瑞馬唑侖調(diào)節(jié)EPAC1/RAP1信號(hào)通路對(duì)急性心肌梗死大鼠心肌損傷的影響

肖錦亮 汪威廉 但家朋

基金項(xiàng)目：荊州市2020年醫(yī)療衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（2020HC05）

作者單位：荊州市中心醫(yī)院（長(zhǎng)江大學(xué)附屬荊州醫(yī)院）麻醉科（郵編434000）

作者簡(jiǎn)介：肖錦亮（1983），男，主治醫(yī)師，主要從事心臟大血管麻醉方面研究。E-mail：ijpr9v@163.com

△通信作者 E-mail：cunganiv51@163.com

摘要：目的 探討瑞馬唑侖調(diào)節(jié)環(huán)腺苷酸激活的交換蛋白1（EPAC1）/RAS相關(guān)蛋白1（RAP1）信號(hào)通路對(duì)急性心肌梗死（AMI）大鼠心肌損傷的影響。方法 將大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、瑞馬唑侖組、瑞馬唑侖+8-CPT（EPAC1的激動(dòng)劑）組，每組20只。除假手術(shù)組外，其余各組大鼠通過(guò)左前降支結(jié)扎法構(gòu)建AMI大鼠模型；小動(dòng)物超聲儀檢測(cè)心功能指標(biāo)；HE染色檢測(cè)心肌組織病理情況；化學(xué)比色法檢測(cè)大鼠心肌組織超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）水平；JC-1染色法檢測(cè)大鼠心肌細(xì)胞線粒體膜電位；TUNEL染色檢測(cè)心肌細(xì)胞TUNEL陽(yáng)性率；Western blot檢測(cè)心肌組織EPAC1、RAP1、胱天蛋白酶3（Caspase-3）蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞且浸潤(rùn)大量炎性細(xì)胞；心功能指標(biāo)左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESD），心肌組織MDA水平，心肌細(xì)胞TUNEL陽(yáng)性率，心肌組織EPAC1、RAP1、Caspase-3蛋白表達(dá)水平均明顯升高；左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左心室短軸縮短率（LVFS），心肌組織SOD水平，心肌細(xì)胞線粒體膜電位明顯降低（P＜0.05）。與模型組相比，瑞馬唑侖組大鼠心肌損傷緩解，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，心功能指標(biāo)LVEDD、LVESD，心肌組織MDA水平，心肌細(xì)胞TUNEL陽(yáng)性率，心肌組織EPAC1、RAP1、Caspase-3蛋白表達(dá)水平均明顯降低；LVEF、LVFS，心肌組織SOD水平，心肌細(xì)胞線粒體膜電位明顯升高（P＜0.05）。EPAC1的激動(dòng)劑減弱了瑞馬唑侖對(duì)AMI大鼠心肌損傷的緩解作用。結(jié)論 瑞馬唑侖可能通過(guò)抑制EPAC1/RAP1信號(hào)通路抑制心肌細(xì)胞凋亡，減輕AMI大鼠心肌損傷。

關(guān)鍵詞：心肌梗死；心肌損傷；瑞馬唑侖；環(huán)腺苷酸激活的交換蛋白1；RAS相關(guān)蛋白1

中圖分類號(hào)：R542.22文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.11958/20230890

Effect of remimazolam on myocardial injury in rats with acute myocardial infarction by regulating the EPAC1/RAP1 signaling pathway

XIAO Jinliang， WANG Weilian， DAN Jiapeng△

Department of Anesthesiology， Jingzhou Central Hospital （Jingzhou Hospital Affiliated to Changjiang University），

Jingzhou 434000， China

△Corresponding Author E-mail： cunganiv51@163.com

Abstract： Objective To investigate the effect of remimazolam on myocardial injury in rats with acute myocardial infarction （AMI） by regulating exchange proteins directly activated by cAMP （EPAC1）/RAS-related protein 1 （RAP1） signaling pathway. Methods Rats were divided into the sham operation group， the model group， the remazolam group and the remazolam+8-CPT （EPAC1 agonist） group according to random number table method， with 20 rats in each group. Except for the sham operation group， AMI rat model was constructed by ligation of left anterior descending branch in the other groups. Ultrasonic apparatus for small animals was applied to detect cardiac function indicators. HE staining was applied to detect the pathological condition of myocardial tissue. Chemical colorimetry was applied to detect levels of superoxide dismutase （SOD） and malondialdehyde （MDA） in myocardial tissue of rats. JC-1 staining method was applied to detect the mitochondrial membrane potential of rat cardiomyocytes. TUNEL staining was used to detect the TUNEL positive rate of myocardial cells. Western blot assay was applied to detect expression levels of EPAC1， RAP1 and Caspase-3 proteins in myocardial tissue. Results Compared with the sham operation group， the myocardial tissue structure of rats in the model group was severely damaged and infiltrated with a large number of inflammatory cells. Cardiac function indicators left ventricular end diastolic diameter （LVEDD）， left ventricular end systolic diameter （LVESD）， myocardial tissue MDA level， myocardial cell TUNEL positive rate， and myocardial tissue EPAC1， RAP1 and Caspase-3 protein expression levels were obviously increased， and the left ventricular ejection fraction （LVEF）， left ventricular fraction shortening （LVFS）， myocardial tissue SOD level， cardiomyocytes mitochondrial membrane potential were obviously decreased （P＜0.05）. Compared with the model group， the myocardial tissue structure of rats in the ramazolam group was obviously restored， and inflammatory cell infiltration was reduced. The cardiac function indicators LVEDD， LVESD， myocardial tissue MDA level， myocardial cell TUNEL positive rate， and myocardial tissue EPAC1， RAP1 and Caspase-3 protein expression levels were obviously decreased， and LVEF， LVFS， myocardial tissue SOD level， cardiomyocytes mitochondrial membrane potential were obviously increased （P＜0.05）. Agonists of EPAC1 attenuated the mitigating effect of remazolam on myocardial injury in AMI rats. Conclusion Remimazolam may inhibit the EPAC1/RAP1 signaling pathway， inhibit myocardial cell apoptosis and alleviate myocardial injury in AMI rats.

Key words： myocardial infarction; myocardial damage; remimazolam; exchange proteins directly activated by cAMP; RAS-related protein 1

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是由冠狀動(dòng)脈閉塞引起的一種心血管疾病，會(huì)導(dǎo)致不可逆的心肌損傷［1-2］。研究表明，AMI發(fā)作時(shí)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)會(huì)通過(guò)激活不同的信號(hào)通路誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的凋亡［3］。研究顯示線粒體功能障礙會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞能量供應(yīng)不足，進(jìn)而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞異常凋亡［4-5］。因此，抑制線粒體功能障礙將減輕心肌損傷。瑞馬唑侖是一種在咪達(dá)唑侖的基礎(chǔ)上改良的新型超短效苯二氮類麻醉藥，其鎮(zhèn)靜效果優(yōu)于咪達(dá)唑侖，且患者恢復(fù)較快［6］。咪達(dá)唑侖可抑制心肌缺血/再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）損傷誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡［7］，而關(guān)于咪達(dá)唑侖類似物瑞馬唑侖對(duì)心肌損傷影響的相關(guān)研究較少。環(huán)磷酸腺苷激活的交換蛋白（exchange proteins directly activated by cAMP，EPAC）是近年發(fā)現(xiàn)的一種環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）效應(yīng)分子，RAS相關(guān)蛋白1（RAS-related protein 1，RAP1）是EPAC1下游效應(yīng)分子［8］。有研究表明EPAC1/RAP1信號(hào)通路在心肌I/R中被激活，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡［9］。本研究旨在探究瑞馬唑侖對(duì)AMI大鼠心肌損傷的影響及其可能的機(jī)制，進(jìn)一步豐富瑞馬唑侖的藥用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠80只，6～7周齡，體質(zhì)量180～200 g，購(gòu)自湖北貝恩特生物科技有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（鄂）2021－0027。本研究經(jīng)本院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器 瑞馬唑侖（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司）；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；EPAC1激動(dòng)劑8-對(duì)氯苯硫基（8-p-Chlorophenylthio，8-CPT，美國(guó)MCE公司）；JC-1染色試劑盒（Sigma公司）；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒、TUNEL凋亡試劑盒（碧云天公司）；兔源EPAC1、RAP1、胱天蛋白酶-3（Caspase-3）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）一抗以及羊抗兔二抗（CST公司）。MYLAB? X5 VET小動(dòng)物超聲儀（上海玉研科學(xué)儀器有限公司）；DM2000光學(xué)顯微鏡（徠卡顯微系統(tǒng)上海貿(mào)易有限公司）；Multiskan SkyHigh酶標(biāo)儀（美國(guó)賽默飛公司）。

1.3 給藥及分組 將大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、瑞馬唑侖組、瑞馬唑侖+8-CPT（EPAC1的激動(dòng)劑）組，每組20只。除假手術(shù)組外，其余各組大鼠分別通過(guò)左前降支結(jié)扎法構(gòu)建AMI模型［10］，即先將大鼠用戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，然后于左側(cè)第3、4肋骨間開(kāi)胸，擠壓胸腔充分暴露心臟，縫線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，逐層縫合，心電圖顯示ST段持續(xù)抬高則建模成功；假手術(shù)組僅穿線，不結(jié)扎。造模后瑞馬唑侖組大鼠靜脈注射瑞馬唑侖（1.89 mg·kg-1·d-1）［11］；瑞馬唑侖+8-CPT組靜脈注射瑞馬唑侖（1.89 mg·kg-1·d-1）和8-CPT（30 μmol·kg-1·d-1）［9］；假手術(shù)組、模型組靜脈注射等量的生理鹽水，各組大鼠連續(xù)給藥7 d。

1.4 小動(dòng)物超聲儀評(píng)估心功能指標(biāo)末次給藥結(jié)束后，戊巴比妥鈉麻醉大鼠，通過(guò)小動(dòng)物超聲儀檢測(cè)各組大鼠心功能指標(biāo)，包括左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）、左心室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）、左心室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD）、左心室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular end-systolic diameter，LVESD）。

1.5 樣品制備 各組大鼠在心功能檢測(cè)后予以處死，分離心臟組織，每組中取5只大鼠心臟組織固定于多聚甲醛中用于HE染色和TUNEL染色；5只大鼠心臟組織用于檢測(cè)心肌組織SOD和MDA水平；5只大鼠心臟組織用于檢測(cè)心肌細(xì)胞線粒體膜電位；5只大鼠心臟組織用于Western blot檢測(cè)。

1.6 HE染色檢測(cè)心肌組織病理情況 將固定于多聚甲醛中的心臟組織通過(guò)石蠟包埋，制成5 μm病理切片，HE染色，并通過(guò)光鏡觀察各組大鼠心肌組織病理?yè)p傷。

1.7 化學(xué)比色法檢測(cè)心肌組織SOD和MDA水平 取各組大鼠適量梗死心肌組織（假手術(shù)組取同一位置的心肌組織），稱質(zhì)量后加入9倍生理鹽水進(jìn)行混合并制成勻漿，離心后取上清液，按試劑盒說(shuō)明書測(cè)定SOD和MDA，分別在450、532 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)SOD、MDA的吸光度（A）值，計(jì)算表達(dá)水平。

1.8 JC-1染色法檢測(cè)心肌細(xì)胞線粒體膜電位 將梗死心肌組織碎塊提取出線粒體后，按照J(rèn)C-1線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，上鏡檢測(cè)。紅綠熒光比值代表線粒體膜電位水平。

1.9 TUNEL染色觀察心肌細(xì)胞凋亡 將固定于多聚甲醛中心臟組織進(jìn)行石蠟包埋制備病理切片，按照說(shuō)明書進(jìn)行TUNEL染色，計(jì)算TUNEL陽(yáng)性率。

1.10 Western blot檢測(cè)心肌組織EPAC1、RAP1、Caspase-3蛋白表達(dá)水平 將心肌組織剪碎后加入RIPA裂解液，充分勻漿裂解后，離心獲得上清液即蛋白，BCA法進(jìn)行定量后，進(jìn)行Western blot檢測(cè)。具體步驟為電泳，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉，4 ℃孵育EPAC1、RAP1、Caspase-3、GAPDH一抗（稀釋比均為1∶1 000）過(guò)夜，室溫孵育二抗（稀釋比均為1∶3 000）1 h，將膜用ECL顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍照，通過(guò)Image J軟件分析蛋白相對(duì)表達(dá)。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（[x] ±s）表示。多組間比較用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心功能相關(guān)指標(biāo)比較 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠LVEDD、LVESD均升高，LVEF、LVFS降低（P＜0.05）；與模型組相比，瑞馬唑侖組大鼠LVEDD、LVESD均降低，LVEF、LVFS升高（P＜0.05）；與瑞馬唑侖組相比，瑞馬唑侖+8-CPT組大鼠LVEDD、LVESD升高，LVEF、LVFS降低（P＜0.05），見(jiàn)表1。

2.2 各組大鼠心肌組織病理?yè)p傷 假手術(shù)組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞排列有序；與假手術(shù)組相比，模型組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)受損嚴(yán)重，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；與模型組相比，瑞馬唑侖組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)恢復(fù)，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；與瑞馬唑侖組相比，瑞馬唑侖+8-CPT組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)受損嚴(yán)重，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)圖1。

2.3 各組大鼠心肌組織SOD和MDA水平比較 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠心肌組織SOD水平降低，MDA水平升高（P＜0.05）；與模型組相比，瑞馬唑侖組大鼠心肌組織SOD水平升高，MDA水平降低（P＜0.05）；與瑞馬唑侖組相比，瑞馬唑侖+8-CPT組大鼠心肌組織SOD水平降低，MDA水平升高（P＜0.05），見(jiàn)表2。

2.4 各組大鼠心肌細(xì)胞線粒體膜電位比較 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠心肌細(xì)胞紅綠熒光比值降低，線粒體膜電位下降（P＜0.05）；與模型組相比，瑞馬唑侖組大鼠心肌細(xì)胞線粒體膜電位上升（P＜0.05）；與瑞馬唑侖組相比，瑞馬唑侖+8-CPT組大鼠心肌細(xì)胞線粒體膜電位下降（P＜0.05），見(jiàn)表3，圖2。

2.5 各組大鼠心肌細(xì)胞TUNEL陽(yáng)性率比較 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠心肌細(xì)胞TUNEL陽(yáng)性率升高（P＜0.05）；與模型組相比，瑞馬唑侖組大鼠心肌細(xì)胞TUNEL陽(yáng)性率降低（P＜0.05）；與瑞馬唑侖組相比，瑞馬唑侖+8-CPT組大鼠心肌細(xì)胞TUNEL陽(yáng)性率升高（P＜0.05），見(jiàn)表3、圖3。

2.6 各組大鼠心肌組織EPAC1、RAP1、Caspase-3蛋白表達(dá)水平比較 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠心肌組織EPAC1、RAP1、Caspase-3蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與模型組相比，瑞馬唑侖組大鼠心肌組織EPAC1、RAP1、Caspase-3蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與瑞馬唑侖組相比，瑞馬唑侖+8-CPT組大鼠心肌組織上述蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），見(jiàn)表4、圖4。

3 討論

AMI是臨床常見(jiàn)心血管疾病，近年來(lái)我國(guó)心肌梗死發(fā)病率逐漸升高，盡管該病的診療技術(shù)取得了進(jìn)展，但心肌梗死時(shí)出現(xiàn)心肌壞死，心肌細(xì)胞凋亡導(dǎo)致心臟出現(xiàn)不可逆損傷，AMI病死率仍然很高［12-13］。因此，尋求可以抑制心肌細(xì)胞凋亡，從而減輕AMI后心肌損傷的方法具有重要意義。

瑞馬唑侖是一種新型鎮(zhèn)靜藥物，廣泛應(yīng)用于成人全身麻醉和重癥監(jiān)護(hù)病房（intensive care unit，ICU）鎮(zhèn)靜［14］。有研究表明咪達(dá)唑侖對(duì)心肌具有保護(hù)作用，其可減少心肌I/R損傷大鼠心肌梗死面積，緩解心臟組織損傷并抑制心肌細(xì)胞凋亡［7］。而瑞馬唑侖是咪達(dá)唑侖類似物，且具有比咪達(dá)唑侖更好的臨床效果，因此推測(cè)瑞馬唑侖可能對(duì)心肌具有保護(hù)作用，減少心肌梗死面積，減輕心肌損傷。本研究表明瑞馬唑侖可明顯緩解心肌損傷，提高AMI大鼠心臟收縮和舒張能力，與Zhou等［7］研究結(jié)果基本一致。有研究顯示心肌缺血時(shí)出現(xiàn)大量氧自由基堆積，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷［15］?？寡趸窼OD和氧化酶MDA常用來(lái)反映氧化應(yīng)激情況。本文結(jié)果顯示，經(jīng)瑞馬唑侖干預(yù)后，AMI大鼠MDA水平降低，SOD水平升高，提示瑞馬唑侖可減輕大鼠心肌的氧化應(yīng)激損傷。線粒體是細(xì)胞凋亡的一個(gè)關(guān)鍵因素，幾乎所有導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的刺激都會(huì)誘發(fā)線粒體結(jié)構(gòu)破壞和功能障礙，且線粒體膜電位變化也是心肌細(xì)胞早期凋亡的指標(biāo)［16］。有研究顯示芪藶強(qiáng)心膠囊可通過(guò)緩解AMI大鼠氧化損傷減輕線粒體功能障礙，并抑制心肌細(xì)胞異常凋亡，保護(hù)大鼠心臟功能［17］。本研究結(jié)果顯示，AMI大鼠心肌細(xì)胞線粒體膜電位降低，心肌細(xì)胞凋亡率升高，瑞馬唑侖干預(yù)后大鼠心肌細(xì)胞線粒體膜電位升高，且心肌細(xì)胞凋亡率下降，與Zhao等［17］研究結(jié)果相似，提示瑞馬唑侖處理可促進(jìn)AMI大鼠線粒體功能障礙恢復(fù)，抑制心肌細(xì)胞凋亡，從而緩解AMI大鼠心肌氧化損傷。

cAMP是一種關(guān)鍵的二級(jí)信使，可直接誘導(dǎo)EPAC激活，發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)。EPAC包含EPAC1和EPAC2兩種主要亞型，其中EPAC1在心臟、子宮、卵巢等組織中大量表達(dá)［18］，EPAC的效應(yīng)器為RAP，RAP是小G蛋白的RAS超家族成員之一［19］。多個(gè)研究表明心肌I/R損傷通過(guò)激活EPAC1-RAP1信號(hào)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡［20-21］。也有研究表明激活EPAC1-RAP1信號(hào)可引起線粒體功能障礙，從而導(dǎo)致心肌I/R損傷［9］。本研究結(jié)果表明AMI大鼠心肌組織中EPAC1、RAP1蛋白水平明顯升高，EPAC1-RAP1信號(hào)通路被激活，而瑞馬唑侖干預(yù)后，大鼠心肌組織中EPAC1、RAP1蛋白水平明顯降低，與Yang［9］等研究結(jié)果相似，提示瑞馬唑侖可能通過(guò)抑制EPAC1/RAP1信號(hào)通路減輕AMI大鼠心肌損傷。進(jìn)一步使用8-CPT干預(yù)AMI大鼠后，發(fā)現(xiàn)8-CPT逆轉(zhuǎn)了瑞馬唑侖對(duì)AMI大鼠心肌損傷的保護(hù)作用，進(jìn)一步證實(shí)瑞馬唑侖可通過(guò)抑制EPAC1/RAP1信號(hào)通路減輕AMI大鼠心肌損傷。

綜上所述，瑞馬唑侖可通過(guò)抑制EPAC1/RAP1信號(hào)通路抑制心肌細(xì)胞凋亡，從而減輕AMI大鼠心肌損傷，但是否存在其他通路調(diào)控此過(guò)程，仍需進(jìn)一步研究。

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（2023-06-12收稿 2023-10-19修回）

（本文編輯 李國(guó)琪）