miR-23a-3p、ZNF395水平與妊娠期高血壓病人胎兒生長受限的關(guān)系

朱麗 劉麗芳

基金項(xiàng)目?深圳市寶安區(qū)科技計(jì)劃基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（No.20200514112429001）

作者單位?1.深圳市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院（廣東深圳 ?518000），E-mail：a13712296366@126.com；2.贛南醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院

引用信息?朱麗，劉麗芳.miR-23a-3p、ZNF395水平與妊娠期高血壓病人胎兒生長受限的關(guān)系［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2024，22（7）：1306-1309.

摘要?目的：探討妊娠期高血壓病人胎盤組織微小RNA-23a-3p（miR-23a-3p）、鋅指蛋白395（ZNF395）水平與胎兒生長受限的關(guān)系。方法：選取120例妊娠期高血壓病人作為研究對象，根據(jù)孕期胎兒生長狀況將其分為正常對照組（95例）和胎兒生長受限組（25例）。采用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）法檢測胎盤組織中miR-23a-3p表達(dá)水平，免疫組化法檢測ZNF395蛋白表達(dá)水平，收集新生兒體重、胎盤重量等一般資料；采用Pearson法及Spearman法分析胎兒生長受限病人胎盤組織miR-23a-3p、ZNF395水平與新生兒體重、胎盤重量的相關(guān)性；采用單因素及多因素Logistic回歸分析胎兒生長受限的影響因素。結(jié)果：胎兒生長受限組胎盤組織ZNF395蛋白陽性率、新生兒體重、胎盤重量低于正常對照組，miR-23a-3p水平高于正常對照組（P＜0.05）。胎兒生長受限病人胎盤組織miR-23a-3p與ZNF395水平呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；新生兒體重、胎盤重量與miR-23a-3p呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與ZNF395呈正相關(guān)（P＜0.05）。miR-23a-3p是胎兒生長受限的獨(dú)立危險因素（P＜0.05），ZNF395是胎兒生長受限的保護(hù)因素（P＜0.05）。結(jié)論：胎兒生長受限病人胎盤組織中miR-23a-3p高表達(dá)，ZNF395低表達(dá)，miR-23a-3p可能通過下調(diào)ZNF395表達(dá)影響胎兒生長發(fā)育。

關(guān)鍵詞?妊娠期高血壓；胎盤組織；胎兒生長受限；微小RNA-23a-3p；鋅指蛋白395

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.07.027

胎兒生長受限是產(chǎn)科常見妊娠合并癥之一，指胎兒在母體內(nèi)因各種因素導(dǎo)致其生長受到限制而未能到達(dá)其應(yīng)表現(xiàn)出的生長速率，從而使胎兒致殘率和病死率增高，甚至?xí)黾犹撼赡旰蟮幕疾÷剩?］。妊娠期高血壓孕產(chǎn)婦易合并胎兒生長受限，故近年來已引起高度關(guān)注［2］。滋養(yǎng)細(xì)胞侵入異常、胎盤血供異常均是影響胎兒生長發(fā)育的因素［3］。微小RNA-23a-3p（miR-23a-3p）參與細(xì)胞發(fā)育的各個階段，其中包括增殖、侵襲、遷移、凋亡［4］。鋅指蛋白395（zinc finger protein 395，ZNF395）可參與腫瘤進(jìn)展，且有研究表明ZNF395與胎兒生長發(fā)育有關(guān)［5-6］。本研究前期通過生物信息學(xué)預(yù)測網(wǎng)站miRDB（http：//mirdb.org/cgi-bin/search.cgi）預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR-23a-3p與ZNF395存在靶向結(jié)合位點(diǎn)。推測miR-23a-3p可能通過靶向ZNF395調(diào)控胎兒生長發(fā)育。因此，本研究主要探討妊娠期高血壓病人胎盤組織miR-23a-3p、ZNF395水平與胎兒生長受限的關(guān)系，以期為胎兒生長受限提供基因修飾靶點(diǎn)。

1?對象與方法

1.1?一般資料

選取我院2020年6月—2022年6月收治的120例妊娠期高血壓病人作為研究對象，年齡25～33（29.06±3.46）歲。根據(jù)胎兒生長狀況將孕婦分為正常對照組（95例）和胎兒生長受限組（25例）。納入標(biāo)準(zhǔn)：1）符合妊娠期高血壓診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］，胎兒生長受限組符合胎兒生長受限診斷標(biāo)準(zhǔn)（新生兒體重不足同期新生兒體重平均值的90%或足月分娩新生兒體重低于2.5 kg）［8］，正常對照組以《婦產(chǎn)科學(xué)》相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)為參考（足月新生兒體重＞2.5 kg且＜4.0 kg）；2）孕周≥37周；3）病歷資料齊全；4）均為單胎頭位妊娠。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）胎兒伴有宮內(nèi)感染性疾病或先天性心臟病等疾??；2）孕婦妊娠期間存在飲酒及吸煙史，或依從性較差者；3）孕婦妊娠期間合并前置胎盤、膽汁淤積等其他妊娠內(nèi)科合并癥。本研究經(jīng)我院臨床研究倫理委員會批準(zhǔn)，符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，病人知情同意并簽署知情同意書。

1.2?主要試劑與儀器

免疫組化試劑盒（貨號：YDDEF001）購自上海羽哚生物科技有限公司；ZNF395抗體（貨號：340163.000）購自艾美捷科技有限公司；RNA提取試劑盒（貨號：R1200-100）購自北京索萊寶科技有限公司；qPCR SYBR Green Master Mix（貨號：YB11201ES03）購自上海鈺博生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號：YT9036）購自北京伊塔生物科技有限公司；實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）儀（型號：CFX384）購自美國Bio-Rad公司。

1.3?研究方法

1.3.1?樣品采集及保存

采集受試者新鮮胎盤，無菌操作取胎盤滋養(yǎng)層組織1 cm×1 cm×1 cm（臍帶附著處至胎盤另一面中央?yún)^(qū)1/2處），放入經(jīng)焦炭酸二乙酯處理的冷凍管中，保存待測。

1.3.2?miR-23a-3p表達(dá)水平測定

采用RNA提取試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒提取胎盤組織總RNA后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。采用qRT-PCR儀對miR-23a-3p及其內(nèi)參進(jìn)行擴(kuò)增，引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表1。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)。qRT-PCR反應(yīng)體系：cDNA（50 ng/μL）2 μL，正反向引物（10 μmol/L）各0.8 μL，qPCR SYBR Green Master Mix 10 μL，雙蒸水（ddH2O）6.4 μL。每份樣品均設(shè)3個重復(fù)孔，采用2－△△CT法計(jì)算胎盤組織miR-23a-3p相對表達(dá)量。

1.3.3?ZNF395蛋白水平測定

將胎盤組織標(biāo)本采用4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、連續(xù)切片，采用免疫組織化學(xué)法檢測胎盤組織ZNF395蛋白表達(dá)水平，具體染色方法按照通用免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行操作。隨機(jī)選5個高倍鏡視野觀察（計(jì)數(shù)200個細(xì)胞），由2名高年資的病理醫(yī)師采用半定量法進(jìn)行評分，按陽性細(xì)胞比例計(jì)分，陽性細(xì)胞比例0～＜26%計(jì)1分，26%～＜51%計(jì)2分，51%～75%計(jì)3分，＞75%計(jì)4分；按染色強(qiáng)度計(jì)分：棕褐色計(jì)3分，棕黃色計(jì)2分，淺黃色計(jì)1分，無色計(jì)0分。2次評分乘積≤2分為陰性表達(dá)，＞2分為陽性表達(dá)。

1.4?統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。定量資料符合正態(tài)分布，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較行t檢驗(yàn)；定性資料采用例數(shù)、百分比（%）表示，組間比較行χ2檢驗(yàn)；采用Pearson法及Spearman法分析胎兒生長受限病人胎盤組織miR-23a-3p、ZNF395水平與新生兒體重、胎盤重量的相關(guān)性；采用單因素及多因素Logistic回歸分析法分析胎兒生長受限的影響因素。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2?結(jié)?果

2.1?兩組臨床資料比較

兩組孕婦年齡、孕前體質(zhì)指數(shù)（BMI）、孕中期BMI增加、孕周、分娩史、新生兒性別、孕期羊水量異常情況比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表2。

2.2?兩組新生兒體重及胎盤重量比較

胎兒生長受限組新生兒體重、胎盤重量低于正常對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表3。

2.3?兩組胎盤組織miR-23a-3p、ZNF395蛋白水平比較

胎兒生長受限組胎盤組織miR-23a-3p水平高于正常對照組，ZNF395蛋白陽性率低于正常對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表4。

2.4?胎兒生長受限病人胎盤組織中miR-23a-3p、ZNF395水平與新生兒體重、胎盤重量的相關(guān)性

相關(guān)分析結(jié)果顯示，胎兒生長受限病人胎盤組織miR-23a-3p與ZNF395水平呈負(fù)相關(guān)（r＝－0.582，P＜0.05）；新生兒體重、胎盤重量與miR-23a-3p呈負(fù)相關(guān)（r值分別為－0.504，－0.527，P均＜0.05），與ZNF395 呈正相關(guān)（r值分別為0.489，0.513，P均＜0.05）。

2.5?胎兒生長受限影響因素的單因素及多因素Logistic回歸分析

以是否存在胎兒生長受限為因變量，以miR-23a-3p、ZNF395、年齡、孕前BMI、孕中期BMI增加、孕周、分娩史、新生兒性別、孕期羊水量異常為自變量，進(jìn)行單因素Logistic回歸分析，以單因素分析結(jié)果中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)miR-23a-3p、ZNF395、孕期羊水量異常為自變量，進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，miR-23a-3p是影響胎兒生長受限的獨(dú)立危險因素（P＜0.05），ZNF395是影響胎兒生長受限的保護(hù)因素（P＜0.05）。詳見表5、表6。

3?討?論

妊娠期高血壓是婦產(chǎn)科常見病和多發(fā)病，其病因尚未完全闡明，但重度妊娠期高血壓病人體內(nèi)小動脈存在痙攣的情況，會導(dǎo)致胎盤血流灌注不足進(jìn)而致使胎兒宮內(nèi)生長受限［9-10］。胎兒生長受限不僅對新生兒生長發(fā)育造成影響，還可能會對心血管及大腦等系統(tǒng)發(fā)育產(chǎn)生不利影響，增加孕產(chǎn)婦痛苦，嚴(yán)重影響優(yōu)生優(yōu)育，同時給家庭和社會帶來嚴(yán)重的醫(yī)療負(fù)擔(dān)［11-12］。因此，尋找相關(guān)基因修飾靶點(diǎn)，進(jìn)而及時采取個體化治療措施，可能是改善胎兒生長受限、降低疾病發(fā)生率的有效措施。

miRNA主要通過與靶基因特異性配對結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)性調(diào)控靶基因表達(dá)［13］。miR-23表達(dá)參與骨骼肌的發(fā)育［14］。miR-23a是miR-23的一種亞型，也是腫瘤研究中的明星分子，一般作為致癌基因促進(jìn)癌細(xì)胞生長、侵襲轉(zhuǎn)移［15-16］。ZNF395是鋅指蛋白家族的成員，是一個核質(zhì)穿梭轉(zhuǎn)錄因子，最初被鑒定為調(diào)控人乳頭狀瘤病毒的轉(zhuǎn)錄因子，參與細(xì)胞生長和凋亡［17-18］。根據(jù)胎兒生長受限診斷標(biāo)準(zhǔn)將本研究中120例妊娠期高血壓孕婦分為胎兒生長受限組和正常對照組，結(jié)果顯示，胎兒生長受限組胎盤組織miR-23a-3p水平高于正常對照組，ZNF395蛋白陽性率水平低于正常對照組，且miR-23a-3p是胎兒生長受限的獨(dú)立危險因素，ZNF395是胎兒生長受限的保護(hù)因素。ZNF395表達(dá)趨勢與曹文紅等［6］研究結(jié)果一致。提示胎盤組織中miR-23a-3p、ZNF395的表達(dá)差異可能與胎兒生長受限的發(fā)生具有一定的相關(guān)性，其機(jī)制可能為部分妊娠期高血壓病人血流高阻低排導(dǎo)致子宮有效灌注壓降低，內(nèi)皮細(xì)胞受損，miR-23a-3p表達(dá)量升高，miR-23a-3p在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)性調(diào)控靶基因ZNF395使其低表達(dá)，進(jìn)而影響滋養(yǎng)細(xì)胞的正常侵入和遷移，造成胚胎發(fā)育異常，最終影響胎兒生長發(fā)育，導(dǎo)致胎兒生長受限；亦或是miR-23a-3p通過抑制ZNF395表達(dá)，影響子宮血流動力學(xué)，影響胎盤血供，進(jìn)而影響胎兒生長。此外，相關(guān)性分析結(jié)果顯示，胎兒生長受限病人胎盤組織miR-23a-3p與ZNF395水平呈負(fù)相關(guān)，且二者與新生兒體重、胎盤重量均有相關(guān)性。進(jìn)一步提示miR-23a-3p可能是通過抑制ZNF395表達(dá)，抑制胎盤尤其是滋養(yǎng)細(xì)胞的發(fā)育，進(jìn)而造成胎兒發(fā)育受限。提示臨床研究中應(yīng)密切監(jiān)測妊娠期高血壓孕婦胎兒的宮內(nèi)情況及miR-23a-3p、ZNF395水平。

綜上所述，胎兒生長受限病人胎盤組織中miR-23a-3p表達(dá)水平升高，ZNF395表達(dá)水平降低，二者均與新生兒體重、胎盤重量相關(guān)，且是胎兒生長受限的影響因素。miR-23a-3p可能通過負(fù)向調(diào)控ZNF395表達(dá)參與胎兒生長受限過程，miR-23a-3p、ZNF395可能是改善胎兒生長受限的基因修飾靶點(diǎn)。但仍需進(jìn)一步加大樣本量來驗(yàn)證miR-23a-3p、ZNF395基因的臨床應(yīng)用價值及其影響胎兒生長受限的分子基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2022-07-21）

（本文編輯王麗）