丹參酮ⅡA對(duì)膿毒癥肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用*

邵沙沙 殷惠美 楊家樂(lè) 潘勇軍 王 敏 劉俊雅△ 馮 俊

（1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院，湖北 武漢 430030；2.新疆維吾爾自治區(qū)博爾塔拉蒙古自治州人民醫(yī)院，新疆 博樂(lè) 833499；3.南方科技大學(xué)醫(yī)院，廣東 深圳 518055）

膿毒癥被定義為宿主對(duì)感染的反應(yīng)失調(diào)導(dǎo)致危及生命的器官功能障礙［1］。全世界每年膿毒癥患者超過(guò)30 萬(wàn)例［2］。器官功能障礙是膿毒癥的主要并發(fā)癥，膿毒癥誘發(fā)的肺功能障礙非常普遍。在致病因素中，膿毒癥相關(guān)性急性肺損傷（ALI）的發(fā)病率最高，死亡率最高，超過(guò)40%的膿毒癥患者發(fā)展為ALI［3-4］。單層內(nèi)皮細(xì)胞附著在血管內(nèi)壁上，構(gòu)成血-組織交換界面，是維持組織和器官正常功能的基礎(chǔ)。內(nèi)皮功能障礙是膿毒癥和ALI/ARDS 的標(biāo)志［5］。目前臨床上膿毒癥所致ALI 和急性呼吸窘迫綜合征的治療手段有限，因此，研究有效的藥物對(duì)該病的治療極為重要。丹參臨床常用于通經(jīng)止痛、活血化瘀、清心除煩等；丹參酮ⅡA 是丹參中最重要的有效活性成分，也最為穩(wěn)定，有良好的生物利用度和保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞、調(diào)節(jié)免疫、抗炎、抗氧化、改善微循環(huán)等多種藥理效用［6］。既往研究表明丹參酮ⅡA 可通過(guò)TLR/核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）和MAPKs/NFκB 通路抑制炎癥反應(yīng)保護(hù)脂多糖誘導(dǎo)的小鼠肺損傷［7］；也可以通過(guò)抑制NF-κB 和HIF-1α 通路，抑制炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，減輕脂多糖誘導(dǎo)的小鼠ALI［8］，但丹參酮ⅡA 在膿毒癥ALI 中對(duì)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用少有報(bào)道。因此本研究通過(guò)對(duì)小鼠進(jìn)行盲腸結(jié)扎穿刺（CLP）手術(shù)建立膿毒癥急性肺損傷小鼠模型，觀(guān)察不同劑量的丹參酮ⅡA 對(duì)模型小鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及炎性因子的影響。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)72只C57BL/6小鼠，8周齡，體質(zhì)量18～22 g，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（鄂）2021-0027，使用許可證號(hào)SYXK（鄂）2021-0057。購(gòu)自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，飼養(yǎng)于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，溫度20 ℃，相對(duì)濕度50%，12 h 光照/12 h 黑暗循環(huán)。本研究已獲得倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試藥與儀器

丹參酮ⅡA 磺酸鈉注射液（上海第一生化），小鼠白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）ELISA 試劑盒（武漢艾美捷），小鼠白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA 試劑盒（武漢博士德），BCA 蛋白定量試劑盒（碧云天公司），細(xì)胞總蛋白提取試劑盒（武漢艾美捷）。顯微鏡（OlympusIX71型，日本OLYMPUS）；離心機(jī)（AvantiJ-15R 型，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特）；電泳儀（EPS-300 型，上海天能科技）等。

1.3 分組與造模

將小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、丹參酮1 組（10 mg/kg）、丹參酮2組（30 mg/kg）、丹參酮3組（50 mg/kg）、丹參酮4 組（100 mg/kg），每組12 只。適應(yīng)性飼喂3 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。術(shù)前禁食12 h，不禁水。小鼠腹腔注射苯巴比妥鈉100～120 mg／kg 麻醉，置于仰位，于中下腹部做1 cm 縱切，打開(kāi)腹腔，通過(guò)鈍性分離及游離操作，充分暴露盲腸，于距盲腸末端1 cm處采用3號(hào)縫合線(xiàn)環(huán)形結(jié)扎，保證腸道通暢，距結(jié)扎處5 mm 位置采用9 號(hào)針頭貫穿盲腸2 次，輕擠壓確保糞便溢出，并進(jìn)行后續(xù)的關(guān)閉腹腔手術(shù)。假手術(shù)組除開(kāi)腹后不做盲腸結(jié)扎與穿刺外，其他操作相同。

1.4 干預(yù)方法

造模后即刻，4 個(gè)丹參酮組小鼠腹腔分別注射相應(yīng)劑量的丹參酮ⅡA 磺酸鈉注射液，假手術(shù)組和模型組注射生理鹽水。完成干預(yù)后為所有小鼠提供相同環(huán)境和飲食。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè)

造模24 h 后，在頸椎脫臼法處死小鼠前30 min 至1 h，用2%伊文思藍(lán)液（2 mg/kg）從尾靜脈注射。1 h后將小鼠腹腔注射麻醉并固定，于胸骨中線(xiàn)處行開(kāi)胸手術(shù)，暴露胸腔臟器后剪開(kāi)左心房，用生理鹽水從左心房處充分灌洗心臟及血管內(nèi)的Evans Blue，直至左心房處無(wú)血性液體流出。進(jìn)一步暴露肺組織及氣管，肉眼觀(guān)察雙肺顏色并拍照。用留置靜脈針進(jìn)行氣管插管，用4 號(hào)手術(shù)線(xiàn)結(jié)扎固定右側(cè)主支氣管，并將右肺切除放于冰盒。用2.0 mL PBS 進(jìn)行肺泡灌洗持續(xù)約1 min，抽取灌洗液1.5 mL，重復(fù)3 次，收集肺泡灌洗液，離心后-80 ℃冰箱保存。

1.5.1 肺毛細(xì)血管通透性 稱(chēng)取100 mg 左右肺組織，剪碎后研磨勻漿，加入1 mL 甲酰胺后水浴、離心，取上清液，用酶標(biāo)儀測(cè)液620 nm 波長(zhǎng)處吸光度OD 值，計(jì)算肺組織的Evans Blue含量（μg/g）。

1.5.2 肺組織病理改變及損傷評(píng)分 取右肺上葉組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片4 mm進(jìn)行HE染色，二甲苯脫蠟，無(wú)水乙醇水化，蘇木精染色，酒精脫水，二甲苯透明。封片后于光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察小鼠肺組織病理變化，根據(jù)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡腔內(nèi)出血及滲出、透明膜形成、肺泡水腫等肺組織病理變化評(píng)估肺組織損傷程度。

1.5.3 肺組織干濕重比 取右肺中葉組織，濾紙擦干，稱(chēng)重并記錄即濕重（W）。放入烤箱中，每12 小時(shí)稱(chēng)1次，直至質(zhì)量不再變化，記錄即干重（D）。計(jì)算小鼠肺組織濕/干重比（W/D）。

1.5.4 肺組織及肺泡灌洗液（BALF）中炎性因子 將肺泡灌洗液室溫解凍后，按照BCA 試劑盒的操作步驟檢測(cè)BALF 蛋白濃度，依據(jù)檢測(cè)說(shuō)明書(shū)按步驟采用ELISA 法檢測(cè)BALF 中白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）、IL-6、TNFα及IL-1β的濃度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠Evans Blue法測(cè)肺毛細(xì)血管通透性比較

肉眼觀(guān)察，假手術(shù)組小鼠肺藍(lán)染不明顯；相較于假手術(shù)組，模型組小鼠肺藍(lán)染明顯；丹參酮各組藍(lán)染程度相較模型組有不同程度的減輕。見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠肺組織Evans Blue染色

各組小鼠肺組織Evans Blue 含量的統(tǒng)計(jì)描述見(jiàn)表1。模型組EB 含量顯著高于假手術(shù)組；丹參酮各組小鼠EB 含量較模型組明顯減少（P＜0.05）；在丹參酮各組內(nèi)，2 組、3 組與4 組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而2、3、4 組小鼠肺組織EB 含量較丹參酮1 組明顯下降（P＜0.05）。

表1 各組小鼠EB含量、W/D及肺損傷評(píng)分比較（±s）

表1 各組小鼠EB含量、W/D及肺損傷評(píng)分比較（±s）

注：與丹參酮1組比較，*P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05。下同。

組 別假手術(shù)組模型組丹參酮1組丹參酮2組丹參酮3組丹參酮4組n 12 12 12 12 12 12 EB 含量（μg/g）1.74±2.23 7.69±2.66 5.62±1.76△4.02±1.32*△3.82±1.16*△3.88±1.43*△W/D 4.00±0.21 4.78±0.15 4.35±0.17△4.09±0.15*△3.97±0.17*△4.00±0.12*△肺損傷評(píng)分（分）0.22±0.02 0.69±0.05 0.55±0.04△0.35±0.02*△0.33±0.03*△0.33±0.04*△

2.2 各組小鼠肺組織HE染色結(jié)果比較

見(jiàn)圖2。光鏡下，假手術(shù)組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰完整，完整肺泡數(shù)量多，肺泡腔及間質(zhì)內(nèi)無(wú)充血滲出，無(wú)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞，肺泡邊緣不清晰，數(shù)量明顯減少，肺泡腔和間質(zhì)內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、充血，肺泡間隔增寬，間隔內(nèi)血管擴(kuò)張，內(nèi)皮細(xì)胞脫落；丹參酮各組較模型組肺組織結(jié)構(gòu)破壞減輕，大部分肺泡尚完整，肺泡腔內(nèi)及肺間隔充血滲出緩解。

圖2 各組小鼠肺組織病理組織觀(guān)察（HE染色，400倍）

2.3 各組小鼠肺W/D比較

見(jiàn)表1。丹參酮組（TanⅡA干預(yù)組）小鼠肺組織含水量較模型組明顯減少（P＜0.05）；在丹參酮各組內(nèi)，丹參酮2 組、丹參酮3 組與丹參酮4 組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而丹參酮2、3、4 組的肺組織含水量較丹參酮1組明顯下降（P＜0.05）。

2.4 各組小鼠肺損傷評(píng)分比較

見(jiàn)表1。與模型組比較，丹參酮各組小鼠損傷評(píng)分明顯降低（P＜0.05）；在丹參酮各組內(nèi)，與1 組比較，2、3、4 組肺損傷評(píng)分降低（P＜0.05）。2、3、4 組之間肺組織損傷評(píng)分差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.5 各組小鼠肺組織及BALF中白細(xì)胞計(jì)數(shù)、蛋白質(zhì)、炎性因子水平比較

見(jiàn)表2。丹參酮各組細(xì)胞、蛋白質(zhì)含量計(jì)數(shù)以及各種炎性因子明顯小于模型組（CLP）（P＜0.05）；在丹參酮各組內(nèi)，與丹參酮1 組相比，其他3 個(gè)丹參酮組白細(xì)胞計(jì)數(shù)、蛋白質(zhì)含量以及炎性因子明顯降低（P＜0.05）；而丹參酮2 組、丹參酮3 組和丹參酮4 組之間白細(xì)胞計(jì)數(shù)、蛋白含量以及IL-6、TNF-α、IL-1β 等炎癥因子的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組小鼠BALF白細(xì)胞計(jì)數(shù)、蛋白含量及炎性因子水平比較（±s）

表2 各組小鼠BALF白細(xì)胞計(jì)數(shù)、蛋白含量及炎性因子水平比較（±s）

組別假手術(shù)組模型組丹參酮1組丹參酮2組丹參酮3組丹參酮4組n 12 12 12 12 12 12白細(xì)胞計(jì)數(shù)（×109/L）6.90±0.90 13.00±0.82 10.94±0.90△7.92±1.07*△7.45±0.66*△7.46±0.74*△蛋白含量（mg/mL）0.21±0.03 0.58±0.07 0.51±0.05△0.40±0.04*△0.40±0.02*△0.40±0.04*△IL-6（pg/mL）57.69±7.70 542.31±23.08 373.08±23.08△192.31±15.38*△188.46±15.38*△180.77±19.23*△TNF-α（pg/mL）41.38±6.90 396.55±20.69 296.55±20.69△165.52±10.35*△158.62±10.35*△155.17±13.80*△IL-1β（pg/mL）9.80±0.82 34.29±2.45 29.94±1.63△25.03±1.36*△23.13±1.09*△23.40±1.09*△

3 討 論

膿毒癥并發(fā)的ALI/ARDS 會(huì)增加膿毒癥患者器官功能障礙和死亡的風(fēng)險(xiǎn)，而ALI/ARDS 的重要病理生理機(jī)制是肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷［9］，其中，內(nèi)皮細(xì)胞的屏障功能的破壞和代謝與分泌功能的亢進(jìn)是其損傷的突出表現(xiàn)。血管內(nèi)皮細(xì)胞（VEC）是位于血管內(nèi)壁的一層多功能細(xì)胞，其最重要的功能之一是作為循環(huán)血液和周?chē)M織中間的半滲透屏障，在血-組織交換中發(fā)揮重要作用，對(duì)維持器官內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)有重要作用。相關(guān)研究已經(jīng)明確，內(nèi)皮屏障完整性的破壞是導(dǎo)致膿毒癥和ALI/ARDS 發(fā)病的關(guān)鍵因素［5，10］。除了具有屏障功能外，內(nèi)皮細(xì)胞還具有代謝和分泌功能，在生理狀態(tài)下參與炎癥反應(yīng)、血栓形成、影響血管通透性及液體平衡等；而在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，作為病原體及其毒素的主要靶器官，血管內(nèi)皮細(xì)胞的代謝與分泌功能被過(guò)度激活，釋放大量炎性因子，參與炎癥-免疫反應(yīng)、補(bǔ)體系統(tǒng)激活和凝血紊亂等病理改變。此外高水平的炎性因子會(huì)引起肺血管內(nèi)皮屏障功能障礙，從而導(dǎo)致ALI。由于肺由大量的毛細(xì)血管網(wǎng)組成，因此肺組織的微血管內(nèi)皮細(xì)胞更易受到諸如缺氧、內(nèi)毒素等疾病因素的侵襲，肺也因此成為膿毒癥過(guò)程中的主要靶器官［11］。和一般的血管內(nèi)皮細(xì)胞相似，當(dāng)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞受到病原體及毒素等因素刺激后，屏障功能破壞，微血管通透性增加；代謝和分泌功能亢進(jìn)，參與補(bǔ)體系統(tǒng)的過(guò)度激活、免疫應(yīng)答異常、炎癥風(fēng)暴和凝血紊亂等病理學(xué)改變，從而進(jìn)一步加重肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，引起彌漫性肺微血管血栓形成。上述病理生理反應(yīng)促進(jìn)大量液體及炎癥因子通過(guò)肺微血管滲入肺組織，導(dǎo)致肺組織損傷及肺間質(zhì)水腫形成，臨床上表現(xiàn)為進(jìn)行性低氧血癥，最終可進(jìn)展為ARDS，嚴(yán)重影響治療及患者預(yù)后。叢迪迪等［12］的綜述性文獻(xiàn)報(bào)告了中藥材干預(yù)膿毒癥急性肺損傷研究的最新進(jìn)展。多種中藥材從干預(yù)炎性因子及炎癥信號(hào)通路、抗氧化應(yīng)激以及抑制細(xì)胞凋亡等途徑實(shí)現(xiàn)干預(yù)膿毒癥ALI 的目的。

丹參具有活血祛瘀、涼血消癰之功效，有著廣泛的臨床應(yīng)用［13］。丹參酮ⅡA是丹參中最重要也最為穩(wěn)定的有效活性成分，有良好的生物利用度和保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞、調(diào)節(jié)免疫、抗炎、抗氧化、改善微循環(huán)等多種藥理效用［6］，在臨床上有抗炎解毒、活血祛瘀之功效［14］。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA 可有效拮抗膿毒血癥中多種炎癥因子和氧自由基等水平的異常改變［15-17］。已有研究表明，丹參酮ⅡA 可通過(guò)TLR/NF-κB 和MAPKs/NF-κB 通路抑制炎癥反應(yīng)、保護(hù)脂多糖誘導(dǎo)的小鼠肺損傷［7］；也有研究發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA 可以通過(guò)抑制NFκB 和HIF-1α 通路，抑制炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，減輕脂多糖誘導(dǎo)的小鼠ALI［8］；此外，TanⅡA 能夠明顯改善大鼠腸缺血再灌注導(dǎo)致的肺損傷［18］也被研究證實(shí)?；谇叭说膶?shí)驗(yàn)結(jié)果，在本研究中，我們采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（CLP）構(gòu)建膿毒癥肺損傷模型，并使用TanⅡA（每日10、30、50、100 mg/kg）腹腔注射干擾丹參酮組，觀(guān)察丹參酮ⅡA 對(duì)膿毒癥肺損傷中肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以將丹參酮ⅡA 對(duì)肺的保護(hù)作用分為以下幾點(diǎn)：1）從宏觀(guān)角度，丹參酮ⅡA 改善膿毒癥小鼠肺組織損傷。各組小鼠肺組織HE 染色的結(jié)果比較直觀(guān)地證明了這一點(diǎn)。與模型組相比，所有丹參酮組小鼠肺組織光鏡下病理變化均發(fā)生不同程度的減輕。此外，各組小鼠的肺損傷評(píng)分比較提供了可靠的數(shù)據(jù)支持。數(shù)據(jù)顯示丹參酮ⅡA 干預(yù)對(duì)膿毒癥小鼠的急性肺損傷具有明顯保護(hù)作用。2）從微觀(guān)角度，丹參酮ⅡA 減輕了膿毒癥小鼠肺血管的高通透性。在Evans Blue 法測(cè)肺毛細(xì)血管通透性實(shí)驗(yàn)中通過(guò)肉眼觀(guān)察各組小鼠雙肺顏色變化直觀(guān)感受到丹參酮ⅡA 干預(yù)后肺通透性明顯降低，而進(jìn)一步的Evans Blue 含量測(cè)量量化了模型組與各丹參酮組的肺毛細(xì)血管通透性。此外，各組小鼠肺W/D比值比較實(shí)驗(yàn)從另一個(gè)角度再次驗(yàn)證丹參酮ⅡA 干預(yù)措施減輕了膿毒癥過(guò)程中小鼠肺毛細(xì)血管通透性。3）從微觀(guān)角度，丹參酮ⅡA 減輕了膿毒癥小鼠肺血管的炎性滲出。在肺組織及BALF中白細(xì)胞計(jì)數(shù)、蛋白質(zhì)含量以及炎性因子的比較實(shí)驗(yàn)中，炎性滲出物被定量測(cè)定并通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，證明丹參酮ⅡA 干預(yù)措施可以減輕膿毒癥小鼠肺血管的炎性滲出，且干預(yù)效果呈劑量依賴(lài)性，丹參酮ⅡA 30 mg/kg即可達(dá)到最佳效果。

根據(jù)上述結(jié)果可以推測(cè)丹參酮ⅡA 對(duì)膿毒癥小鼠肺組織損傷的保護(hù)作用可能來(lái)自對(duì)肺毛細(xì)血管屏障功能的保護(hù)以減輕膿毒癥肺血管的高通透性，以及對(duì)肺毛細(xì)血管過(guò)度代謝和分泌功能的抑制以減輕肺血管的炎性滲出。本實(shí)驗(yàn)的不足之處在于未分析丹參酮ⅡA在膿毒癥過(guò)程中保護(hù)肺毛細(xì)血管屏障功能、抑制肺毛細(xì)血管過(guò)度代謝和分泌功能的分子生物學(xué)機(jī)制。在已經(jīng)明確丹參酮ⅡA 對(duì)膿毒癥小鼠肺組織損傷的保護(hù)作用后，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)應(yīng)該著眼于對(duì)其作用機(jī)制和信號(hào)途徑的研究，這可能有助于開(kāi)發(fā)針對(duì)ALI/ARDS 的藥物開(kāi)發(fā)。