吉蘭-巴雷綜合征患者外周血記憶性T細(xì)胞和記憶性B細(xì)胞亞群的變化及其臨床意義

劉壇 黃小雨 張勇

[摘要]?目的?探討吉蘭-巴雷綜合征（Guillain-Barré?syndrome，GBS）患者外周血記憶性T細(xì)胞和記憶性B細(xì)胞亞群的變化及其臨床意義。方法?選取2018年6月至2020年12月于徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的16例GBS患者作為研究組，并選取同期16名來院的健康體檢者作為對(duì)照組。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩組入選者的外周血T細(xì)胞亞群，包括CD4+初始T細(xì)胞（naive?T?cells，TN）、CD4+中央記憶性T細(xì)胞（central?memory?T?cells，TCM）、CD4+效應(yīng)記憶性T細(xì)胞（effector?memory?T?cells，TEM）和CD4+終末分化效應(yīng)記憶性T細(xì)胞（terminally?differentiated?effector?memory?T?cells，TEMRA）及記憶性B細(xì)胞、漿母細(xì)胞的占比并分析其臨床價(jià)值。結(jié)果?與對(duì)照組相比，研究組患者的CD4+TN及CD8+TN均明顯下降（P<0.05），CD4+TEM及CD8+TEM均明顯升高（P<0.05），TCM及TEMRA在CD4和CD8上的比例比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與對(duì)照組相比，研究組記憶性B細(xì)胞比例明顯升高（P<0.05），兩組患者間漿母細(xì)胞占比比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。GBS患者外周血CD4+TEM及CD8+TEM占比與Hughes殘疾評(píng)分、腦脊液蛋白、腦脊液免疫球蛋白G及記憶性B細(xì)胞占比均呈正相關(guān)（P<0.05）。結(jié)論?GBS患者存在記憶性T細(xì)胞和記憶性B細(xì)胞亞群免疫紊亂，CD4+TEM細(xì)胞、CD8+TEM細(xì)胞及記憶性B細(xì)胞占比升高，這很可能是GBS發(fā)病過程中重要的外周免疫機(jī)制。

[關(guān)鍵詞]?吉蘭-巴雷綜合征；效應(yīng)記憶性T細(xì)胞；記憶性B細(xì)胞

[中圖分類號(hào)]?R743.3??????[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2024.06.013

Changes?and?clinical?significance?of?memory?T?cells?and?memory?B?cell?subsets?in?peripheral?blood?of?patients?with?Guillain-Barré?syndrome

LIU?Tan1，?HUANG?Xiaoyu2，?ZHANG?Yong2

1.Department?of?Neurology，?the?First?Peoples?Hospital?of?Huzhou，?Huzhou?313000，?Zhejiang，?China;?2.Department?of?Neurology，?Affiliated?Hospital?of?Xuzhou?Medical?University，?Xuzhou?221000，?Jiangsu，?China

[Abstract]?Objective?To?investigate?the?changes?of?memory?T?cells?and?memory?B?cells?subsets?in?peripheral?blood?of?patients?with?Guillain-Barré?syndrome?（GBS）?and?their?clinical?significance.?Methods?A?total?of?16?patients?with?GBS?who?were?hospitalized?in?the?Department?of?Neurology，?Affiliated?Hospital?of?Xuzhou?Medical?University?from?June?2018?to?December?2020?were?selected?as?the?research?group，?and?16?healthy?people?who?came?to?the?hospital?for?physical?examination?during?the?same?period?were?selected?as?the?control?group.?The?proportion?of?CD4+?naive?T?cells?（TN），?CD4+?central?memory?T?cells?（TCM），?CD4+?effector?memory?T?cells?（TEM），?CD4+?terminally?differentiated?effector?memory?T?cells?（TEMRA），?memory?B?cells?and?plasmacytocytes?in?peripheral?blood?of?the?two?groups?was?detected?by?flow?cytometry?and?its?clinical?value?was?analyzed.?Results?Compared?with?the?control?group，?CD4+TN?and?CD8+TN?were?significantly?decreased?in?research?group?（P<0.05），?while?CD4+TEM?and?CD8+TEM?were?significantly?increased?in?research?group?（P<0.05）.?There?was?no?significant?difference?between?TCM?and?TEMRA?in?the?proportion?of?CD4?and?CD8?（P>0.05）.?Compared?with?the?control?group，?the?proportion?of?memory?B?cells?in?the?GBS?group?was?significantly?increased?（P<0.05），?while?the?proportion?of?plasmabytes?was?not?significantly?different.?The?percentages?of?CD4+TEM?and?CD8+TEM?in?peripheral?blood?of?GBS?patients?were?positively?correlated?with?Hughes?disability?score，?cerebrospinal?fluid?protein，?cerebrospinal?fluid?immunoglobulin?G?and?memory?B?cells?（P<0.05）.?Conclusion?There?are?immune?disorders?of?memory?T?cells?and?memory?B?cells?subsets?in?patients?with?GBS.?The?increased?proportion?of?CD4+TEM?cells，?CD8+TEM?cells?and?memory?B?cells?may?be?a?peripheral?immune?mechanism?in?the?pathogenesis?of?GBS.

[Key?words]?Guillain-Barré?syndrome;?Effector?memory?T?cells;?Memory?B?cells

吉蘭-巴雷綜合征（Guillain-Barré?syndrome，GBS）是一類免疫介導(dǎo)的急性炎性周圍神經(jīng)病，主要病理生理機(jī)制是外周神經(jīng)中抗體-抗原相互作用引起的補(bǔ)體介導(dǎo)的神經(jīng)損傷[1-2]。既往研究發(fā)現(xiàn)體液免疫及細(xì)胞免疫共同參與此病的發(fā)生，然而國(guó)內(nèi)外關(guān)于GBS免疫細(xì)胞亞群的研究尚不充分，尤其是記憶性細(xì)胞亞群在GBS患者外周血中的占比仍需進(jìn)一步探討。已有文獻(xiàn)報(bào)道記憶性B細(xì)胞參與了GBS的發(fā)病[3]；也有學(xué)者指出記憶性T細(xì)胞可幫助記憶性B細(xì)胞更快速地產(chǎn)生抗體反應(yīng)[4]。由此推測(cè)記憶性T細(xì)胞及記憶性B細(xì)胞均可能參與GBS的發(fā)病。本研究通過分析GBS患者記憶性T細(xì)胞及記憶性B細(xì)胞亞群的改變，為探索GBS的發(fā)病機(jī)制提供新思路。

1??資料與方法

1.1??一般資料

回顧性選取2018年6月至2020年12月于徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的16例GBS患者作為研究組，其中男8例、女8例，年齡28～78歲，平均（54.38±15.24）歲。選取同期16名來院的健康體檢者作為對(duì)照組，其中男7例、女9例，年齡29～69歲，平均（46.56±11.18）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《中國(guó)吉蘭-巴雷綜合征診治指南2019》診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]；②年齡≥18歲；③未接受靜脈注射免疫球蛋白治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①其他自身免疫性疾病，如白血病、類風(fēng)濕疾病、甲狀腺疾病、人類免疫缺陷病毒感染的患者；②器官移植的患者；③診斷不明確或臨床資料不全、資料丟失的患者。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。本研究經(jīng)徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過（倫理審批號(hào)：XYFY2020-JS019-01）。

1.2??方法

所有研究對(duì)象均于入組后空腹抽取6ml靜脈血，其中2ml靜脈血用乙二胺四乙酸（ethylene?diamine?tetraacetic?acid，EDTA）抗凝，余靜脈血不抗凝直接分離血清。采用人淋巴細(xì)胞分離液（天津?yàn)笊锕荆┓蛛x得到外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral?blood?mononuclear?cell，PBMC），經(jīng)磷酸緩沖鹽溶液（phosphate?buffer?saline，PBS）洗滌離心后加入鼠抗人CD3-APC-Cy7抗體、鼠抗人CD4-APC抗體、鼠抗人CD8-Percp-Cy5-5抗體、鼠抗人CD45RA-?V450抗體、鼠抗人CCR7-BV510抗體（美國(guó)BD公司）；同時(shí)設(shè)同型對(duì)照管，室溫避光孵育15min后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)記憶性T細(xì)胞亞群，其中CD4+初始T細(xì)胞（naive?T?cells，TN）表型為CD3+、CD4+、CD8-CD45RA+、CCR7+，CD4+中央記憶性T細(xì)胞（central?memory?T?cells，TCM）表型為CD3+、CD4+、CD8-CD45RA-、CCR7+，CD4+效應(yīng)記憶性T細(xì)胞（effector?memory?T?cells，TEM）表型為CD3+、CD4+、CD8-CD45RA-、CCR7-，CD4+終末分化效應(yīng)記憶性T細(xì)胞（terminally?differentiated?effector?memory?T?cells，TEMRA）表型為CD3+、CD4+、CD8-CD45RA-、CCR7-；CD8+TN細(xì)胞表型為CD3+、CD4-、CD8+?CD45RA+、CCR7+，CD8+TCM細(xì)胞表型為CD3+、CD4-、CD8+CD45RA-、CCR7+，CD8+TEM細(xì)胞表型為CD3+、CD4-、CD8+CD45RA-、CCR7-，CD8+TEMRA細(xì)胞表型為CD3+、CD4-、CD8+?CD45RA-、CCR7-。在分離的PBMC中加入鼠抗人CD45-Percp-Cy5-5抗體、鼠抗人CD19-APC、鼠抗人CD27-?BV510、鼠抗人CD38-FITC抗體（美國(guó)BD公司），同時(shí)設(shè)同型對(duì)照管。室溫避光孵育15min后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)記憶B細(xì)胞亞群，其中記憶B細(xì)胞表型為CD19+?CD27+，漿母細(xì)胞表型為CD19+?CD27+CD38+。

1.3??統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS?19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）[M（Q1，Q3）]表示，組間比較采用秩檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（百分率）[n（%）]表示，組間比較采用c2檢驗(yàn)。采用Pearson相關(guān)性分析CD4+TEM及CD8+TEM占比與Hughes殘疾評(píng)分、腦脊液蛋白、腦脊液免疫球蛋白G（immunoglobulin?G，IgG）及記憶性B細(xì)胞的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2??結(jié)果

2.1??GBS患者的一般資料及外周血記憶性T細(xì)胞亞群占比分析

GBS患者的一般資料分析見表1。與對(duì)照組相比，研究組患者的CD4+TN及CD8+TN均明顯下降（P<0.05），CD4+TEM及CD8+TEM均明顯升高（P<0.05），TCM及TEMRA在CD4和CD8上的比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表2。

2.2??兩組患者的外周血記憶性B細(xì)胞占比比較

與對(duì)照組比較，研究組患者的記憶性B細(xì)胞比例明顯升高（P<0.05），漿母細(xì)胞的比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

2.3??GBS患者外周血CD4+TEM和CD8+TEM占比與GBS患者臨床嚴(yán)重程度的相關(guān)性分析

GBS患者外周血CD4+TEM及CD8+TEM占比與Hughes殘疾評(píng)分、腦脊液蛋白、腦脊液IgG及記憶性B細(xì)胞占比均呈正相關(guān)（P<0.05），見圖1。

3??討論

GBS發(fā)病與自身免疫功能障礙相關(guān)，各種類型的活化的T細(xì)胞被認(rèn)為是GBS的發(fā)生和發(fā)展的協(xié)調(diào)者。研究表明記憶性T細(xì)胞對(duì)B細(xì)胞生發(fā)中心的形成及產(chǎn)生對(duì)抗髓鞘的抗體具有十分重要的作用，其中TEM細(xì)胞可通過產(chǎn)生細(xì)胞因子白細(xì)胞介素（interleukin-17，IL-17）和重組人干擾素（recombinant?human?interferon-r，IFN-γ）等炎癥因子參與B細(xì)胞的分化[5]；同時(shí)記憶性B細(xì)胞也與GBS的發(fā)病相關(guān)[3]。因此，進(jìn)一步明確記憶性B細(xì)胞亞群、記憶性T細(xì)胞亞群尤其是TEM細(xì)胞在GBS患者外周血中的占比，對(duì)解釋GBS的發(fā)病機(jī)制至關(guān)重要。

有學(xué)者根據(jù)是否表達(dá)CD45RA區(qū)別初始T細(xì)胞和記憶性T細(xì)胞，并進(jìn)一步依據(jù)趨化因子受體CCR7的表達(dá)將記憶性T細(xì)胞分為TCM和TEM[6]。與初始T細(xì)胞和TCM細(xì)胞相比，TEM細(xì)胞更能快速被抗原識(shí)別，迅速激活免疫反應(yīng)，且可立刻到達(dá)炎癥部位并發(fā)揮作用[7]。既往多項(xiàng)研究表明，TEM細(xì)胞與一些自身免疫性疾病如多發(fā)性硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡?、結(jié)腸炎、1型糖尿病等的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)及嚴(yán)重程度密切相關(guān)[8-12]。本研究結(jié)果也顯示，與對(duì)照組相比，研究組患者外周血CD4+TEM細(xì)胞和CD8+TEM細(xì)胞占比更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。初始B細(xì)胞成熟后，與抗原相遇被其激活，隨后分化為CD19+CD27+記憶性B細(xì)胞；當(dāng)記憶性B細(xì)胞再次與相同抗原相遇時(shí)就會(huì)增殖，分化為漿細(xì)胞，產(chǎn)生特異性抗體，從而發(fā)揮介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答的作用。據(jù)報(bào)道，記憶性B細(xì)胞在一些自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、自身免疫性溶血性貧血等疾病中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[13-15]。Wang等[3]發(fā)現(xiàn)記憶B細(xì)胞在GBS急性期顯著增加，并隨著病情的恢復(fù)而減少，進(jìn)一步的Spearman相關(guān)分析顯示GBS的臨床嚴(yán)重程度與患者外周血中記憶B細(xì)胞的占比呈正相關(guān)。本研究結(jié)果與之一致，研究組患者記憶性B細(xì)胞比例高于對(duì)照組；此外，進(jìn)一步Pearson相關(guān)性分析顯示CD4+TEM及CD8+TEM細(xì)胞占比與Hughes殘疾評(píng)分、腦脊液蛋白、腦脊液IgG及記憶性B細(xì)胞占比均呈正相關(guān)，CD4+TEM及CD8+TEM細(xì)胞與疾病臨床嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。在GBS發(fā)病中發(fā)揮重要作用，并可能通過自身效應(yīng)功能調(diào)節(jié)B細(xì)胞的分化參與GBS的發(fā)病。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)GBS患者存在記憶性T細(xì)胞和記憶性B細(xì)胞亞群免疫紊亂，外周血中CD4+TEM細(xì)胞、CD8+TEM細(xì)胞及記憶性B細(xì)胞占比升高可能是GBS發(fā)病過程中的一個(gè)外周免疫機(jī)制。進(jìn)一步深入探討TEM細(xì)胞參與GBS發(fā)病的機(jī)制有望成為治療GBS的新靶點(diǎn)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 卜碧濤，?崔麗英，?笪宇威，?等.?中國(guó)吉蘭-巴雷綜合征診治指南2019[J].?中華神經(jīng)科雜志，?2019，?52（11）：?877–882.

[2] 曹磊，?胡燕杰，?張雨欣，?等.?神經(jīng)電生理檢查對(duì)吉蘭-巴雷綜合征病程及病情的判定價(jià)值[J].?安徽醫(yī)學(xué)，?2020，?41（11）：?1258–1260.

[3] WANG?Q，?XING?C，?HAO?Y，?et?al.?Memory?B?cells?in?Guillain-Barre?syndrome[J].?J?Neuroimmunol，?2017，?305：?1–4.

[4] SHIMIZU?T，?NAGAFUCHI?Y，?HARADA?H，?et?al.?Decreased?peripheral?blood?memory?B?cells?are?associated?with?the?presence?of?interstitial?lung?disease?in?rheumatoid?arthritis：?A?case-control?study[J].?Mod?Rheumatol，?2021，?31（1）：?127–132.

[5] JAIN?A，?SONG?R，?WAKELAND?E?K，?et?al.?T?cell-intrinsic?IL-1R?signaling?licenses?effector?cytokine?production?by?memory?CD4?T?cells[J].?Nat?Commun，?2018，?9（1）：?3185.

[6] 盧紅娟，?孫衛(wèi)民.?CD4+記憶性T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞學(xué)機(jī)制[J].?現(xiàn)代免疫學(xué)，?2010，?30（6）：?507–510.

[7] 陳孟嘉，?馮輝.?干細(xì)胞樣記憶性CD8+T細(xì)胞的生物學(xué)特性研究進(jìn)展[J].?中國(guó)免疫學(xué)雜志，?2020，?36（11）：?1403–1406.

[8] 李盈，?胡學(xué)強(qiáng).?記憶性T細(xì)胞在多發(fā)性硬化發(fā)病和治療中的作用[J].?中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，?2009，?8（3）：?319–320.

[9] HOHLFELD?R，?BELTRAN?E，?GERDES?L?A，?et?al.?Tissue-?resident?CD8+?memory?T?cells?in?multiple?sclerosis[J].?Brain，?2021，?12，?144（1）：?e7.

[10] ZHANG?B，?WEI?B，?GAO?M，?et?al.?Aberrant?T?cell?subsets?and?cytokines?expression?profile?in?systemic?lupus?erythematosus[J].?Clin?Rheumatol，?2018，?37（9）：?2405–2413.

[11] 吳甜甜，?劉雪珂，?劉馥春，?等.?左金丸對(duì)DSS誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠免疫記憶性T細(xì)胞水平的調(diào)節(jié)作用[J].?中藥新藥與臨床藥理，?2020，?31（10）：?1158–1164.

[12] 周小斌，?費(fèi)小薔，?葉軍，?等.?T1DM患者外周血記憶性T細(xì)胞表面PD-1表達(dá)水平與其疾病發(fā)生發(fā)展的初步研究[J].?南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），?2018，?38（4）：?476–481.