(cè)定，另一管保存在南方醫(yī)科大學(xué)南海醫(yī)院-80 ℃專(zhuān)用試驗(yàn)冰箱內(nèi)，并分批次送廣東省人民醫(yī)院分子生物試驗(yàn)室測(cè)內(nèi)臟素mRNA的水平。急性心肌梗死患者在股動(dòng)脈穿刺時(shí)取腹部脂肪或冠脈搭橋時(shí)取脂肪組織液氮迅速凍存，對(duì)照組膽石癥患者手術(shù)時(shí)取皮下脂肪或大網(wǎng)膜脂肪液氮迅速凍存，用于研究?jī)?nèi)臟素RNA提取。

1.2.2 RNA提取 用通用的TRIZOL法提取，在實(shí)驗(yàn)室用紫外發(fā)光光度計(jì)測(cè)定內(nèi)臟素RNA濃度和含量。

1.2.3 內(nèi)臟素基因的mRNA表達(dá)水平檢測(cè)步驟 （1）研究對(duì)象內(nèi)臟素基因引物的設(shè)計(jì)與合成：研究采用半定量RT-PCR方法擴(kuò)增目的基因，實(shí)驗(yàn)對(duì)照內(nèi)參照肌動(dòng)蛋白基因（β-actin）。然后在PUBMED上以Genebank基因庫(kù)上發(fā)布的人內(nèi)臟素基因與β-actin基因的作為序列，利用國(guó)際通用的引物軟件（Primer-5）設(shè)計(jì)引物。筆者得出的β-actin的兩條基因擴(kuò)增引物基因序列分別為5-CAGCACTGTGTT GGCGTACA-3及5-GCTATCCAGGCTGTGCTATC-3，擴(kuò)增后基因產(chǎn)物的長(zhǎng)度為495 bp。而另一個(gè)Visfatin基因的擴(kuò)增引物為5-TTACATACA CACAAC ACACACCC-3，5-GCCGATTATCTTTACATAGGACG-3，基因擴(kuò)增后產(chǎn)物為片斷228 bp基因片段。（2）第二階段，研究對(duì)象目的基因cDNA的合成：采用PROMEGA公司生產(chǎn)的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將特定目的的RNA逆轉(zhuǎn)錄合成，形成研究對(duì)象目的基因的cDNA。（3）第三階段，采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）合成所需要的研究需要的第二條鏈，聚合酶鏈的反應(yīng)體系物質(zhì)如下：dNTP 2 μL（2.5 mmol/L）及β-actin基因上、下游引物各1.0 μL、Visfatin基因上下游引物各1.0 μL、

10×緩沖液Buffer（含氯化鎂）5 μL、Taq酶

0.5 μL（2.5 U）、目的cDNA 2 μL、ddH2O 36.5 μL。研究的PCR的熱循環(huán)條件及參數(shù)：首先預(yù)變性1 min（在94 ℃高溫），反應(yīng)物質(zhì)變性30 s（在94 ℃高溫），變性后產(chǎn)物退火30 s（54 ℃），在72 ℃溫度時(shí)產(chǎn)物再延伸1 min，反復(fù)重復(fù)上述的循環(huán)，30次后，最后一次循環(huán)后在72 ℃徹底延伸時(shí)間為4 min，最后完成產(chǎn)物的PCR。（4）筆者把所得PCR的產(chǎn)物，放在自制的2%瓊脂的糖凝膠電泳平板上進(jìn)行PCR產(chǎn)物的電泳，電泳后結(jié)果最后放在美國(guó)gene電泳凝膠成像機(jī)器上觀察，并用數(shù)碼照相機(jī)把觀察的結(jié)果的圖像進(jìn)行攝像，并保存原始數(shù)據(jù)，筆者采用標(biāo)準(zhǔn)β-actinDNA條帶灰度及內(nèi)臟素DNA條帶灰度對(duì)比計(jì)算[6]。（5）所有試驗(yàn)對(duì)象的血清內(nèi)臟素的測(cè)定采用美國(guó)專(zhuān)用內(nèi)臟素專(zhuān)用試劑盒，在實(shí)驗(yàn)室專(zhuān)人化學(xué)發(fā)光法測(cè)定。FINS、血糖、FBG、甘油三酯、膽固醇、游離脂肪酸等各種臨床數(shù)據(jù)生化指標(biāo)測(cè)定采用放免法測(cè)定得出。（6）血清內(nèi)臟素的測(cè)定，采用美國(guó)試劑盒，化學(xué)發(fā)光法測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗(yàn)，臨床相關(guān)性的數(shù)據(jù)與急性心肌梗死的相關(guān)系分析采用多元回歸相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組的臨床及實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)比較 急性心肌梗死患者組的機(jī)體內(nèi)的內(nèi)臟素濃度、胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）、體重指數(shù)、血清甘油三酯、血清膽固醇、LDL-C、FFA（游離脂肪酸）均高于正常手術(shù)的對(duì)照組（P<0.05）；而急性心肌梗死與正常手術(shù)對(duì)照組的年齡、性別、血壓、高密度脂蛋白、FINS比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表1。

2.2 兩組內(nèi)臟素脂肪組織中的分泌的內(nèi)臟素RT-PCR的量比較 急性心肌梗死患者脂肪組織的RT-PCR的內(nèi)臟素mRNA的表達(dá)量為0.713±0.041，明顯高于對(duì)照組內(nèi)臟素mRNA的表達(dá)量為0.532±0.036，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

2.3 急性心肌梗死患者脂肪組織的mRNA的表達(dá)量及內(nèi)臟素的濃度多元回歸相關(guān)性分析 急性心肌梗死患者內(nèi)臟素的量與機(jī)體臨床的甘油三酯、膽固醇、LDL-C等血脂指標(biāo)均呈正相關(guān)性（OR=1.53、1.43、1.36，P<0.05），而與一般的臨床年齡、性別、血壓、FINS、HDL-C、HOMA-IR無(wú)相關(guān)性（OR=0.9，P>0.05）。急性心肌梗死患者脂肪組織的mRNA的表達(dá)量與WHR、膽固醇、甘油三酯呈正相關(guān)性（OR=1.57、1.33、1.52，P<0.05）。急性心肌梗死患者脂肪組織的mRNA的表達(dá)量與HDL-C、LDL-C無(wú)明顯的相關(guān)性（OR=0.9，P>0.05）。

3 討論

改革開(kāi)放以來(lái)，急性心肌梗死已成為影響人類(lèi)生活質(zhì)量的一類(lèi)常見(jiàn)病、多發(fā)病，同時(shí)，伴隨著相關(guān)的疾病如肥胖和糖尿病代謝類(lèi)疾病的增加，心血管的危重癥發(fā)病也大大的升高。研究證明許多的細(xì)胞因子參與心肌梗死的形成，內(nèi)臟素就是其中一種。內(nèi)臟素由日本的學(xué)者發(fā)現(xiàn)的，主要是由人體體內(nèi)及動(dòng)物脂肪組織所分泌出來(lái)的具有許多生物活性的脂肪細(xì)胞因子，以前的許多研究證明其的分泌與生物活性與機(jī)體內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)有著密切的關(guān)系[1-4]。眾所周知，急性心肌梗死在許多的研究中也證明其與心臟冠狀動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)及不穩(wěn)定斑塊的形成有關(guān)，因此筆者推斷其內(nèi)臟素的分泌及水平可能和急性心肌梗死患者的發(fā)病有關(guān)[5-7]。目前在國(guó)內(nèi)外研究中關(guān)于這方面的論述不多，內(nèi)臟素雖然具有多種機(jī)體上的生物學(xué)效應(yīng)，但是其在一系列代謝疾病中病理作用的生理機(jī)制研究不是十分清楚，這方面的研究也不多。本研究擬通過(guò)分析急性心肌梗死患者的內(nèi)臟素基因表達(dá)水平，來(lái)分析其與臨床各項(xiàng)指標(biāo)的關(guān)系及可能存在的機(jī)制，揭示急性心肌梗死患者發(fā)生與發(fā)展是否與機(jī)體內(nèi)內(nèi)臟素的基因及分泌水平存在一定的關(guān)系。

日本的Fukuhara等科學(xué)家在實(shí)驗(yàn)的同時(shí)也發(fā)現(xiàn)機(jī)體血清內(nèi)臟素的量越高，機(jī)體的內(nèi)臟脂肪細(xì)胞就越豐富，但是卻與機(jī)體皮下脂肪組織變化不大，而相反的是科學(xué)家Arike的研究卻證明越是肥胖的人，機(jī)體內(nèi)臟脂肪內(nèi)內(nèi)臟素的表達(dá)量相應(yīng)的增多，證明它與肥胖是一定的相關(guān)性的[8-9]，而相矛盾的是科學(xué)家Hammarstedt等[10]卻在最近的研究沒(méi)有發(fā)現(xiàn)內(nèi)臟素在體內(nèi)脂肪組織中表達(dá)增多的現(xiàn)象，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)它們之間有什么關(guān)系，為什么會(huì)有如此相互矛盾的地方，本文的研究結(jié)果是在急性心肌梗死組中脂肪組織的mRNA的表達(dá)量明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），急性心肌梗死患者內(nèi)臟素的濃度與年齡、性別、血壓、FINS、HDL-C、HOMA-IR無(wú)關(guān)，與臨床上血脂數(shù)據(jù)如膽固醇、甘油三酯、LDL-C呈正相關(guān)性。同時(shí)急性心肌梗死患者檢測(cè)出來(lái)的內(nèi)臟素mRNA的RT-PCR數(shù)值與WHR、膽固醇、甘油三酯呈正相關(guān)性，而臨床血脂的另兩個(gè)指標(biāo)HDL-C、LDL-C與急性梗死組大網(wǎng)膜脂肪組織的mRNA的表達(dá)量卻沒(méi)有明顯的相關(guān)性。所以筆者發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)中急性心肌梗死患者血清中內(nèi)臟素的濃度高于正常對(duì)照組，以及發(fā)現(xiàn)急性心肌梗死患者內(nèi)臟素mRNA的RT-PCR數(shù)值也同樣升高，本文的研究結(jié)果與2014年河北醫(yī)學(xué)發(fā)表冠心病的內(nèi)臟素的研究有相似結(jié)論，但是測(cè)重點(diǎn)又不相同。不同的是他們研究對(duì)象是一般的冠心病，相對(duì)病情輕[11]，而本文研究的是急性ST段抬高型和非ST段抬高型心肌梗死患者，一般都有心肌酶學(xué)的升高，但是由于他們選擇的冠心病標(biāo)本比較容易收集，收集數(shù)據(jù)大大多于本文，所以和本文的試驗(yàn)還是有很大的不同。為什么會(huì)出現(xiàn)這樣的結(jié)果，筆者分析分泌出來(lái)的內(nèi)臟素可能在血管內(nèi)發(fā)揮其生物活性，它不僅能像胰島素一樣通過(guò)發(fā)揮作用來(lái)降低機(jī)體血糖，還可以在機(jī)體內(nèi)促進(jìn)不同部位器官血管脂肪的合成與聚集，在血管壁促進(jìn)吞噬細(xì)胞形成泡沫細(xì)胞，泡沫細(xì)胞和血小板及一些炎癥細(xì)胞構(gòu)成血管壁粥樣硬化及脂質(zhì)斑塊的形成，一些不穩(wěn)定的斑塊在特殊情況下容易脫落下來(lái)形成急性心肌梗死，造成血管的阻塞。同時(shí)內(nèi)臟素能直接作用機(jī)體組織血管的血管內(nèi)皮細(xì)胞，通過(guò)分子通路引起血管內(nèi)的內(nèi)皮細(xì)胞各種功能代謝出現(xiàn)障礙，血管內(nèi)皮細(xì)胞的不斷損傷而出現(xiàn)血管的狹窄，上述的種種細(xì)胞及組織的破壞及修復(fù)最終成為急性心肌梗死患者的發(fā)生和發(fā)展的啟動(dòng)因素及決定的因素[12-13]。

綜上所述，本文研究證明，內(nèi)臟素在急性心肌梗死患者起病中及疾病的發(fā)展中有著十分重要的角色。這也許為日后急性心肌梗死患者的預(yù)防和治療有一個(gè)新的方法，一個(gè)新的突破點(diǎn)。同樣如何利用急性心肌梗死患者的內(nèi)臟素基因來(lái)控制機(jī)體內(nèi)臟素的分泌，以及分泌出來(lái)的內(nèi)臟素在機(jī)體內(nèi)如何作用于血管的內(nèi)皮細(xì)胞，從而對(duì)冠脈的血管造成損傷，這些機(jī)制都在急性心肌梗死疾病的發(fā)生和發(fā)展起一定的作用，甚至可以推斷控制內(nèi)臟素分泌也許在早期預(yù)防急性心肌梗死患者能夠起到十分重要的作用。但是如何去控制內(nèi)臟素病理作用的這方面研究不多，這需要進(jìn)行下一步的研究探討，以發(fā)現(xiàn)更好的辦法減少急性心肌梗死事件的發(fā)生。

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（收稿日期：2016-06-27） （本文編輯：郎威）