• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    麝香酮調(diào)節(jié)cGAS-STING信號通路對缺血性腦卒中大鼠神經(jīng)炎癥的影響*

    2024-04-22 05:38:10張文想
    中醫(yī)藥導(dǎo)報 2024年3期
    關(guān)鍵詞:麝香海馬批號

    剛 瑛,丁 鵬,李 冰,張文想

    (北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院,北京 100700)

    缺血性腦卒中(ischemic stroke,IS)是由血栓形成或栓塞引起的腦血流中斷,是世界死亡和殘疾的主要原因之一,嚴(yán)重影響人類健康[1]。IS的病理生理機制包括離子失衡、氧化應(yīng)激、神經(jīng)炎癥和免疫細(xì)胞異常激活,可導(dǎo)致神經(jīng)元壞死和凋亡。其中炎癥反應(yīng)是腦缺血組織損傷的基礎(chǔ),大腦中發(fā)生炎癥后,小膠質(zhì)細(xì)胞或其他免疫細(xì)胞活化導(dǎo)致促炎性細(xì)胞因子釋放,促進白細(xì)胞浸潤并進入腦組織,導(dǎo)致免疫系統(tǒng)激活,參與IS進展并對疾病產(chǎn)生嚴(yán)重影響[2]。因此,抑制炎癥反應(yīng)對于改善IS預(yù)后至關(guān)重要。麝香酮是中藥麝香的主要成分,具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、神經(jīng)保護等作用。已有研究發(fā)現(xiàn),麝香酮不僅具有促進IS后神經(jīng)功能恢復(fù)的作用,還能減輕脊髓型頸椎病大鼠神經(jīng)炎癥和神經(jīng)元損傷[3-4]。環(huán)鳥苷酸-腺苷酸合成酶(cyclic GMP-AMP synthase,cGAS)作為胞質(zhì)DNA傳感器,在識別單鏈和雙鏈DNA后合成第二信使2'3'-cGAMP,結(jié)合并激活干擾素基因刺激蛋白(stimulator of interferon genes,STING)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和免疫失衡。cGAS可作為各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療靶點[5]。已有研究發(fā)現(xiàn)cGAS-STING通路的激活參與IS后神經(jīng)炎癥,因此抑制cGAS-STING通路可能有效緩解神經(jīng)炎癥相關(guān)損傷及相關(guān)神經(jīng)病理學(xué)[6]。在IS大鼠體內(nèi)麝香酮能否通過調(diào)節(jié)cGAS-STING信號通路改善神經(jīng)損傷和炎癥尚不清楚,因此本研究通過構(gòu)建IS大鼠模型,對其進行探討。

    1 材料與方法

    1.1 實驗材料 SPF級SD雄性大鼠60只,購自北京華阜康生物科技股份有限公司,生產(chǎn)許可證號為SCXK(京)2019-0008,實驗動物合格證號:SYXK(京)2020-0013。8周齡左右,體質(zhì)量(250±20)g,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,飼養(yǎng)環(huán)境溫度22 ℃左右,濕度55%,12 h光暗循環(huán),不禁水食。本研究通過我院動物倫理委員會批準(zhǔn)(批號:2021-00915)。

    1.2 藥品與試劑 麝香酮(純度≥98%,批號:541-91-3)購自上海麥克林生化科技有限公司;cGAS抑制劑RU.521(批號:HY-114180)、STING激動劑2′3′-cGAMP(批號:HY-100564)購自美國MedChemExpress公司;白細(xì)胞介素(IL)-1β酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(批號:EK-R36877)購自上海酶研生物科技公司;腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒(批號:ml002953)、IL-6 ELISA試劑盒(批號:ml064292)購自上海酶聯(lián)生物公司;蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(批號:60524ES60)購自上海翌圣生物公司;TTC染色液(批號:SBJ-0485)購自南京森貝伽生物科技有限公司;Nissl染色液(批號:R20625)購自上海源葉生物公司;TUNEL試劑盒(批號:E-CK-A320)購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限;一抗p-IRF3(批號:ab76493)、IRF3(批號:ab238521)、二抗辣根酶標(biāo)記山羊抗兔(批號:ab205719)購自美國Abcam公司;一抗IL-1β(批號:AB2915846)、TNF-α(批號:AB2204371)、cGAS(批號:AB2915749)、STING(批號:AB11153185)和β-actin抗體(批號:AB2792414)購自美國賽默飛世爾公司;RIPA裂解液(批號:SY4680)購自北京伊塔生物科技有限公司;ECL發(fā)光試劑盒(批號:abs920)購自上海愛必信生物科技有限公司。

    1.3 主要儀器 SpectraMax i3x多功能動酶標(biāo)儀(上海美谷分子儀器有限公司);CX41-12C02光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS公司);Phenom電子顯微鏡(上海復(fù)納科學(xué)儀器有限公司);HT165R離心機(湘儀離心機儀器有限公司);HY2508石蠟切片機(金華惠友儀器設(shè)備有限公司)。

    1.4 IS大鼠模型構(gòu)建 隨機選取50只大鼠,采用大腦中動脈閉塞(MCAO)法構(gòu)建IS大鼠模型[7],麻醉大鼠并保持每只大鼠直腸溫度在(36.5±0.5)℃,暴露大鼠右側(cè)頸總動脈結(jié)構(gòu)至分叉處,用6.0 mm絲線結(jié)扎頸外動脈遠(yuǎn)心端,另一絲線穿過頸外動脈并在頸總動脈分叉處附近打結(jié),使用動脈夾夾閉頸總動脈,將尼龍線插入頸外動脈、頸內(nèi)動脈并繼續(xù)進入大腦中動脈,缺血1 h后,去除線栓,縫合頸部傷口。對照組大鼠10只暴露頸總動脈結(jié)構(gòu)至分叉處,后縫合傷口,不進行其他操作。對各組大鼠進行Longa神經(jīng)功能評分,評分>1分表明MCAO模型構(gòu)建成功。

    1.5 大鼠分組和藥物干預(yù) 將SD大鼠分為對照組、MCAO組、MCAO+RU.521組、麝香酮組、麝香酮+2′3′-cGAMP組,除去死亡和建模失敗的大鼠,每組10只。MCAO后24 h,MCAO+RU.521組大鼠鼻內(nèi)給藥RU.521(450 μg/kg)溶解于1%二甲基亞石風(fēng)(DMSO)+玉米油[8],麝香酮組大鼠鼻內(nèi)給藥麝香酮(5 mg/kg)溶解于1% DMSO[3],麝香酮+2′3′-cGAMP組大鼠鼻內(nèi)給藥麝香酮(5 mg/kg)和2′3′-cGAMP(500 μg/kg)溶解于1%DMSO中[8],對照組和MCAO組大鼠給予相同劑量生理鹽水。1次/d,連續(xù)給藥7 d。

    1.6 觀察指標(biāo)

    1.6.1 神經(jīng)功能缺損評分 給藥結(jié)束后,對大鼠進行神經(jīng)功能評分:0分,無神經(jīng)功能缺損;1分,對側(cè)前肢無法伸展;2分,對側(cè)前肢嚴(yán)重屈曲;3分,走路時向?qū)?cè)傾斜;4分,沒有自主活動,意識障礙。評分范圍1~4分,分值越高表明神經(jīng)缺損越嚴(yán)重。

    1.6.2 TTC染色檢測腦梗死面積 神經(jīng)功能缺損評分后麻醉處死大鼠,取5只大鼠腦組織-20 ℃下冷凍,將腦冠狀面切片(約2 mm)在2% TTC溶液中染色30 min,翻轉(zhuǎn)數(shù)次,PBS沖洗,4%多聚甲醛固定2 h,拍照并計算相對腦梗死面積=梗死面積/總面積×100%。

    1.6.3 HE染色和Nissl染色觀察 取剩余5只大鼠海馬組織,固定于4%多聚甲醛中,石蠟包埋,切片(5 μm)后用HE染色、Nissl染色,在光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠海馬組織的病理變化和神經(jīng)元損傷。

    1.6.4 TUNEL法檢測神經(jīng)元凋亡 取大鼠海馬組織石蠟切片,按照TUNEL試劑盒說明書染色,4 ℃孵育過夜,洗滌后與熒光二抗在37 ℃下孵育1 h,并用DAPI進行核染,在顯微鏡下觀察拍照。

    1.6.5 ELISA法檢測炎癥因子水平 取大鼠海馬組織,剪切、研磨,離心取上清,按照ELISA試劑盒說明書,檢測炎證因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

    1.6.6 Western blotting法檢測蛋白表達(dá) 取大鼠海馬組織,用RIPA裂解,提取總蛋白,定量后按步驟進行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉封閉2 h,在4 ℃下加入一抗IL-1β、TNF-α、cGAS、STING、p-IRF3、IRF3(1:1 000)和內(nèi)參β-actin過夜孵育,清洗,在4 ℃下加入二抗山羊抗兔IgG(1:2 000),孵育2 h。用ECL發(fā)光顯影,觀察拍照,各條帶灰度值用Image J軟件處理分析。

    1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用GraphPad Prism 8.0軟件進行統(tǒng)計分析,數(shù)據(jù)采用(±s)表示,多組間比較用單因素方差分析,兩兩比較采用SNK-q檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較 與對照組比較,MCAO組大鼠神經(jīng)功能缺損評分升高(P<0.05);與MCAO組比較,MCAO+RU.521組、麝香酮組大鼠神經(jīng)功能缺損評分降低(P<0.05);MCAO+RU.521組大鼠神經(jīng)功能缺損評分與麝香酮組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與麝香酮組比較,麝香酮+2′3′-cGAMP組大鼠神經(jīng)功能缺損評分升高(P<0.05)。(見圖1)

    圖1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較 (±s,n=10)

    2.2 各組大鼠TTC染色腦梗死面積比較 與對照組比較,MCAO組大鼠腦梗死面積顯著升高(P<0.05);與MCAO組比較,MCAO+RU.521組、麝香酮組大鼠腦梗死面積顯著降低(P<0.05);MCAO+RU.521組大鼠腦梗死面積與麝香酮組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與麝香酮組比較,麝香酮+2′3′-cGAMP組大鼠腦梗死面積顯著升高(P<0.05)。(見圖2~3)

    圖2 大鼠TTC 染色腦梗死面積比較 (±s,n=5)

    圖3 各組大鼠腦組織TTC 染色結(jié)果

    2.3 各組大鼠HE染色和Nissl染色結(jié)果比較 HE染色顯示,對照組大鼠海馬組織神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)正常,細(xì)胞排列緊密,細(xì)胞核仁清晰且胞質(zhì)豐富;MCAO組大鼠海馬組織神經(jīng)元細(xì)胞皺縮,細(xì)胞排列松散且腫脹;與MCAO組比較,MCAO+RU.521組、麝香酮組大鼠海馬組織神經(jīng)元病理損傷減輕,形態(tài)有所恢復(fù),細(xì)胞變異程度減輕;與麝香酮組比較,麝香酮+2′3′-cGAMP組大鼠海馬組織神經(jīng)元病理損傷加重。Nissl染色顯示,對照組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常,Nissl體豐富;MCAO組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞萎縮,核質(zhì)固縮,Nissl體顯著減少;MCAO+RU.521組、麝香酮組大鼠海馬組織神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)有所恢復(fù),Nissl體增加;麝香酮+2′3′-cGAMP組大鼠海馬組織神經(jīng)元細(xì)胞損傷程度較麝香酮組加重。(見圖4)

    圖4 大鼠海馬組織HE 染色和Nissl 染色結(jié)果 (×400)

    2.4 各組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況比較 與對照組比較,MCAO組海馬組織神經(jīng)元凋亡數(shù)目增加,凋亡率顯著升高(P<0.05);與MCAO組比較,MCAO+RU.521組、麝香酮組神經(jīng)元凋亡數(shù)目減少,凋亡率顯著降低(P<0.05);MCAO+RU.521組神經(jīng)元凋亡數(shù)目和凋亡率與麝香酮組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與麝香酮組比較,麝香酮+2′3′-cGAMP組神經(jīng)元凋亡數(shù)目增加,凋亡率顯著升高(P<0.05)。(見圖5~6)

    圖5 大鼠海馬組織TUNEL 染色結(jié)果 (×400)

    圖6 各組大鼠神經(jīng)元凋亡率比較 (±s,n=10)

    2.5 各組大鼠炎癥因子水平比較 與對照組比較,MCAO組大鼠海馬組織IL-6、IL-1β、TNF-α水平顯著升高(P<0.05);與MCAO組比較,MCAO+RU.521組、麝香酮組大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α水平顯著降低(P<0.05);MCAO+RU.521組大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α水平與麝香酮組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與麝香酮組比較,麝香酮+2′3′-cGAMP組大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α水平顯著升高(P<0.05)。(見圖7)

    圖7 各組大鼠炎癥因子水平比較 (±s,n=10)

    2.6 各組大鼠海馬組織蛋白表達(dá)比較 與對照組比較,MCAO組大鼠海馬組織IL-1β、TNF-α、cGAS、STING、p-IRF3蛋白相對表達(dá)量顯著升高(P<0.05);與MCAO組比較,MCAO+RU.521組、麝香酮組大鼠IL-1β、TNF-α、cGAS、STING、p-IRF3蛋白相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05);MCAO+RU.521組大鼠各蛋白相對表達(dá)量與麝香酮組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與麝香酮組比較,麝香酮+2′3′-cGAMP組大鼠IL-1β、TNF-α、cGAS、STING、p-IRF3蛋白相對表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。(見圖8~9)

    圖8 大鼠海馬組織蛋白表達(dá)Western blotting 圖

    圖9 各組大鼠海馬組織蛋白相對表達(dá)量比較 (±s,n=5)

    3 討論

    IS是一種常見的腦血管疾病,主要是由大腦血管突然阻塞,從而限制相關(guān)區(qū)域的血液流動或供應(yīng)引起的,其中中風(fēng)會增加認(rèn)知缺陷、長期殘疾、抑郁和癡呆的風(fēng)險,嚴(yán)重影響人類健康狀況和生活質(zhì)量[9]。目前IS的主要臨床治療措施是溶栓、血栓切除術(shù)、抗血小板聚集和神經(jīng)營養(yǎng)等,以盡快恢復(fù)缺血區(qū)的腦血流和神經(jīng)功能,但這些療法的使用受時間窗口和出血風(fēng)險的限制。神經(jīng)炎癥是IS的主要病理過程。IS導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞死亡,使小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞過度活化,釋放出高水平的炎癥因子如IL-6、IL-1β和TNF-α,并促進白細(xì)胞進入腦組織,產(chǎn)生炎癥級聯(lián)反應(yīng),促進更多神經(jīng)元死亡并加重腦損傷[10]。HAN B等[11]發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞PGC-1α通過抑制神經(jīng)炎癥來防止IS后腦損傷;ZHANG Y等[12]也發(fā)現(xiàn)SerpinA3N通過減少細(xì)胞凋亡和神經(jīng)炎癥可減輕IS后腦損傷。因此,在IS后抑制炎癥反應(yīng)可緩解腦損傷。

    本研究通過使用MCAO法構(gòu)建IS大鼠模型發(fā)現(xiàn),MCAO組大鼠神經(jīng)功能缺損評分和腦梗死面積顯著升高,海馬組織神經(jīng)元細(xì)胞皺縮損傷,Nissl體減少,且神經(jīng)元凋亡數(shù)目增加,表明MCAO組大鼠出現(xiàn)嚴(yán)重神經(jīng)功能損傷。且海馬組織IL-6、IL-1β、TNF-α含量顯著升高,表明MCAO組大鼠出現(xiàn)神經(jīng)炎癥。麝香酮在腦血管疾病中具有神經(jīng)保護作用,包括抗氧化應(yīng)激、抗缺血性損傷、抗凋亡、抗炎和觸發(fā)神經(jīng)保護等。其中麝香酮通過作為神經(jīng)保護和促血管生成劑起到對急性腦缺血再灌注損傷的保護作用[13];麝香酮還能通過減少神經(jīng)元壞死,保護血腦屏障,改善腦缺血引起的神經(jīng)損傷[14]。本研究通過選用麝香酮鼻內(nèi)給藥的方式對MCAO組大鼠進行治療。鼻內(nèi)給藥使麝香酮能直接通過鼻黏膜或肺部的毛細(xì)血管吸收,通過鼻黏膜-腦脊液途徑直接進入腦脊液,繞過血腦屏障直接遞送到腦。麝香酮鼻腔給藥具有生物利用度高、見效快、安全、有效等特點[15]。本研究發(fā)現(xiàn),MCAO組大鼠經(jīng)麝香酮治療后,神經(jīng)功能缺損評分和腦梗死面積降低,海馬組織神經(jīng)元損傷得到改善,Nissl體增加,且神經(jīng)元凋亡數(shù)目和IL-6、IL-1β、TNF-α含量減少,表明麝香酮對MCAO組大鼠神經(jīng)元功能障礙和神經(jīng)炎癥具有改善作用。

    胞質(zhì)dsDNA已被證明可激活炎癥和免疫反應(yīng)。cGAS是一種關(guān)鍵的胞質(zhì)DNA傳感器,可通過合成cGAMP激活STING,觸發(fā)由STING級聯(lián)介導(dǎo)的下游促炎信號,同時炎癥因子可激活I(lǐng)RF3、NF-κB等途徑,因此cGAS-STING通路的激活被認(rèn)為與神經(jīng)病理生理學(xué)密切相關(guān)[16]。已有研究發(fā)現(xiàn)cGAS-STING參與創(chuàng)傷性腦損傷[17]、肌萎縮側(cè)索硬化癥[18]、阿爾茨海默病[19]等多種動物模型中的神經(jīng)炎癥。cGAS-STING也與IS后的腦損傷和神經(jīng)炎癥密切相關(guān)。抑制cGAS或cGAS缺失均會減弱IS后的神經(jīng)炎癥,改善腦損傷[20-21]。本研究發(fā)現(xiàn),MCAO組大鼠海馬組織cGAS、STING、p-IRF3蛋白表達(dá)顯著升高,表明IS可能激活cGAS-STING信號通路,參與其腦損傷和神經(jīng)炎癥;而麝香酮治療后cGAS、STING、p-IRF3蛋白表達(dá)降低,麝香酮可能通過抑制cGAS-STING信號通路的激活,改善MCAO組大鼠腦損傷和神經(jīng)炎癥。為進一步驗證麝香酮對cGAS-STING信號通路的干預(yù)作用,本研究在MCAO的基礎(chǔ)上加上cGAS抑制劑RU.521,其作用與麝香酮對神經(jīng)損傷的改善作用一致,表明麝香酮可能發(fā)揮cGAS抑制劑的作用;此外,本研究在麝香酮基礎(chǔ)上加上STING激動劑2′3′-cGAMP,麝香酮對神經(jīng)損傷的改善作用受到抑制,因此麝香酮可能抑制cGAS-STING信號通路激活發(fā)揮作用。

    綜上所述,麝香酮可能通過抑制cGAS-STING信號通路激活,減少神經(jīng)元損傷,改善IS大鼠神經(jīng)炎癥。本研究為改善IS大鼠神經(jīng)損傷和神經(jīng)炎癥提供了新思路,但麝香酮對IS大鼠的其他分子機制仍有待闡明。

    猜你喜歡
    麝香海馬批號
    一種JTIDS 信號批號的離線合批方法
    海馬
    麝香保心丸
    麝香保心丸
    海馬
    醫(yī)學(xué)科技期刊中藥品生產(chǎn)批號標(biāo)注探析
    勐臘毛麝香化學(xué)成分研究
    中藥材批號劃分與質(zhì)量管理
    中成藥(2018年7期)2018-08-04 06:04:26
    “海馬”自述
    海馬
    免费观看性生交大片5| 极品人妻少妇av视频| 伦理电影大哥的女人| 亚洲国产精品国产精品| 国产精品久久久久久精品古装| 22中文网久久字幕| 亚洲av综合色区一区| 99热网站在线观看| 国产免费现黄频在线看| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 看非洲黑人一级黄片| 国产精品国产av在线观看| 九色亚洲精品在线播放| 中文字幕av电影在线播放| 国产成人aa在线观看| 黑人猛操日本美女一级片| 欧美精品一区二区免费开放| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 国产精品人妻久久久久久| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 丝瓜视频免费看黄片| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 免费大片18禁| 少妇的逼好多水| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 亚洲欧美色中文字幕在线| 人妻人人澡人人爽人人| 一级毛片电影观看| 免费高清在线观看视频在线观看| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 人人妻人人澡人人看| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 丰满饥渴人妻一区二区三| 久久久久久久精品精品| 亚洲欧洲国产日韩| 亚洲av中文av极速乱| 免费大片黄手机在线观看| 亚洲久久久国产精品| 不卡视频在线观看欧美| 亚洲,欧美,日韩| 亚洲国产精品999| 国产伦理片在线播放av一区| 午夜视频国产福利| tube8黄色片| 国产高清有码在线观看视频| 精品国产乱码久久久久久小说| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| a级毛片黄视频| av卡一久久| 欧美另类一区| 欧美日韩精品成人综合77777| 亚洲精品视频女| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产精品久久久久久久电影| 免费高清在线观看日韩| 岛国毛片在线播放| 久久精品国产亚洲av涩爱| 成人午夜精彩视频在线观看| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 亚洲图色成人| 91精品国产九色| 一级a做视频免费观看| 男女免费视频国产| 欧美日本中文国产一区发布| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 一级a做视频免费观看| 大香蕉久久成人网| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 亚洲第一av免费看| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 日韩成人伦理影院| 亚洲精品一二三| 国产精品国产av在线观看| 蜜桃在线观看..| 国产精品国产av在线观看| 日韩一区二区视频免费看| 中文字幕久久专区| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 青春草国产在线视频| 亚洲精品av麻豆狂野| 亚洲伊人久久精品综合| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 丝袜在线中文字幕| 亚洲欧美清纯卡通| 丰满乱子伦码专区| 亚洲怡红院男人天堂| 国产免费福利视频在线观看| 性高湖久久久久久久久免费观看| 久久毛片免费看一区二区三区| videos熟女内射| 国产爽快片一区二区三区| 亚洲四区av| 亚洲情色 制服丝袜| 日韩中文字幕视频在线看片| 中文欧美无线码| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 国产精品99久久久久久久久| 人妻一区二区av| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 久久97久久精品| 一二三四中文在线观看免费高清| av卡一久久| 国产亚洲精品久久久com| 在线观看美女被高潮喷水网站| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 日本免费在线观看一区| 亚洲精品自拍成人| 最新的欧美精品一区二区| 久久热精品热| 国产在线视频一区二区| 在线播放无遮挡| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 99re6热这里在线精品视频| 成人免费观看视频高清| 少妇高潮的动态图| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 精品人妻偷拍中文字幕| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 国产精品偷伦视频观看了| 观看av在线不卡| 草草在线视频免费看| 欧美bdsm另类| 国产在线免费精品| 精品人妻一区二区三区麻豆| 免费黄网站久久成人精品| 国模一区二区三区四区视频| 亚洲综合色网址| 亚洲国产av影院在线观看| 熟女电影av网| 久久这里有精品视频免费| 2021少妇久久久久久久久久久| 久久精品久久精品一区二区三区| av一本久久久久| 亚洲精品日韩av片在线观看| 日韩av在线免费看完整版不卡| www.av在线官网国产| 国产成人freesex在线| 91精品三级在线观看| 女人久久www免费人成看片| 老司机影院毛片| 国产有黄有色有爽视频| 国产av码专区亚洲av| 免费看不卡的av| 伊人久久国产一区二区| 欧美3d第一页| 人妻人人澡人人爽人人| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 97超视频在线观看视频| 国产熟女午夜一区二区三区 | 校园人妻丝袜中文字幕| 丰满乱子伦码专区| 多毛熟女@视频| 多毛熟女@视频| 一级毛片电影观看| 国产亚洲最大av| 国产片内射在线| av又黄又爽大尺度在线免费看| www.色视频.com| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 精品视频人人做人人爽| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 国产伦理片在线播放av一区| 精品亚洲成国产av| 久久国内精品自在自线图片| av国产精品久久久久影院| 校园人妻丝袜中文字幕| 黄色毛片三级朝国网站| 2021少妇久久久久久久久久久| 成年人午夜在线观看视频| 国产亚洲精品久久久com| 下体分泌物呈黄色| 亚洲成人一二三区av| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 欧美97在线视频| 亚洲国产日韩一区二区| 久久久久国产网址| 精品熟女少妇av免费看| 久久久午夜欧美精品| 少妇人妻 视频| 国产亚洲欧美精品永久| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 99九九在线精品视频| 久久久久国产精品人妻一区二区| 国产日韩欧美视频二区| 免费观看在线日韩| 尾随美女入室| 国产精品一区二区在线观看99| 日韩电影二区| 丝瓜视频免费看黄片| 亚洲不卡免费看| 欧美精品亚洲一区二区| 秋霞在线观看毛片| 精品卡一卡二卡四卡免费| 国产综合精华液| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 黄色怎么调成土黄色| 美女内射精品一级片tv| 最近的中文字幕免费完整| 99久久人妻综合| 国产精品人妻久久久久久| 女人久久www免费人成看片| 最新的欧美精品一区二区| 我的女老师完整版在线观看| 国产av国产精品国产| 女性被躁到高潮视频| 亚洲精品第二区| 久久精品国产亚洲av天美| 老女人水多毛片| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 国产av码专区亚洲av| 岛国毛片在线播放| 99re6热这里在线精品视频| 男女无遮挡免费网站观看| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 青春草视频在线免费观看| 午夜免费观看性视频| 热99久久久久精品小说推荐| 午夜免费男女啪啪视频观看| 十八禁高潮呻吟视频| 青春草视频在线免费观看| 国产淫语在线视频| 国产淫语在线视频| 久久这里有精品视频免费| 伦精品一区二区三区| 黄色一级大片看看| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 欧美日韩在线观看h| 亚州av有码| 热re99久久国产66热| 热re99久久精品国产66热6| 夜夜爽夜夜爽视频| 免费高清在线观看日韩| 我的老师免费观看完整版| 免费高清在线观看日韩| 中文字幕人妻丝袜制服| 美女大奶头黄色视频| 亚洲天堂av无毛| 激情五月婷婷亚洲| 久久国内精品自在自线图片| 精品人妻熟女av久视频| 亚洲精品中文字幕在线视频| 老女人水多毛片| 少妇高潮的动态图| av在线观看视频网站免费| 一级片'在线观看视频| 久久午夜福利片| 国产精品一二三区在线看| 久久久国产欧美日韩av| 在线精品无人区一区二区三| 亚洲精品aⅴ在线观看| 国产一区二区在线观看日韩| 搡老乐熟女国产| 熟女人妻精品中文字幕| 伊人久久国产一区二区| 看十八女毛片水多多多| 午夜日本视频在线| 男女免费视频国产| 亚洲精品,欧美精品| 男女啪啪激烈高潮av片| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 两个人的视频大全免费| 精品国产一区二区久久| 亚洲精品日韩av片在线观看| 国产成人免费观看mmmm| 欧美另类一区| 亚洲,一卡二卡三卡| 大香蕉97超碰在线| 久久精品国产亚洲av涩爱| 国产精品 国内视频| 亚洲精品色激情综合| 成人无遮挡网站| 999精品在线视频| 久久精品国产亚洲av涩爱| 国产黄频视频在线观看| 国产精品一区二区在线不卡| 免费日韩欧美在线观看| 亚洲少妇的诱惑av| 亚洲国产精品999| 久久久久久久久久久免费av| 三级国产精品欧美在线观看| 国产精品 国内视频| 91aial.com中文字幕在线观看| 国产一区二区在线观看日韩| 女人精品久久久久毛片| 国产亚洲最大av| 国产免费一区二区三区四区乱码| 国产 精品1| av.在线天堂| 成人黄色视频免费在线看| 成人国产av品久久久| 在线观看国产h片| 99九九在线精品视频| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 一级爰片在线观看| 国产午夜精品一二区理论片| 免费高清在线观看日韩| 国产一区二区在线观看日韩| 国产精品女同一区二区软件| 一级黄片播放器| 亚洲丝袜综合中文字幕| 男女免费视频国产| 各种免费的搞黄视频| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 晚上一个人看的免费电影| 国产探花极品一区二区| 日本与韩国留学比较| 观看av在线不卡| 日韩中文字幕视频在线看片| 国产av国产精品国产| 婷婷成人精品国产| tube8黄色片| 国产熟女欧美一区二区| 精品国产一区二区久久| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 久久国内精品自在自线图片| 国产乱人偷精品视频| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 国产精品无大码| 青春草亚洲视频在线观看| 在线免费观看不下载黄p国产| 欧美97在线视频| 人妻夜夜爽99麻豆av| 777米奇影视久久| 日本欧美国产在线视频| av在线老鸭窝| 国产av码专区亚洲av| 五月玫瑰六月丁香| 99久国产av精品国产电影| 老女人水多毛片| 男人添女人高潮全过程视频| 久久毛片免费看一区二区三区| 亚洲中文av在线| 国产成人精品久久久久久| 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲美女视频黄频| 黑人猛操日本美女一级片| 久久 成人 亚洲| a级毛片黄视频| 老熟女久久久| 热99久久久久精品小说推荐| 母亲3免费完整高清在线观看 | 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 亚洲成人手机| 国产在线一区二区三区精| 国产av精品麻豆| 久久久久视频综合| 99久国产av精品国产电影| 精品亚洲成a人片在线观看| 在线天堂最新版资源| 黑人高潮一二区| 人妻少妇偷人精品九色| 成人午夜精彩视频在线观看| 在线天堂最新版资源| 人人妻人人澡人人看| 91在线精品国自产拍蜜月| 少妇 在线观看| 免费看不卡的av| 欧美日韩综合久久久久久| 91aial.com中文字幕在线观看| 国产片内射在线| 亚洲精品成人av观看孕妇| 久久这里有精品视频免费| 永久网站在线| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 亚洲成人手机| 久久精品国产a三级三级三级| 久久久国产精品麻豆| 精品久久久久久久久亚洲| 天堂8中文在线网| 久久久久国产精品人妻一区二区| 亚洲丝袜综合中文字幕| 91久久精品电影网| 久久久久视频综合| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 成人二区视频| 亚洲久久久国产精品| 3wmmmm亚洲av在线观看| 黄色毛片三级朝国网站| 国产乱人偷精品视频| 亚洲欧美精品自产自拍| 欧美国产精品一级二级三级| 在线观看www视频免费| 伊人久久精品亚洲午夜| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 2021少妇久久久久久久久久久| h视频一区二区三区| 高清黄色对白视频在线免费看| 日韩大片免费观看网站| 国产成人免费无遮挡视频| 99热这里只有是精品在线观看| 午夜免费观看性视频| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 国精品久久久久久国模美| av黄色大香蕉| 久久热精品热| 青春草亚洲视频在线观看| 国产成人aa在线观看| 亚洲精品久久成人aⅴ小说 | 永久免费av网站大全| 有码 亚洲区| 日本黄色片子视频| 大话2 男鬼变身卡| 亚洲国产精品成人久久小说| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 人体艺术视频欧美日本| 99久久中文字幕三级久久日本| 午夜福利影视在线免费观看| 欧美一级a爱片免费观看看| 国产免费一级a男人的天堂| 国产片内射在线| 日本黄色片子视频| 国产在线视频一区二区| 亚洲欧洲国产日韩| 国模一区二区三区四区视频| av在线老鸭窝| 成人毛片60女人毛片免费| √禁漫天堂资源中文www| 少妇熟女欧美另类| 熟女av电影| 国产黄频视频在线观看| 青春草亚洲视频在线观看| 国产精品久久久久久精品古装| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 国产高清三级在线| 午夜福利网站1000一区二区三区| 久久久久人妻精品一区果冻| 成人二区视频| 成人免费观看视频高清| av天堂久久9| 精品亚洲成a人片在线观看| 91国产中文字幕| 在现免费观看毛片| videosex国产| 9色porny在线观看| 日韩视频在线欧美| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 婷婷色综合www| 少妇高潮的动态图| 一级二级三级毛片免费看| 成年av动漫网址| 日韩人妻高清精品专区| 日日摸夜夜添夜夜爱| 久久久欧美国产精品| 日本wwww免费看| 少妇熟女欧美另类| 老司机影院毛片| 男女高潮啪啪啪动态图| 亚洲国产欧美日韩在线播放| av.在线天堂| 日日摸夜夜添夜夜爱| 久久婷婷青草| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 成年人免费黄色播放视频| 色吧在线观看| 国产精品久久久久久久久免| 高清午夜精品一区二区三区| 亚洲情色 制服丝袜| 极品少妇高潮喷水抽搐| 日韩人妻高清精品专区| 高清不卡的av网站| 日本91视频免费播放| a级毛片在线看网站| av国产精品久久久久影院| 国产免费视频播放在线视频| 久久综合国产亚洲精品| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 日韩一本色道免费dvd| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 极品少妇高潮喷水抽搐| 伊人亚洲综合成人网| 久久99热这里只频精品6学生| 精品亚洲成国产av| 街头女战士在线观看网站| 亚洲精品国产av成人精品| 熟女av电影| 精品久久蜜臀av无| 中文字幕亚洲精品专区| 久久久亚洲精品成人影院| 久久国产亚洲av麻豆专区| 成年女人在线观看亚洲视频| 国产一区二区在线观看av| 亚洲精品视频女| 久久99精品国语久久久| 美女cb高潮喷水在线观看| 国产精品人妻久久久久久| 成人国产麻豆网| 丝袜脚勾引网站| 九草在线视频观看| 国产成人精品婷婷| 晚上一个人看的免费电影| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 亚洲情色 制服丝袜| videos熟女内射| 免费人妻精品一区二区三区视频| 能在线免费看毛片的网站| 99re6热这里在线精品视频| 久久久国产一区二区| 18禁观看日本| 最新的欧美精品一区二区| 国产在视频线精品| 精品少妇黑人巨大在线播放| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 中文字幕av电影在线播放| 一边摸一边做爽爽视频免费| 免费av不卡在线播放| 中文字幕最新亚洲高清| 一个人免费看片子| 国产精品一国产av| 人妻少妇偷人精品九色| 黑丝袜美女国产一区| 综合色丁香网| av专区在线播放| 99热网站在线观看| 如何舔出高潮| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 美女内射精品一级片tv| 国产精品人妻久久久久久| 亚洲内射少妇av| 免费少妇av软件| 少妇人妻久久综合中文| 蜜桃国产av成人99| 欧美精品一区二区免费开放| 九色亚洲精品在线播放| 亚洲av日韩在线播放| 插阴视频在线观看视频| 性高湖久久久久久久久免费观看| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 国产色婷婷99| 亚洲美女视频黄频| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 美女福利国产在线| 97超碰精品成人国产| 亚洲av.av天堂| 中文字幕亚洲精品专区| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 精品一区二区三区视频在线| 久久国产精品大桥未久av| 一区二区三区四区激情视频| 亚洲性久久影院| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 国产色爽女视频免费观看| 日本色播在线视频| 最近的中文字幕免费完整| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 日日爽夜夜爽网站| 日韩在线高清观看一区二区三区| 黑人高潮一二区| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 成人手机av| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 欧美xxⅹ黑人| 亚洲国产最新在线播放| 人妻制服诱惑在线中文字幕| av一本久久久久| 日本欧美视频一区| 日日撸夜夜添| 欧美成人午夜免费资源| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕 | 69精品国产乱码久久久| 亚洲五月色婷婷综合| 高清黄色对白视频在线免费看| 亚洲国产最新在线播放| 五月开心婷婷网| 久久99热这里只频精品6学生| 国产成人午夜福利电影在线观看| 亚洲综合色网址| 国产高清三级在线| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 18禁观看日本| 成人黄色视频免费在线看| 在线观看www视频免费| 亚洲精品亚洲一区二区| 狂野欧美激情性bbbbbb| 亚洲av欧美aⅴ国产| 在现免费观看毛片| 久久99一区二区三区| 国产精品熟女久久久久浪| 中文字幕人妻丝袜制服| 婷婷色综合www| 大陆偷拍与自拍| 亚洲高清免费不卡视频| videosex国产| 国产免费视频播放在线视频| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 人人澡人人妻人| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 国产精品免费大片| 成年女人在线观看亚洲视频| 亚洲内射少妇av| 精品人妻在线不人妻| 97在线视频观看| 免费看不卡的av| 一级二级三级毛片免费看| 国产毛片在线视频| 国产精品女同一区二区软件| 午夜福利,免费看| 国产综合精华液| 亚洲,欧美,日韩| 国产黄片视频在线免费观看| 99国产精品免费福利视频| 久久精品久久精品一区二区三区| 在线精品无人区一区二区三| 国产综合精华液| 国产精品99久久久久久久久| 视频中文字幕在线观看| 国产精品99久久久久久久久| 观看美女的网站| 亚洲国产日韩一区二区|