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    麝香酮調(diào)節(jié)cGAS-STING信號通路對缺血性腦卒中大鼠神經(jīng)炎癥的影響*

    2024-04-22 05:38:10張文想
    中醫(yī)藥導(dǎo)報 2024年3期
    關(guān)鍵詞:麝香海馬批號

    剛 瑛,丁 鵬,李 冰,張文想

    (北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院,北京 100700)

    缺血性腦卒中(ischemic stroke,IS)是由血栓形成或栓塞引起的腦血流中斷,是世界死亡和殘疾的主要原因之一,嚴(yán)重影響人類健康[1]。IS的病理生理機制包括離子失衡、氧化應(yīng)激、神經(jīng)炎癥和免疫細(xì)胞異常激活,可導(dǎo)致神經(jīng)元壞死和凋亡。其中炎癥反應(yīng)是腦缺血組織損傷的基礎(chǔ),大腦中發(fā)生炎癥后,小膠質(zhì)細(xì)胞或其他免疫細(xì)胞活化導(dǎo)致促炎性細(xì)胞因子釋放,促進白細(xì)胞浸潤并進入腦組織,導(dǎo)致免疫系統(tǒng)激活,參與IS進展并對疾病產(chǎn)生嚴(yán)重影響[2]。因此,抑制炎癥反應(yīng)對于改善IS預(yù)后至關(guān)重要。麝香酮是中藥麝香的主要成分,具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、神經(jīng)保護等作用。已有研究發(fā)現(xiàn),麝香酮不僅具有促進IS后神經(jīng)功能恢復(fù)的作用,還能減輕脊髓型頸椎病大鼠神經(jīng)炎癥和神經(jīng)元損傷[3-4]。環(huán)鳥苷酸-腺苷酸合成酶(cyclic GMP-AMP synthase,cGAS)作為胞質(zhì)DNA傳感器,在識別單鏈和雙鏈DNA后合成第二信使2'3'-cGAMP,結(jié)合并激活干擾素基因刺激蛋白(stimulator of interferon genes,STING)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和免疫失衡。cGAS可作為各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療靶點[5]。已有研究發(fā)現(xiàn)cGAS-STING通路的激活參與IS后神經(jīng)炎癥,因此抑制cGAS-STING通路可能有效緩解神經(jīng)炎癥相關(guān)損傷及相關(guān)神經(jīng)病理學(xué)[6]。在IS大鼠體內(nèi)麝香酮能否通過調(diào)節(jié)cGAS-STING信號通路改善神經(jīng)損傷和炎癥尚不清楚,因此本研究通過構(gòu)建IS大鼠模型,對其進行探討。

    1 材料與方法

    1.1 實驗材料 SPF級SD雄性大鼠60只,購自北京華阜康生物科技股份有限公司,生產(chǎn)許可證號為SCXK(京)2019-0008,實驗動物合格證號:SYXK(京)2020-0013。8周齡左右,體質(zhì)量(250±20)g,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,飼養(yǎng)環(huán)境溫度22 ℃左右,濕度55%,12 h光暗循環(huán),不禁水食。本研究通過我院動物倫理委員會批準(zhǔn)(批號:2021-00915)。

    1.2 藥品與試劑 麝香酮(純度≥98%,批號:541-91-3)購自上海麥克林生化科技有限公司;cGAS抑制劑RU.521(批號:HY-114180)、STING激動劑2′3′-cGAMP(批號:HY-100564)購自美國MedChemExpress公司;白細(xì)胞介素(IL)-1β酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(批號:EK-R36877)購自上海酶研生物科技公司;腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒(批號:ml002953)、IL-6 ELISA試劑盒(批號:ml064292)購自上海酶聯(lián)生物公司;蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(批號:60524ES60)購自上海翌圣生物公司;TTC染色液(批號:SBJ-0485)購自南京森貝伽生物科技有限公司;Nissl染色液(批號:R20625)購自上海源葉生物公司;TUNEL試劑盒(批號:E-CK-A320)購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限;一抗p-IRF3(批號:ab76493)、IRF3(批號:ab238521)、二抗辣根酶標(biāo)記山羊抗兔(批號:ab205719)購自美國Abcam公司;一抗IL-1β(批號:AB2915846)、TNF-α(批號:AB2204371)、cGAS(批號:AB2915749)、STING(批號:AB11153185)和β-actin抗體(批號:AB2792414)購自美國賽默飛世爾公司;RIPA裂解液(批號:SY4680)購自北京伊塔生物科技有限公司;ECL發(fā)光試劑盒(批號:abs920)購自上海愛必信生物科技有限公司。

    1.3 主要儀器 SpectraMax i3x多功能動酶標(biāo)儀(上海美谷分子儀器有限公司);CX41-12C02光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS公司);Phenom電子顯微鏡(上海復(fù)納科學(xué)儀器有限公司);HT165R離心機(湘儀離心機儀器有限公司);HY2508石蠟切片機(金華惠友儀器設(shè)備有限公司)。

    1.4 IS大鼠模型構(gòu)建 隨機選取50只大鼠,采用大腦中動脈閉塞(MCAO)法構(gòu)建IS大鼠模型[7],麻醉大鼠并保持每只大鼠直腸溫度在(36.5±0.5)℃,暴露大鼠右側(cè)頸總動脈結(jié)構(gòu)至分叉處,用6.0 mm絲線結(jié)扎頸外動脈遠(yuǎn)心端,另一絲線穿過頸外動脈并在頸總動脈分叉處附近打結(jié),使用動脈夾夾閉頸總動脈,將尼龍線插入頸外動脈、頸內(nèi)動脈并繼續(xù)進入大腦中動脈,缺血1 h后,去除線栓,縫合頸部傷口。對照組大鼠10只暴露頸總動脈結(jié)構(gòu)至分叉處,后縫合傷口,不進行其他操作。對各組大鼠進行Longa神經(jīng)功能評分,評分>1分表明MCAO模型構(gòu)建成功。

    1.5 大鼠分組和藥物干預(yù) 將SD大鼠分為對照組、MCAO組、MCAO+RU.521組、麝香酮組、麝香酮+2′3′-cGAMP組,除去死亡和建模失敗的大鼠,每組10只。MCAO后24 h,MCAO+RU.521組大鼠鼻內(nèi)給藥RU.521(450 μg/kg)溶解于1%二甲基亞石風(fēng)(DMSO)+玉米油[8],麝香酮組大鼠鼻內(nèi)給藥麝香酮(5 mg/kg)溶解于1% DMSO[3],麝香酮+2′3′-cGAMP組大鼠鼻內(nèi)給藥麝香酮(5 mg/kg)和2′3′-cGAMP(500 μg/kg)溶解于1%DMSO中[8],對照組和MCAO組大鼠給予相同劑量生理鹽水。1次/d,連續(xù)給藥7 d。

    1.6 觀察指標(biāo)

    1.6.1 神經(jīng)功能缺損評分 給藥結(jié)束后,對大鼠進行神經(jīng)功能評分:0分,無神經(jīng)功能缺損;1分,對側(cè)前肢無法伸展;2分,對側(cè)前肢嚴(yán)重屈曲;3分,走路時向?qū)?cè)傾斜;4分,沒有自主活動,意識障礙。評分范圍1~4分,分值越高表明神經(jīng)缺損越嚴(yán)重。

    1.6.2 TTC染色檢測腦梗死面積 神經(jīng)功能缺損評分后麻醉處死大鼠,取5只大鼠腦組織-20 ℃下冷凍,將腦冠狀面切片(約2 mm)在2% TTC溶液中染色30 min,翻轉(zhuǎn)數(shù)次,PBS沖洗,4%多聚甲醛固定2 h,拍照并計算相對腦梗死面積=梗死面積/總面積×100%。

    1.6.3 HE染色和Nissl染色觀察 取剩余5只大鼠海馬組織,固定于4%多聚甲醛中,石蠟包埋,切片(5 μm)后用HE染色、Nissl染色,在光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠海馬組織的病理變化和神經(jīng)元損傷。

    1.6.4 TUNEL法檢測神經(jīng)元凋亡 取大鼠海馬組織石蠟切片,按照TUNEL試劑盒說明書染色,4 ℃孵育過夜,洗滌后與熒光二抗在37 ℃下孵育1 h,并用DAPI進行核染,在顯微鏡下觀察拍照。

    1.6.5 ELISA法檢測炎癥因子水平 取大鼠海馬組織,剪切、研磨,離心取上清,按照ELISA試劑盒說明書,檢測炎證因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

    1.6.6 Western blotting法檢測蛋白表達(dá) 取大鼠海馬組織,用RIPA裂解,提取總蛋白,定量后按步驟進行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉封閉2 h,在4 ℃下加入一抗IL-1β、TNF-α、cGAS、STING、p-IRF3、IRF3(1:1 000)和內(nèi)參β-actin過夜孵育,清洗,在4 ℃下加入二抗山羊抗兔IgG(1:2 000),孵育2 h。用ECL發(fā)光顯影,觀察拍照,各條帶灰度值用Image J軟件處理分析。

    1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用GraphPad Prism 8.0軟件進行統(tǒng)計分析,數(shù)據(jù)采用(±s)表示,多組間比較用單因素方差分析,兩兩比較采用SNK-q檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較 與對照組比較,MCAO組大鼠神經(jīng)功能缺損評分升高(P<0.05);與MCAO組比較,MCAO+RU.521組、麝香酮組大鼠神經(jīng)功能缺損評分降低(P<0.05);MCAO+RU.521組大鼠神經(jīng)功能缺損評分與麝香酮組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與麝香酮組比較,麝香酮+2′3′-cGAMP組大鼠神經(jīng)功能缺損評分升高(P<0.05)。(見圖1)

    圖1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較 (±s,n=10)

    2.2 各組大鼠TTC染色腦梗死面積比較 與對照組比較,MCAO組大鼠腦梗死面積顯著升高(P<0.05);與MCAO組比較,MCAO+RU.521組、麝香酮組大鼠腦梗死面積顯著降低(P<0.05);MCAO+RU.521組大鼠腦梗死面積與麝香酮組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與麝香酮組比較,麝香酮+2′3′-cGAMP組大鼠腦梗死面積顯著升高(P<0.05)。(見圖2~3)

    圖2 大鼠TTC 染色腦梗死面積比較 (±s,n=5)

    圖3 各組大鼠腦組織TTC 染色結(jié)果

    2.3 各組大鼠HE染色和Nissl染色結(jié)果比較 HE染色顯示,對照組大鼠海馬組織神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)正常,細(xì)胞排列緊密,細(xì)胞核仁清晰且胞質(zhì)豐富;MCAO組大鼠海馬組織神經(jīng)元細(xì)胞皺縮,細(xì)胞排列松散且腫脹;與MCAO組比較,MCAO+RU.521組、麝香酮組大鼠海馬組織神經(jīng)元病理損傷減輕,形態(tài)有所恢復(fù),細(xì)胞變異程度減輕;與麝香酮組比較,麝香酮+2′3′-cGAMP組大鼠海馬組織神經(jīng)元病理損傷加重。Nissl染色顯示,對照組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常,Nissl體豐富;MCAO組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞萎縮,核質(zhì)固縮,Nissl體顯著減少;MCAO+RU.521組、麝香酮組大鼠海馬組織神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)有所恢復(fù),Nissl體增加;麝香酮+2′3′-cGAMP組大鼠海馬組織神經(jīng)元細(xì)胞損傷程度較麝香酮組加重。(見圖4)

    圖4 大鼠海馬組織HE 染色和Nissl 染色結(jié)果 (×400)

    2.4 各組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況比較 與對照組比較,MCAO組海馬組織神經(jīng)元凋亡數(shù)目增加,凋亡率顯著升高(P<0.05);與MCAO組比較,MCAO+RU.521組、麝香酮組神經(jīng)元凋亡數(shù)目減少,凋亡率顯著降低(P<0.05);MCAO+RU.521組神經(jīng)元凋亡數(shù)目和凋亡率與麝香酮組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與麝香酮組比較,麝香酮+2′3′-cGAMP組神經(jīng)元凋亡數(shù)目增加,凋亡率顯著升高(P<0.05)。(見圖5~6)

    圖5 大鼠海馬組織TUNEL 染色結(jié)果 (×400)

    圖6 各組大鼠神經(jīng)元凋亡率比較 (±s,n=10)

    2.5 各組大鼠炎癥因子水平比較 與對照組比較,MCAO組大鼠海馬組織IL-6、IL-1β、TNF-α水平顯著升高(P<0.05);與MCAO組比較,MCAO+RU.521組、麝香酮組大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α水平顯著降低(P<0.05);MCAO+RU.521組大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α水平與麝香酮組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與麝香酮組比較,麝香酮+2′3′-cGAMP組大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α水平顯著升高(P<0.05)。(見圖7)

    圖7 各組大鼠炎癥因子水平比較 (±s,n=10)

    2.6 各組大鼠海馬組織蛋白表達(dá)比較 與對照組比較,MCAO組大鼠海馬組織IL-1β、TNF-α、cGAS、STING、p-IRF3蛋白相對表達(dá)量顯著升高(P<0.05);與MCAO組比較,MCAO+RU.521組、麝香酮組大鼠IL-1β、TNF-α、cGAS、STING、p-IRF3蛋白相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05);MCAO+RU.521組大鼠各蛋白相對表達(dá)量與麝香酮組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與麝香酮組比較,麝香酮+2′3′-cGAMP組大鼠IL-1β、TNF-α、cGAS、STING、p-IRF3蛋白相對表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。(見圖8~9)

    圖8 大鼠海馬組織蛋白表達(dá)Western blotting 圖

    圖9 各組大鼠海馬組織蛋白相對表達(dá)量比較 (±s,n=5)

    3 討論

    IS是一種常見的腦血管疾病,主要是由大腦血管突然阻塞,從而限制相關(guān)區(qū)域的血液流動或供應(yīng)引起的,其中中風(fēng)會增加認(rèn)知缺陷、長期殘疾、抑郁和癡呆的風(fēng)險,嚴(yán)重影響人類健康狀況和生活質(zhì)量[9]。目前IS的主要臨床治療措施是溶栓、血栓切除術(shù)、抗血小板聚集和神經(jīng)營養(yǎng)等,以盡快恢復(fù)缺血區(qū)的腦血流和神經(jīng)功能,但這些療法的使用受時間窗口和出血風(fēng)險的限制。神經(jīng)炎癥是IS的主要病理過程。IS導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞死亡,使小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞過度活化,釋放出高水平的炎癥因子如IL-6、IL-1β和TNF-α,并促進白細(xì)胞進入腦組織,產(chǎn)生炎癥級聯(lián)反應(yīng),促進更多神經(jīng)元死亡并加重腦損傷[10]。HAN B等[11]發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞PGC-1α通過抑制神經(jīng)炎癥來防止IS后腦損傷;ZHANG Y等[12]也發(fā)現(xiàn)SerpinA3N通過減少細(xì)胞凋亡和神經(jīng)炎癥可減輕IS后腦損傷。因此,在IS后抑制炎癥反應(yīng)可緩解腦損傷。

    本研究通過使用MCAO法構(gòu)建IS大鼠模型發(fā)現(xiàn),MCAO組大鼠神經(jīng)功能缺損評分和腦梗死面積顯著升高,海馬組織神經(jīng)元細(xì)胞皺縮損傷,Nissl體減少,且神經(jīng)元凋亡數(shù)目增加,表明MCAO組大鼠出現(xiàn)嚴(yán)重神經(jīng)功能損傷。且海馬組織IL-6、IL-1β、TNF-α含量顯著升高,表明MCAO組大鼠出現(xiàn)神經(jīng)炎癥。麝香酮在腦血管疾病中具有神經(jīng)保護作用,包括抗氧化應(yīng)激、抗缺血性損傷、抗凋亡、抗炎和觸發(fā)神經(jīng)保護等。其中麝香酮通過作為神經(jīng)保護和促血管生成劑起到對急性腦缺血再灌注損傷的保護作用[13];麝香酮還能通過減少神經(jīng)元壞死,保護血腦屏障,改善腦缺血引起的神經(jīng)損傷[14]。本研究通過選用麝香酮鼻內(nèi)給藥的方式對MCAO組大鼠進行治療。鼻內(nèi)給藥使麝香酮能直接通過鼻黏膜或肺部的毛細(xì)血管吸收,通過鼻黏膜-腦脊液途徑直接進入腦脊液,繞過血腦屏障直接遞送到腦。麝香酮鼻腔給藥具有生物利用度高、見效快、安全、有效等特點[15]。本研究發(fā)現(xiàn),MCAO組大鼠經(jīng)麝香酮治療后,神經(jīng)功能缺損評分和腦梗死面積降低,海馬組織神經(jīng)元損傷得到改善,Nissl體增加,且神經(jīng)元凋亡數(shù)目和IL-6、IL-1β、TNF-α含量減少,表明麝香酮對MCAO組大鼠神經(jīng)元功能障礙和神經(jīng)炎癥具有改善作用。

    胞質(zhì)dsDNA已被證明可激活炎癥和免疫反應(yīng)。cGAS是一種關(guān)鍵的胞質(zhì)DNA傳感器,可通過合成cGAMP激活STING,觸發(fā)由STING級聯(lián)介導(dǎo)的下游促炎信號,同時炎癥因子可激活I(lǐng)RF3、NF-κB等途徑,因此cGAS-STING通路的激活被認(rèn)為與神經(jīng)病理生理學(xué)密切相關(guān)[16]。已有研究發(fā)現(xiàn)cGAS-STING參與創(chuàng)傷性腦損傷[17]、肌萎縮側(cè)索硬化癥[18]、阿爾茨海默病[19]等多種動物模型中的神經(jīng)炎癥。cGAS-STING也與IS后的腦損傷和神經(jīng)炎癥密切相關(guān)。抑制cGAS或cGAS缺失均會減弱IS后的神經(jīng)炎癥,改善腦損傷[20-21]。本研究發(fā)現(xiàn),MCAO組大鼠海馬組織cGAS、STING、p-IRF3蛋白表達(dá)顯著升高,表明IS可能激活cGAS-STING信號通路,參與其腦損傷和神經(jīng)炎癥;而麝香酮治療后cGAS、STING、p-IRF3蛋白表達(dá)降低,麝香酮可能通過抑制cGAS-STING信號通路的激活,改善MCAO組大鼠腦損傷和神經(jīng)炎癥。為進一步驗證麝香酮對cGAS-STING信號通路的干預(yù)作用,本研究在MCAO的基礎(chǔ)上加上cGAS抑制劑RU.521,其作用與麝香酮對神經(jīng)損傷的改善作用一致,表明麝香酮可能發(fā)揮cGAS抑制劑的作用;此外,本研究在麝香酮基礎(chǔ)上加上STING激動劑2′3′-cGAMP,麝香酮對神經(jīng)損傷的改善作用受到抑制,因此麝香酮可能抑制cGAS-STING信號通路激活發(fā)揮作用。

    綜上所述,麝香酮可能通過抑制cGAS-STING信號通路激活,減少神經(jīng)元損傷,改善IS大鼠神經(jīng)炎癥。本研究為改善IS大鼠神經(jīng)損傷和神經(jīng)炎癥提供了新思路,但麝香酮對IS大鼠的其他分子機制仍有待闡明。

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