松果菊苷對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化血管鈣化小鼠Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路的影響

袁媛 賈哲睿 王晨皓 劉濤 趙軍 何麗娟 陶寧 由淑萍

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）作為心血管病變的重要臨床病理變化之一，嚴(yán)重危害人類健康。血管鈣化在AS 中普遍存在，目前認(rèn)為鈣化是一個(gè)由細(xì)胞控制且可主動(dòng)調(diào)節(jié)的過(guò)程[1]，類似骨發(fā)育和骨質(zhì)疏松的過(guò)程，其出現(xiàn)和發(fā)展與炎癥、脂質(zhì)堆積、氧化應(yīng)激等因素有關(guān)[2]。在多種信號(hào)通路中，Wnt/βcatenin 信號(hào)通路在AS 的發(fā)生發(fā)展中起到了重要的作用?；罨膬?nèi)皮和血管成纖維細(xì)胞是AS 進(jìn)程中骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）等分子產(chǎn)生的主要來(lái)源，高表達(dá)的BMP-2 引起血管鈣化的發(fā)生[3]。其中，BMP-2 通過(guò)上調(diào)成骨轉(zhuǎn)錄因子Msx2，促進(jìn)多種Wnt 配體（如Wnt3a）的產(chǎn)生，減少了內(nèi)源性抑制劑DKK1 的生成，導(dǎo)致Wnt 信號(hào)通路增強(qiáng)[4]。松果菊苷（echinacoside，ECH）是管花肉蓯蓉的主要活性成分[5]，具有廣泛的藥理作用，包含抗氧化應(yīng)激、抗細(xì)胞凋亡及抗炎等[6-8]。近來(lái)研究者發(fā)現(xiàn)ECH 具有心血管保護(hù)活性[9]，本課題組前期研究亦發(fā)現(xiàn)此作用[10]。因此，本研究擬探究松果菊苷對(duì)AS 血管鈣化小鼠Wnt/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）信號(hào)通路的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇7 周齡健康A(chǔ)poE-/-雄性小鼠48只，體質(zhì)量20～22 g，購(gòu)于江蘇集萃藥康公司，合格證號(hào)：SCXK（新）2018-0003。均于新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)條件下飼養(yǎng)。本研究經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過(guò)（批準(zhǔn)文號(hào)：IACUC-20210617-01）。

1.2 藥物、試劑與儀器 ECH（純度≥98%，批號(hào)：N25GB168967）購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；辛伐他汀片（simvastatin tablets，Sta，規(guī)格：20 mg/片，國(guó)藥準(zhǔn)字：J20180007）購(gòu)于美國(guó)Merck Sharp 公司；高脂飼料（批號(hào)：210709）購(gòu)于江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司；TC（批號(hào)：A111-1-1）、TG（批號(hào)：A110-1-1）、HDL-C（批號(hào)：A112-1-1）、LDL-C（批號(hào)：A112-1-1）測(cè)定試劑盒購(gòu)于南京建成科技有限公司；總RNA 提取試劑盒（total RNA extractor，Trizol，批號(hào)：267309）購(gòu)于美國(guó)Invitrogen 公司；PCR 引物合成于上海生工生物工程有限公司；熒光定量（批號(hào)：AL51019A）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)：AL50948A）購(gòu)于日本Takara 公司；抗鼠/兔通用型免疫組化試劑盒（批號(hào)：20030278）、Wnt3a（批號(hào)：26744-1-AP）、β-catenin（批號(hào)：17565-1-AP）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）（批號(hào)：10494-1-AP）兔單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG 抗體（批號(hào)：20000373）購(gòu)于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；LRP5（批號(hào)：85c5505）兔單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Affinity 公司；BMP-2（批號(hào)：R01213885）購(gòu)于沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技有限公司；RIPA 裂解液（批號(hào)：2020928）、蛋白酶抑制劑（批號(hào)：20210927）、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒（批號(hào)：20210901）購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；ECL 顯色液（批號(hào)：22346507）購(gòu)于Biosharp 公司；Eclipse Ni-U 顯微鏡購(gòu)于日本Nikon 公司；移液器、低溫離心機(jī)（型號(hào)：5424R）購(gòu)于德國(guó)Eppendorf 公司；全波長(zhǎng)功能酶標(biāo)儀（型號(hào)：Multiskan GO）、熒光定量PCR 儀（型號(hào)：ABI QuantStudio 6Flex）購(gòu)于購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher 公司；全自動(dòng)紫外線分光光度計(jì)（型號(hào)：ND2000）購(gòu)于北京基因有限公司；電泳和轉(zhuǎn)膜裝置（型號(hào)：Cavoy PowerPac HC+Mini-PR）購(gòu)于上海臻諾生物科技有限公司；凝膠成像儀（型號(hào)：Cel-DocXR）購(gòu)于美國(guó)Bio-rad 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組與處理 根據(jù)參考文獻(xiàn)[11]通過(guò)基因打靶技術(shù)制備小鼠AS 模型。將小鼠經(jīng)過(guò)1 周的適應(yīng)性喂養(yǎng)后采用隨機(jī)數(shù)字表法分為6組，每組8只：分別為模型組、ECH 12.5、25、50 mg/kg 組、Sta 組和對(duì)照組。ECH 12.5、25、50 mg/kg 組和Sta 組給予高脂飼料造模（含19.97%的無(wú)水乳脂，0.15%的膽固醇），對(duì)照組給予基礎(chǔ)飼料。從高脂飲食喂養(yǎng)的第1天開(kāi)始，模型組、對(duì)照組每日灌胃相同體積的0.5%羧甲基纖維素鈉（carboxymethylcellulose sodium，CMC-Na）溶液，ECH 各劑量組及Sta組每日按設(shè)定劑量灌胃給予ECH或Sta，連續(xù)給藥16周后處死小鼠，進(jìn)行血清收集及主動(dòng)脈取材。

1.3.2 檢測(cè)標(biāo)本采集 造模末日小鼠禁食不禁水12 h后摘除眼球取血，置于EP 管內(nèi)。然后斷頸處死并打開(kāi)腹腔，取出主動(dòng)脈放入裝有4%多聚甲醛液的離心管中固定48 h。

1.3.3 小鼠主動(dòng)脈組織病理檢查 將固定的小鼠主動(dòng)脈脫水透明后用石蠟包埋，蠟塊切成厚度為5 μm的組織切片并迅速固定在載玻片上，常規(guī)的HE 染色后在顯微鏡下觀察并比較6 組小鼠主動(dòng)脈的形態(tài)學(xué)變化。

1.3.4 小鼠血清生化檢測(cè) 將EP 管內(nèi)的血液以3 000 r/min，4 ℃離心30 min，吸出上清液分裝新的EP管內(nèi)，采用磷酸甘油氧化酶法測(cè)定TG 水平，采用膽固醇氧化酶法測(cè)定小鼠血清TC 水平，酶標(biāo)儀直接法測(cè)定LDL-C 和HDL-C 水平。

1.3.5 小鼠主動(dòng)脈β-catenin mRNA 的表達(dá)測(cè)定 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法，用含Trizol 的溶液提取小鼠主動(dòng)脈的總RNA 后純化（達(dá)到A260/A280=1.8～2.0）。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，取1 μL 產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，10 μL 反應(yīng)體系，擴(kuò)增條件為：95 ℃、30 s；95 ℃、5 s，60 ℃、34 s，40 個(gè)循環(huán)，重復(fù)3 次。PCR 運(yùn)行結(jié)束后讀取CT 值，以2-ΔΔCt法分析β-catenin mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平。引物序列：GAPDH：F（5'-GGTTGTCTCCTGCGACTT-CA-3'），GAPDH：R（5'-TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC-3'），β-catenin：F（5'-GCTGCTGTCCTATTCCGAATG- TCTG-3'），β-catenin：R（5'-GGCACCAATGTCCAGTCCAAGATC-3'）。

1.3.6 小鼠主動(dòng)脈相關(guān)蛋白表達(dá)測(cè)定 采用Western blot 法檢測(cè)β-catenin、Wnt3a、LDL 受體相關(guān)蛋白5（LDL receptor protein，LRP5）及BMP-2 蛋白表達(dá)水平。從-80 ℃冰箱中取凍存的小鼠主動(dòng)脈組織放入預(yù)冷的研磨管內(nèi)，根據(jù)稱取的量加入一定比例裂解液，使用全自動(dòng)樣品快速研磨儀進(jìn)行組織研磨，冰浴裂解30 min，4 ℃，12 000 r/min，離心15 min取上清液。根據(jù)BCA 法檢測(cè)總蛋白濃度；加入5 倍的上樣緩沖液混勻后，100 ℃水浴加熱變性10 min；于10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳（電壓120 V，60 min），將蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯膜上，300 mA 恒流電轉(zhuǎn)70 min。5%脫脂奶粉于室溫下封閉聚偏二氟乙烯膜2 h，進(jìn)行一抗（β-catenin，1∶4 000、Wnt3a，1∶1 000、LRP5，1∶1 000、BMP-2，1∶1 000、GAPDH，1∶10 000）4 ℃下孵育過(guò)夜，清洗3 次后室溫下孵育二抗1 h。凝膠成像儀拍照顯色，分析條帶灰度值。βcatenin、Wnt3a、LRP5 及BMP-2 蛋白表達(dá)水平=目的條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值×100%。

1.3.7 小鼠主動(dòng)脈LRP5 蛋白表達(dá)測(cè)定 采用免疫組化法，組織包埋切片后，70 ℃烤片2 h，二甲苯和梯度乙醇進(jìn)行脫蠟至水后放入pH=9.0 的抗原修復(fù)液微波修復(fù)15 min，自然冷卻至室溫，以3%H2O2阻斷過(guò)氧化物酶，F(xiàn)BS 孵育，加入一抗，濃度為1∶50，4 ℃孵育過(guò)夜，加入二抗，37 ℃孵育30 min，滴加二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木素復(fù)染后采用鹽酸乙醇分化，PBS 返藍(lán)，自然晾干后用樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察切片并拍照保存。采用Image-pro-plus6.0 進(jìn)行圖像分析，以平均光密度值分析LRP5 蛋白表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 6 組小鼠主動(dòng)脈組織形態(tài)學(xué)變化比較 模型組和ECH 12.5 mg/kg 組小鼠主動(dòng)脈管腔壁厚度不均，內(nèi)膜增厚明顯，局部發(fā)生嚴(yán)重鈣化，斑塊明顯突向管腔，組織彈力纖維排列紊亂，并伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。ECH 25、50 mg/kg 組及Sta 組中膜較模型組明顯變薄，彈力纖維排列整齊，斑塊明顯縮小，對(duì)照組小鼠血管結(jié)構(gòu)排列正常，主動(dòng)脈內(nèi)壁未發(fā)現(xiàn)明顯的平滑肌細(xì)胞增生，管腔未見(jiàn)膽固醇結(jié)晶形成，見(jiàn)圖1。

圖1 6 組小鼠主動(dòng)脈組織形態(tài)學(xué)變化的比較（A：模型組；B：ECH 12.5 mg/kg 組；C：ECH 25 mg/kg 組；D：ECH 50 mg/kg 組；E：Sta 組；F：對(duì)照組）

2.2 6 組小鼠血生化指標(biāo)的比較 6 組小鼠的血生化指標(biāo)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），其中模型組小鼠的TG、TC 及LDL-C 水平均高于對(duì)照組，HDLC 水平低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），ECH 25、50 mg/kg 組和Sta 組TG 水平均低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；ECH 12.5、25、50 mg/kg 組和Sta 組TC 水平均低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；ECH 12.5、25、50 mg/kg 組和Sta 組LDL-C 水平均低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；ECH 12.5、25、50 mg/kg 組和Sta 組HDLC 水平均高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001），見(jiàn)表1。

表1 6 組小鼠血生化指標(biāo)的比較

2.3 6 組小鼠主動(dòng)脈β-catenin mRNA 的比較 6 組小鼠主動(dòng)脈β-catenin mRNA 表達(dá)水平分別為2.01±0.11、1.68±0.05、1.35±0.07、1.01±0.06、0.86±0.05、0.82±0.03，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=188.925，P＜0.001）。其中模型組高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。ECH 12.5、25、50 mg/kg 組及Sta 組均低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.4 6 組小鼠主動(dòng)脈相關(guān)蛋白表達(dá)水平的比較 6 組小鼠主動(dòng)脈相關(guān)蛋白表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），其中模型組小鼠主動(dòng)脈β-catenin、Wnt3a、LRP5 及BMP-2 蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），ECH 25、50 mg/kg 組小鼠主動(dòng)脈β-catenin、Wnt3a、LRP5 及BMP-2 蛋白表達(dá)水平均低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；Sta 組小鼠主動(dòng)脈β-catenin、Wnt3a、LRP5 及BMP-2 蛋白表達(dá)水平亦低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=24.334、12.108、17.506、22.536，均P＜0.05），見(jiàn)表2 和圖2。

表2 6 組小鼠主動(dòng)脈相關(guān)蛋白表達(dá)水平的比較

圖2 6 組小鼠主動(dòng)脈相關(guān)蛋白表達(dá)的電泳圖

2.5 6 組小鼠主動(dòng)脈LRP5 蛋白表達(dá)水平的比較 6 組小鼠主動(dòng)脈LRP5 蛋白表達(dá)水平分別為0.35±0.01、0.25±0.03、0.17±0.03、0.15±0.02、0.16±0.03、0.07±0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=96.536，P＜0.001）。其中模型組小鼠高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。ECH 12.5、25、50 mg/kg 組及Sta 組均低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001），免疫組化檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 6 組小鼠主動(dòng)脈LRP5 蛋白表達(dá)免疫組化檢測(cè)所見(jiàn)（A：模型組；B：ECH 12.5 mg/kg 組；C：ECH 25 mg/kg 組；D：ECH 50 mg/kg組；E：Sta 組；F：對(duì)照組）

3 討論

血管鈣化被認(rèn)為是AS 的自然進(jìn)展過(guò)程，在臨床上是AS 的標(biāo)志。而目前對(duì)血管鈣化的防治效果不盡人意，因此探索新的血管鈣化防治藥物尤為重要。ECH在心血管等方面的藥理作用得到了廣泛關(guān)注，如具有清除自由基損傷、抗炎及免疫調(diào)節(jié)等生物活性。

脂質(zhì)代謝紊亂對(duì)AS 的發(fā)生與發(fā)展起決定性作用，血清中氧化型LDL（oxidized low density lipoprotein，OXLDL）的升高，HDL-C 降低，易于沉積在血管壁上，逐步演化為斑塊，最終導(dǎo)致AS 發(fā)生，因此對(duì)血脂水平的有效調(diào)控是預(yù)防AS 的重點(diǎn)工作，但是AS 發(fā)生后并不止步于此，血管平滑肌細(xì)胞中BMP-2 的大量表達(dá)激活了Wnt 信號(hào)通路并驅(qū)動(dòng)成骨程序，加速了AS 血管鈣化的進(jìn)一步發(fā)展。

本研究所采用的小鼠因其血脂代謝功能存在異常，可誘發(fā)多余的脂質(zhì)在血管內(nèi)堆積，從而自發(fā)形成動(dòng)AS 斑塊，通過(guò)高脂飼養(yǎng)可加快其血管內(nèi)斑塊的形成。HE 結(jié)果顯示，模型組和ECH 12.5 mg/kg 組小鼠主動(dòng)脈管腔壁厚度不均，內(nèi)膜增厚明顯，局部發(fā)生嚴(yán)重鈣化，斑塊明顯突向管腔，組織彈力纖維排列紊亂，并伴有炎性細(xì)胞。ECH 25、50 mg/kg 組及Sta 組中膜較模型組明顯變薄，彈力纖維排列整齊，斑塊明顯縮小，對(duì)照組小鼠血管結(jié)構(gòu)排列正常，主動(dòng)脈內(nèi)壁未發(fā)現(xiàn)明顯的平滑肌細(xì)胞增生，管腔未見(jiàn)膽固醇結(jié)晶形成，表明中、高劑量的ECH 對(duì)小鼠主動(dòng)脈有一定的保護(hù)作用。經(jīng)過(guò)ECH 干預(yù)之后，血清中TG、TC、LDL-C 表達(dá)水平低于模型組，HDL-C 表達(dá)水平高于模型組，提示ECH干預(yù)后能顯著逆轉(zhuǎn)AS 的脂質(zhì)異常。以上結(jié)果顯示，隨給藥物濃度的增加，ECH 的作用效果增加，且呈現(xiàn)出劑量依賴的關(guān)系，其中ECH 25、50 mg/kg 組對(duì)AS 小鼠有明顯的保護(hù)作用。

Wnt 信號(hào)通路在血管鈣化中的作用及其調(diào)控機(jī)制受到人們的廣泛關(guān)注，參與細(xì)胞增殖、分化、遷徙和侵襲[12-14]，Wnt3a、LRP5 和β-catenin 在已經(jīng)發(fā)生鈣化的主動(dòng)脈瓣中有較高的表達(dá)[15]，因此抑制該信號(hào)通路能夠達(dá)到阻礙成骨細(xì)胞增殖和分化，降低成骨細(xì)胞礦化活性。本研究中，模型組小鼠主動(dòng)脈β-catenin mRNA 表達(dá)水平高于對(duì)照組；ECH 12.5、25、50 mg/kg 組及Sta 組β-catenin 的mRNA 表達(dá)低于模型組，提示ECH 可以通過(guò)下調(diào)β-catenin 的表達(dá)來(lái)緩解AS 化造成的斑塊沉積。在蛋白表達(dá)測(cè)定中模型組小鼠主動(dòng)脈β-catenin、Wnt3a、LRP5 及BMP-2 蛋白的表達(dá)水平高于對(duì)照組，ECH 25、50 mg/kg 組小鼠主動(dòng)脈β-catenin、Wnt3a、LRP5 及BMP-2 蛋白的表達(dá)水平低于模型組，隨著劑量的增加，小鼠主動(dòng)脈Wnt3a、β-catenin 及LRP5 蛋白相對(duì)表達(dá)量呈逐步降低趨勢(shì)，提示ECH 可以通過(guò)下調(diào)β-catenin、Wnt3a、LRP5 及BMP-2 的表達(dá)來(lái)緩解血管鈣化的發(fā)生發(fā)展。有研究表明Wnt 信號(hào)細(xì)胞膜外的Wnt相關(guān)配體（如Wnt3a）與低密度脂蛋白受體蛋白5/6、跨膜受體卷曲蛋白相結(jié)合，經(jīng)過(guò)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的蓬亂蛋白與酪蛋白激酶1-α 進(jìn)行信號(hào)傳遞，激活了由軸蛋白/結(jié)腸腺瘤性蛋白/糖原合成酶激酶3β 結(jié)合物，從而促使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)聚集了大量β-catenin 且與T 細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子/淋巴增強(qiáng)因子結(jié)合后形成復(fù)合體，進(jìn)一步激活了下游靶基因，從而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄和成骨細(xì)胞凋亡，減緩血管鈣化的產(chǎn)物[16-17]。由此推測(cè)ECH 可能通過(guò)抑制Wnt 信號(hào)通路中的β-catenin、Wnt3a 與LRP5 從而對(duì)小鼠AS血管鈣化有一定改善作用。

綜上所述，本研究證明ECH 對(duì)小鼠AS 硬化血管鈣化具有一定的保護(hù)作用，可能與其抑制Wnt3a信號(hào)通路胞外Wnt3a與LRP5相關(guān)蛋白形成的受體復(fù)合物的結(jié)合有關(guān)，從而為AS血管鈣化的防控提供新的治療藥物。