非小細(xì)胞肺癌不同中醫(yī)證型與腸道菌群-免疫功能相關(guān)性研究

周夏成 劉遠(yuǎn)財(cái) 孫夢(mèng)瑩 楊佳穎 陳卓 張愛(ài)琴

[摘要]?目的?探討不同中醫(yī)證型非小細(xì)胞肺癌腸道菌群及免疫功能的基本特征。方法?選取2019年3—10月于浙江省腫瘤醫(yī)院胸外科門(mén)診就診且診斷為非小細(xì)胞肺癌的患者46例作為患者組，其中氣滯血瘀證組13例，脾虛濕滯證組12例，氣陰兩虛證組7例，陰虛內(nèi)熱證組14例；選取同期12名健康志愿者作為健康對(duì)照組，收集納入者的糞便標(biāo)本，用16S?rDNA技術(shù)檢測(cè)腸道微生態(tài)。采集納入者的血清標(biāo)本，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme?linked?immunosorbent?assay，ELISA）比較納入者的白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-12和干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）差異。結(jié)果?與健康對(duì)照組比較，屬水平相對(duì)豐度前20的種系中，氣陰兩虛證組有6個(gè)差異性菌屬，陰虛內(nèi)熱證組有4個(gè)差異性菌屬，氣滯血瘀證組有5個(gè)差異性菌屬，脾虛濕滯證組有3個(gè)差異性菌屬。氣滯血瘀證組患者血清中的IL-12含量顯著降低，氣陰兩虛證組患者血清中的IFN-γ含量顯著升高，其余差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論?不同中醫(yī)證型非小細(xì)胞肺癌具有特異的腸道菌群，羅斯氏菌屬（Roseburia）、另枝菌屬（Alistipes）可能通過(guò)調(diào)控IL-12、IFN-γ表達(dá)影響宿主免疫應(yīng)答。

[關(guān)鍵詞]?非小細(xì)胞癌；腸道菌群；免疫功能；中醫(yī)證型

[中圖分類(lèi)號(hào)]?R273??????[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2024.06.001

Study?on?the?correlation?between?different?traditional?Chinese?medicine?evidence?types?and?intestinal?flora-immune?function?in?non-small?cell?lung?cancer

ZHOU?Xiacheng1，?LIU?Yuancai1，?SUN?Mengying1，?YANG?Jiaying1，?CHEN?Zhuo2，?ZHANG?Aiqin2

1.The?Second?Clinical?School，?Zhejiang?University?of?Traditional?Chinese?Medicine，?Hangzhou?310005，?Zhejiang，?China;?2.Department?of?Traditional?Chinese?Medicine，?Zhejiang?Cancer?Hospital，?Hangzhou?Institute?of?Medicine?（HIM），?Chinese?Academy?of?Sciences，?Hangzhou?310022，?Zhejiang，?China

[Abstract]?Objective?To?explore?the?basic?characteristics?of?intestinal?flora?and?immune?function?in?different?traditional?Chinese?medicine?evidence-based?non-small?cell?lung?cancer.?Methods?A?total?of?46?patients?with?non-small?cell?lung?cancer?who?were?diagnosed?in?the?Department?of?Thoracic?Surgery，?Zhejiang?Cancer?Hospital?from?March?to?October?2019?were?selected?as?the?patient?group，?including?13?cases?in?the?Qi?stagnation?and?blood?stasis?evidence?group，?12?cases?in?the?spleen?deficiency?and?dampness?stagnation?evidence?group，?7?cases?in?the?Qi?and?Yin?deficiency?evidence?group，?and?14?cases?in?the?Yin?deficiency?and?internal?heat?evidence?group?as?the?patient?groups，?and?12?healthy?volunteers?were?selected?as?the?healthy?control?group，?collected?stool?specimens，?and?intestinal?microecology?was?detected?by?16S?rDNA?technique.?Collect?serum?samples?from?enrolled?individuals?and?compare?their?levels?of?interleukin?（IL）-12?and?interferon-γ?（IFN-γ）?using?enzyme?linked?immunosorbent?assay?（ELISA）.?Results?Compared?with?the?healthy?control?group，?among?the?top?20?strains?in?terms?of?relative?abundance?of?genus?levels，?there?were?6?differential?genera?in?the?Qi?and?Yin?deficiency?evidence?group，?4?differential?genera?in?the?Yin?deficiency?internal?heat?evidence?group，?5?differential?genera?in?the?Qi?stagnation?and?blood?stasis?evidence?group，?and?3?differential?genera?in?the?spleen?deficiency?and?dampness?stagnation?evidence?group.?The?IL-12?level?in?serum?was?significantly?lower?in?Qi?stagnation?and?blood?stasis?group，?and?the?IFN-γ?level?in?serum?was?significantly?higher?in?Qi?and?Yin?deficiency?group，?but?the?rest?were?not?significant.?Conclusion?Different?traditional?Chinese?medicine?evidence?of?non-small?cell?lung?cancer?have?specific?intestinal?flora，?Roseburia?and?Alistipes?may?affect?the?host?immune?response?by?regulating?IL-12?and?IFN-γ?expression.

[Key?words]?Non-small?cell?lung?cancer;?Intestinal?flora;?Immune?function;?Traditional?Chinese?medicine?evidence

肺癌是目前世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤[1]。腸道微生態(tài)是影響人體健康的重要因素，研究表明腸道菌群可通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥、免疫反應(yīng)等影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[2-5]。中醫(yī)證候是疾病發(fā)展過(guò)程中某個(gè)階段生理、病理變化的高度概括，具有動(dòng)態(tài)性和即時(shí)性的特征[6]。目前，“如何為中醫(yī)證候提供客觀的評(píng)判依據(jù)？如何用內(nèi)在的變化表征外在的表現(xiàn)？”等問(wèn)題已成為中醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。運(yùn)用生物學(xué)方法研究中醫(yī)證候，有助于從客觀上揭示證候的本質(zhì)[7]。因此，本研究運(yùn)用16SrDNA和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme?linked?immunosorbent?assay，ELISA）對(duì)不同中醫(yī)證型非小細(xì)胞肺癌（non-small?cell?lung?cancer，NSCLC）進(jìn)行腸道微生態(tài)學(xué)和免疫功能的研究，從生物學(xué)角度分析NSCLC中醫(yī)證候的診斷依據(jù)，為今后中醫(yī)藥治療NSCLC提供理論支持，為中醫(yī)藥抗腫瘤治療提供依據(jù)。

1??資料與方法

1.1??診斷標(biāo)準(zhǔn)

患者相關(guān)病理報(bào)告示：組織病理學(xué)和（或）細(xì)胞學(xué)證實(shí)為NSCLC[8]?；颊弑救俗C候主訴符合《中醫(yī)臨床診療術(shù)語(yǔ)·證候部分》中醫(yī)證診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]：????①氣陰兩虛證：咳嗽痰少，氣短息弱，聲低懶言，面色觥白，自汗或盜汗，口干少飲，諸癥勞累后加劇，舌質(zhì)淡嫩或偏紅，脈細(xì)弱；②陰虛內(nèi)熱證：咳嗽少痰或無(wú)痰，或痰中帶血絲，口干、口渴，潮熱盜汗，夜寐不安，大便燥結(jié)，舌紅少苔或無(wú)苔，脈細(xì)數(shù)；③脾虛濕滯證：咳嗽痰多，痰白或黃白相兼，不欲食或納少腹脹便溏，面色萎黃，舌淡苔白膩有齒痕，脈滑；④氣滯血瘀證：咳嗽不暢，痛處固定，拒按，夜間加劇，面色黯淡，舌質(zhì)紫邊尖有瘀點(diǎn)，脈澀或結(jié)代。

1.2??納入、排除及脫落標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合1.1中的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②無(wú)其他惡性腫瘤個(gè)人史；③符合中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)；④年齡18～70歲；⑤患者本人同意并簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患者近14d內(nèi)使用過(guò)抗生素治療；②有精神疾病，無(wú)完全民事行為能力。脫落標(biāo)準(zhǔn)：①患者依從性差；②患者要求終止試驗(yàn)。

1.3??樣本量估算

本研究采用Logistic分析，擬探查變量有6項(xiàng)，相關(guān)資料顯示Logistic回歸樣本量要求每個(gè)自變量需有10～15個(gè)樣本，經(jīng)計(jì)算得出需收集60～90例患者樣本。

1.4??一般資料

選取2019年3月—10月于浙江省腫瘤醫(yī)院胸外科門(mén)診就診且診斷為NSCLC，并擬行肺癌根治術(shù)的患者作為患者組?；颊呷虢M前經(jīng)中醫(yī)科兩名副主任以上中醫(yī)師同時(shí)辨證為氣滯血瘀證、脾虛濕滯證、氣陰兩虛證或陰虛內(nèi)熱證。本研究共收集樣本70例，其中排除或退出24例，共納入46例，其中氣滯血瘀證組13例，脾虛濕滯證組12例，氣陰兩虛證組7例，陰虛內(nèi)熱證組14例。選取同期12名健康志愿者為對(duì)照組。本研究經(jīng)浙江省腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)（倫理審批號(hào)：IRB-2018-219）。

1.5??質(zhì)量控制

1.5.1??組織培訓(xùn)??研究開(kāi)始前綜合培訓(xùn)相關(guān)研究員，明確納排標(biāo)準(zhǔn)，并嚴(yán)格執(zhí)行，要求各研究員熟練掌握樣本采集操作及儲(chǔ)存方式。

1.5.2??入組評(píng)估??患者入組前需經(jīng)2名副主任以上中醫(yī)師同時(shí)辯證確認(rèn)分型，若有分歧則再請(qǐng)一名主任中醫(yī)師重新評(píng)估，方可入組。

1.5.3??標(biāo)本采集??采集糞便標(biāo)本過(guò)程中盡量采取無(wú)菌操作，過(guò)程迅速，盡量減少標(biāo)本與空氣的接觸時(shí)間，并及時(shí)將標(biāo)本放至–80℃冰箱內(nèi)凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.6??觀察指標(biāo)及方法

1.6.1??腸道微生態(tài)分析??DNA提?。菏褂肈NA提取試劑盒對(duì)糞便總DNA進(jìn)行提取，將樣本進(jìn)行16S?V3-V4區(qū)域擴(kuò)增。聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase?chain?reaction，PCR）分析：以稀釋后的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR。將1.5μl?PCR產(chǎn)物置于120V電壓下持續(xù)電泳20min，再使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行紫外線成像拍照。質(zhì)檢測(cè)序：質(zhì)檢合格后進(jìn)行濃度定量，并進(jìn)行相應(yīng)的比例混合，最后運(yùn)行Miseq測(cè)序程序。引物信息見(jiàn)表1。

1.6.2??白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-12和干擾素γ（interferon，IFN-γ）檢測(cè)??①分組：準(zhǔn)備酶標(biāo)包被板，將其置于框架上，選擇一處加入50μl標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)記為標(biāo)準(zhǔn)品孔；另選一處加入10μl待測(cè)樣本及40μl樣本稀釋液，標(biāo)記為待測(cè)樣品孔；選取一處空白對(duì)照孔。分別向待測(cè)樣本孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔加入100μl辣根過(guò)氧化物酶（horseradish?peroxidase，HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體。②溫育：將酶標(biāo)包被板置于37℃?CO2孵箱中溫育1h后取出，倒掉多余液體，用無(wú)菌磷酸緩沖液（phosphate?buffered?saline，PBS）洗板5次，每個(gè)孔250μl。③顯色：每孔分別加入50μl顯色劑A液及顯色劑B液，混勻30s后把板置于37℃濕潤(rùn)的培養(yǎng)箱中避光顯色15min，再加入50μl終止液終止反應(yīng)。④測(cè)量：測(cè)量各孔的吸光值并記錄分析數(shù)據(jù)。

1.7??統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS?26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用單因素方差分析或獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（百分率）[n（%）]表示，比較采用c2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2??結(jié)果

2.1??各組患者一般資料的比較

符合納排標(biāo)準(zhǔn)的NSCLC患者46例，病理類(lèi)型均為腺癌。氣滯血瘀證組13例，其中男7例，女6例；平均年齡（59.46±7.34）歲；Ⅰ期病例8例（61.5%），Ⅱ期病例5例（38.5%）。氣陰兩虛證組7例，其中男3例，女4例；平均年齡（60.57±4.79）歲；Ⅰ期病例3例（42.9%），Ⅱ期病例4（57.1%）。脾虛濕滯證組12例，其中男6例，女6例；平均年齡（58.58±6.71）歲；Ⅰ期病例6例（50.0%），Ⅱ期病例6例（50.0%）。陰虛內(nèi)熱證組14例，其中男8例，女6例；平均年齡（56.50±3.74）歲；Ⅰ期病例6例（42.9%），Ⅱ期病例8例（57.1%）。各組患者在疾病分期、年齡、性別等方面比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性，見(jiàn)表2。

2.2??微生態(tài)組間差異

2.2.1??操作分類(lèi)單元（operational?taxonomic?units，OUT）聚類(lèi)及稀釋曲線??稀釋曲線可用來(lái)反映測(cè)序的數(shù)據(jù)量是否足以反映樣品內(nèi)部物種的多樣性。曲線上升趨勢(shì)隨讀數(shù)條數(shù)的增加而逐漸趨于平坦，反映本研究的數(shù)據(jù)量較為合理，見(jiàn)圖1。

2.2.2??韋恩圖??本研究對(duì)58個(gè)樣品進(jìn)行16S測(cè)序分析，共產(chǎn)生284個(gè)分類(lèi)操作單元（operational?taxonomic?unit，OTU）。其中，5組樣本有117個(gè)共有OTU，相比于健康對(duì)照組，氣滯血瘀證組有13個(gè)特有的OUT，氣陰兩虛證組有3個(gè)特有的OTU，脾虛濕滯證組有15個(gè)特有的OTU，陰虛內(nèi)熱證組有7個(gè)特有的OTU，健康對(duì)照組有18個(gè)特有的OUT，見(jiàn)圖2。

2.2.3??腸型分析??不同中醫(yī)證型的肺癌患者腸道菌群結(jié)構(gòu)存在差異。其中，氣陰兩虛證組與陰虛內(nèi)熱證組的樣本點(diǎn)較集中，菌群組成分布較為相似；脾虛濕滯證組與氣滯血瘀證組的樣本點(diǎn)較分散，群菌組成分布差異相對(duì)較大，見(jiàn)圖3。

2.2.4??差異物種分析??不同中醫(yī)證型中屬水平差異性菌屬相對(duì)豐度排行前20的種系中，氣陰兩虛證組有6個(gè)差異性菌屬，其中羅斯菌屬（Roseburia）、芽殖菌屬（Gemmiger）、毛螺菌屬（Lachnospiracea）、另枝菌屬（Alistipes）較健康組顯著富集；放線菌屬（Actinomyces）、腸桿菌屬（Enterobacteriaceae）、克雷伯菌屬（Klebsiella）較健康組顯著降低。陰虛內(nèi)熱證組有4個(gè)差異性菌屬，其中，羅斯菌屬、毛螺菌屬、瘤胃菌屬（Ruminococcaceae）較健康組顯著富集；埃希菌屬/志賀桿菌屬（Escherichia/Shigella）較健康組顯著降低。氣滯血瘀證組有5個(gè)差異性菌屬，其中，毛螺菌屬、普氏菌屬（Prevotella）、梭菌屬（Clostridium?XⅠVa）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）較健康組顯著富集；放線菌屬（Actinomyces）較健康組顯著降低。脾虛濕滯證組有3個(gè)差異性菌屬，其中，副細(xì)菌（Parabacteroides）較健康組顯著富集；而鏈球菌屬（Streptococcus）、放線菌屬較健康組顯著降低。

2.3??各組納入者的血清IL-12、IFN-γ含量比較

與健康對(duì)照組比較，氣陰兩虛證組患者血清中的IFN-γ含量顯著升高（P<0.05）；氣滯血瘀證組患者血清中的IL-12含量顯著降低（P<0.01），其余組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表3。

3??討論

基于本研究結(jié)果，筆者推測(cè)肺癌中醫(yī)證候變化的實(shí)質(zhì)可能與腸道中某些菌群的數(shù)量變化或種類(lèi)有關(guān)。故假設(shè)通過(guò)觀察不同中醫(yī)證型NSCLC患者腸道菌群的多樣性及差異性，來(lái)探究NSCLC患者不同中醫(yī)證型的生物學(xué)基礎(chǔ)，從而闡釋中醫(yī)證候的科學(xué)機(jī)理。

免疫失調(diào)是致使肺癌發(fā)生、發(fā)展的重要原因[10]。IFN-γ是一種具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子，是機(jī)體發(fā)揮免疫作用不可缺少的成分[11]。IL-12被認(rèn)為是調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)反應(yīng)最有意義的細(xì)胞因子之一[12]。本研究結(jié)果提示，氣滯血瘀組血清中IL-12含量較健康組顯著降低，氣陰兩虛組血清中的IFN-γ含量較健康組顯著升高，其余無(wú)顯著性差異。在4個(gè)證型中，血清IFN-γ的濃度均高于健康組。筆者推測(cè)早期肺癌患者正氣尚足，處于邪正交爭(zhēng)階段，從而促進(jìn)宿主分泌IFN-γ調(diào)節(jié)免疫功能及增強(qiáng)抗腫瘤作用。

特定的腸道微生物與宿主免疫系統(tǒng)相互調(diào)節(jié)，共同影響人體健康[13-17]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)菌群可通過(guò)激活Myd88通路來(lái)刺激免疫細(xì)胞分泌IL-1β及IL-23，進(jìn)一步誘導(dǎo)肺部產(chǎn)生IL-17的γδT細(xì)胞（主要是Vγ6+?Vδ1+?T細(xì)胞）增殖與活化，從而促進(jìn)肺部腫瘤發(fā)展[18]。本研究中，羅斯菌屬、另枝菌屬的豐度在氣陰兩虛組中均較健康組顯著富集。相關(guān)研究證實(shí)，羅斯菌屬作為腸道中的有益菌，可促進(jìn)免疫系統(tǒng)的抗腫瘤作用。Kenya?Honda研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)另枝菌屬等11株腸道微生物可增加INFγ+CD8+T細(xì)胞水平，提高由這些菌群介導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)[19]。筆者推測(cè)，氣陰兩虛組血清中的IFN-γ、IL-12濃度均較其他3個(gè)證型組高可能與腸道羅斯菌屬、另枝菌屬有關(guān)。此外，本研究還檢測(cè)出諸多目前尚未證實(shí)影響腫瘤發(fā)展及免疫應(yīng)答的菌屬，有待于進(jìn)一步研究。

證候的生物學(xué)基礎(chǔ)是中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究的關(guān)鍵部分，生物學(xué)方法的運(yùn)用有助于闡明中醫(yī)藥的科學(xué)本質(zhì)。筆者認(rèn)為菌群的數(shù)量、結(jié)構(gòu)、種類(lèi)及人體與菌群之間都維持著相對(duì)的動(dòng)態(tài)平衡，一旦平衡被破壞，就會(huì)導(dǎo)致菌群的失調(diào)進(jìn)而影響疾病的發(fā)生、發(fā)展。這種微生態(tài)理論與中醫(yī)學(xué)中的陰陽(yáng)學(xué)說(shuō)、整體觀等基礎(chǔ)理論不謀而合。本研究對(duì)不同中醫(yī)證型NSCLC患者進(jìn)行腸道微生態(tài)學(xué)和免疫功能的分析，有助于為肺癌的中醫(yī)證候研究提供新思路。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2023–01–09）

（修回日期：2024–02–23）