子癇前期患者血清VEGF、PAPP-A水平與妊娠結(jié)局的相關(guān)性研究*

鮑紅玉，朱俊平，李日芳，卓然然

（1.海南現(xiàn)代婦女兒童醫(yī)院 產(chǎn)科，海南 ?？?570311；2.海南省婦女兒童醫(yī)學(xué)中心產(chǎn)科，海南 海口 570216）

子癇前期（Preeclampsia,PE）多發(fā)生在妊娠20 周后，發(fā)病機制較復(fù)雜。目前臨床研究認為，PE 發(fā)病與胎盤著床淺、氧化應(yīng)激、內(nèi)皮細胞激活和功能障礙、胎兒胎盤組織與母體之間免疫不耐受等有關(guān)[1-2]。妊娠相關(guān)蛋白A（pregnancy-associated plasma protein-A,PAPP-A）是大分子蛋白，主要由胎盤滋養(yǎng)層細胞、蛻膜細胞合成分泌入血，參與胚胎早期發(fā)育、胎兒生長等過程。相關(guān)研究顯示，PAPP-A 與多種不良妊娠事件有關(guān)[3]。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）具有維持機體正常血管生長，增加血管內(nèi)皮細胞透性的作用，還可以促進內(nèi)皮細胞增殖、遷移。相關(guān)研究表明，VEGF 在PE 患者中低表達，與患者病情程度相關(guān)[4]。CC 趨化因子配體17（C-C motif chemokine ligand-17,CCL17）可與受體4（C-C chemokine receptor 4，CCR4）結(jié)合，發(fā)揮趨化T 淋巴細胞活性作用，參與炎癥反應(yīng)、血管內(nèi)皮損傷所有階段，還參與母體與胎兒免疫微環(huán)境形成，與胎兒異常發(fā)育有關(guān)[5]。另有研究顯示，PE 發(fā)病與環(huán)狀RNA（circRNA）異常表達有關(guān)，而HIPK3 是circRNA 家族一員，且在PE 患者胎盤組織中低表達，可能是治療PE 的分子靶點[6]。同時有研究表明，叉頭盒蛋白A1（forkhead box protein A1,FOXA1）在PE 患者血清中異常表達，調(diào)控滋養(yǎng)細胞增殖、侵襲等過程[7]。但目前臨床有關(guān)血清CCL17、HIPK3、FOXA1 對PE 患者妊娠結(jié)局影響的研究尚少，與PE 患者不良妊娠結(jié)局關(guān)系尚不明確?；诖耍狙芯客ㄟ^檢測PE 患者血清VEGF、PAPPA、CCL17、FOXA1、HIPK3 水平，分析其與病情程度、妊娠結(jié)局的關(guān)系，以期為臨床早期防治PE 提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年3月—2023年3月海南現(xiàn)代婦女兒童醫(yī)院收治的100 例PE 患者為研究對象?；颊吣挲g22～38 歲，平均（30.87±5.24）歲；孕周20～30 周，平均（25.23±3.54）周。根據(jù)病情程度分為中輕度PE 組（68 例）和重度PE 組（32 例）。另取同期本院體檢無妊娠期高血壓疾病的孕婦40 例作為對照組。3 組年齡、孕周、孕前體質(zhì)量指數(shù)（body mass index,BMI）、孕次比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性（見表1）。本研究經(jīng)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，研究對象對本研究內(nèi)容均知情同意。

表1 3組臨床資料比較

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準①符合《妊娠期高血壓疾病診治指南（2020）》[8]中PE 診斷標準；②臨床資料完整，可進行隨訪調(diào)查；③單胎自然妊娠；④孕周20～30 周。

1.2.2 排除標準①糖尿病、腎炎；②胎兒畸形；③精神系統(tǒng)疾??；④重要臟器功能障礙；⑤妊娠前有高血壓史或其他心血管病史；⑥合并惡性腫瘤；⑦自身免疫缺陷或生殖器官畸形；⑧其他妊娠并發(fā)癥或合并癥；⑨凝血功能異常、煙酒不良嗜好。

1.3 分組

根據(jù)妊娠結(jié)局不同將100 例患者分為兩個亞組：結(jié)局不良組（38 例）和結(jié)局良好組（62 例）。不良妊娠結(jié)局情況參考《婦產(chǎn)科學(xué)》[9]進行評定，包括胎兒宮內(nèi)死亡、胎兒窘迫、新生兒呼吸窘迫或死亡、羊水過少、早產(chǎn)、胎盤早剝、HELLP 綜合征等與子癇前期相關(guān)的危及胎兒或新生兒生命健康情況，發(fā)生以上之一視為不良妊娠結(jié)局。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清VEGF、PAPP-A、CCL17水平

采集PE 患者入院次日（對照組體檢當日）空腹靜脈血5 mL，4 000 r/min 離心5 min，離心半徑10 cm，取上層血清采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清VEGF、PAPP-A 和CCL17 水平。試劑盒購自上?？瓢┥锛夹g(shù)有限公司。

1.5 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測FOXA1 mRNA和HIPK3的表達

采用TRIzol LS Reagent 提取血清總RNA（美國默賽飛公司），并轉(zhuǎn)錄為cRNA，iScript cDNA Synthesis kit 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Bio-Rad 公司，配制實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）反應(yīng)體系，采用qRT-PCR 儀（美國伯樂公司CFX96 型）擴增cRNA，獲取循環(huán)閾值（Ct 值）。以GAPDH 為內(nèi)參，qRT-PCR 引物序列見表2。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，共40 個循環(huán)，實驗重復(fù)3 次。采用2-ΔΔCt法計算FOXA1 mRNA、HIPK3 相對表達量。

表2 qRT-PCR引物序列

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料以構(gòu)成比或率（%）表示，比較用χ2檢驗；計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用t檢驗或方差分析，兩兩比較用Bonferroni 法；多因素逐步Logistic回歸模型分析影響PE 患者妊娠結(jié)局的危險因素；繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲線；相關(guān)性分析采用Spearman 法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組血清VEGF、PAPP-A、CCL17、FOXA1 mRNA、HIPK3比較

3 組血清 VEGF、PAPP-A、CCL17、FOXA1 mRNA、HIPK3 比較，經(jīng)方差分析，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。對照組血清VEGF、CCL17、FOXA1 mRNA、HIPK3 均高于PE 組和重度PE 組（P＜0.05），PAPP-A 水平低于PE 組和重度PE 組（P＜0.05）；PE組血清VEGF、CCL17、FOXA1 mRNA、HIPK3 高于重度PE 組（P＜0.05），PAPP-A 水平低于重度PE 組（P＜0.05）。見表3。

表3 3組血清VEGF、PAPP-A、CCL17、FOXA1 mRNA、HIPK3比較（±s）

表3 3組血清VEGF、PAPP-A、CCL17、FOXA1 mRNA、HIPK3比較（±s）

組別對照組PE組重度PE組F 值P 值n 40 68 32 VEGF/（pg/mL）458.55±90.72 297.04±55.73 208.47±52.64 133.725 0.000 PAPP-A/（μg/mL）592.84±160.92 703.05±182.73 942.54±225.35 31.904 0.000 CCL17/（ng/L）863.04±125.73 487.82±76.54 421.04±75.65 265.057 0.000 FOXA1 mRNA 1.02±0.10 0.70±0.08 0.57±0.07 289.581 0.000 HIPK3 0.93±0.15 0.61±0.13 0.38±0.08 173.061 0.000

2.2 影響PE患者妊娠結(jié)局的單因素分析

結(jié)局良好組與結(jié)局不良組年齡、孕前BMI、孕周、孕次、收縮壓、舒張壓、總蛋白、分娩方式、肌酐比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)局良好組與結(jié)局不良組血清VEGF、PAPP-A、CCL17、FOXA1 mRNA、HIPK3 比較，經(jīng)t檢驗，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），結(jié)局良好組血清VEGF、CCL17、FOXA1 mRNA、HIPK3 均高于結(jié)局不良組，PAPP-A 水平低于結(jié)局不良組。見表4。

表4 結(jié)局良好組與結(jié)局不良組臨床資料比較

2.3 影響PE 患者妊娠結(jié)局的多因素逐步Logistic回歸分析

表5 影響PE患者妊娠結(jié)局的因素逐步Logistic回歸分析參數(shù)

2.4 血清 VEGF、PAPP-A、CCL17、FOXA1 mRNA、HIPK3預(yù)測PE患者妊娠結(jié)局的價值

經(jīng)ROC 曲線分析結(jié)果顯示，血清VEGF、PAPPA、CCL17、FOXA1 mRNA、HIPK3 預(yù)測PE 患者妊娠結(jié)局的臨界值分別為260.050 pg/mL、735.250 μg/mL、426.505 ng/L、0.655 和0.415，敏感性分別為67.7%（95% CI：0.593，0.726）、69.4%（95% CI：0.631，0.743）、62.9%（95% CI：0.584，0.695）、75.8%（95% CI：0.714，0.803）和88.7%（95% CI：0.815，0.911）；特異性分別為86.8%（95% CI：0.822，0.913）、63.2%（95% CI：0.575，0.695）、86.8%（95% CI：0.823，0.927）、94.1%（95% CI：0.908，0.981）和97.4%（95% CI：0.943，0.994）。見表6 和圖1。

圖1 血清VEGF、PAPP-A、CCL17、FOXA1 mRNA、HIPK3預(yù)測PE患者妊娠結(jié)局的ROC曲線

表6 血清VEGF、PAPP-A、CCL17、FOXA1 mRNA、HIPK3預(yù)測PE患者妊娠結(jié)局的效能分析

2.5 血清 VEGF、PAPP-A、CCL17、FOXA1 mRNA、HIPK3 與PE 患者病情程度、妊娠結(jié)局的相關(guān)性

Spearman 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，血清VEGF、CCL17、FOXA1 mRNA、HIPK3 與PE 患者病情程度、妊娠結(jié)局均呈負相關(guān)（P＜0.05）；血清PAPP-A 水平與PE 患者病情程度、妊娠結(jié)局均呈正相關(guān)（P＜0.05）。見表7。

表7 血清VEGF、PAPP-A、CCL17、FOXA1 mRNA、HIPK3與PE患者病情程度、妊娠結(jié)局的相關(guān)性

3 討論

PE 作為妊娠期特有疾病，是多種因素、機制、途徑參與的疾病，其發(fā)病機制尚未明確。有研究認為，妊娠期滋養(yǎng)層細胞功能異?；颊咭壮霈F(xiàn)PE，這可能是PE 發(fā)病原因之一[10]。另有研究表明，PE患者常伴有內(nèi)皮細胞功能障礙，這可能也是PE 發(fā)病原因之一[11]。目前病理學(xué)研究尚未給出明確結(jié)論，因此臨床診斷PE 患者仍以實際病情為參考，并予以相應(yīng)藥物治療，但部分重度PE 患者病情進展急驟，妊娠結(jié)局并不理想。有研究指出，以滋養(yǎng)細胞功能異常和內(nèi)皮細胞功能障礙為表現(xiàn)的PE患者，常伴有多種血清指標改變，因而精準篩選有效血清學(xué)指標，做到早發(fā)現(xiàn)、早防治，對改善不良妊娠結(jié)局有積極意義[12]。

本研究結(jié)果顯示，對照組、PE 組、重度PE 組患者血清VEGF、CCL17、HIPK3、FOXA1 mRNA 逐漸降低，PAPP-A 水平逐漸升高，且不同妊娠結(jié)局PE 患者中也存在顯著差異，提示血清VEGF、PAPP-A、CCL17、HIPK3、FOXA1 mRNA 可能參與PE 發(fā)生、發(fā)展過程，并與患者妊娠結(jié)局有關(guān)。VEGF 可誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞增殖、分裂、遷移，調(diào)控血管生成、滋養(yǎng)細胞增殖和分化及浸潤，維持血管內(nèi)皮功能。臨床研究發(fā)現(xiàn)，VEGF 參與胎盤血管形成與重鑄過程[13]。且動物實驗結(jié)果表明，PE大鼠血清和胎盤中VEGF 表達明顯低于正常對照組[14]。而GUO 等[15]研究表明，PE 患者血清VEGF水平顯著低于正常對照組，且隨著PE 病情加重，VEGF 水平呈降低趨勢，與PE 患者病情呈負相關(guān)，并在一定程度上影響妊娠結(jié)局。PISKUN 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，VEGF 與PE 發(fā)病有關(guān)，并通過影響胎盤血供而影響妊娠結(jié)局。以上研究結(jié)果證實血清VEGF參與PE 發(fā)生、發(fā)展過程，并與患者妊娠結(jié)局有關(guān)?？赡苁且驗閂EGF 水平降低會影響滋養(yǎng)層細胞分化，導(dǎo)致內(nèi)皮細胞侵襲、增殖能力下降，造成小動脈重塑障礙，影響內(nèi)皮細胞發(fā)育，導(dǎo)致胎盤缺血、缺氧，誘導(dǎo)PE 發(fā)生及發(fā)展，并且VEGF 低表達可導(dǎo)致胎盤血供障礙，增加不良妊娠結(jié)局風(fēng)險[17]。

PAPP-A 在妊娠期由蛻膜大量產(chǎn)生并進入血循環(huán)，在滋養(yǎng)細胞生長、胎兒生長發(fā)育中起到重要作用。NEUMAN 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，PAPP-A 與部分妊娠期并發(fā)癥有關(guān)。目前多數(shù)研究認為，PE 患者PAPP-A 水平較健康對照組偏高，且隨著病情加重，其水平也會逐漸上升，說明PAPP-A 可作為判斷PE 病情程度的指標之一[19-20]?？赡芤驗镻E 病理改變以全身小血管痙攣為主，易累及胎盤、腎臟等，造成滋養(yǎng)層細胞缺氧、缺血損傷，促進PAPPA 分泌入血循環(huán)；同時PAPP-A 的纖溶抑制效應(yīng)也可能是其隨著病情加重而逐漸上升的原因[21]。劉佩琳等[22]通過Logistic 回歸分析發(fā)現(xiàn)，血清PAPP-A 異常表達與PE 患者不良妊娠結(jié)局有關(guān)，PAPP-A 是評估PE 患者妊娠結(jié)局的潛在指標。但有研究結(jié)果顯示，PAPP-A 低表達可導(dǎo)致胎盤血流灌注增加，不利于臨床妊娠，同時PAPP-A 減少可影響滋養(yǎng)層細胞增殖、分化，導(dǎo)致胎盤功能異常及損傷加重，影響妊娠結(jié)局[23]。CHANG 等[24]研究顯示，PAPP-A異常與胎兒窘迫、自發(fā)性流產(chǎn)等不良事件有關(guān)，PAPP-A 水平降低可增加PE 患者不良妊娠結(jié)局風(fēng)險。一項有關(guān)PAPP-A 基因多態(tài)性的研究顯示，妊娠高血壓疾病患者妊娠早期血清PAPP-A 水平較低，低PAPP-A 水平可導(dǎo)致胎盤血管發(fā)育缺陷，而PE 孕婦血清PAPP-A 水平升高，并通過局部調(diào)節(jié)IGF-I 活性促進損傷，且重度PE 患者PAPP-A 位點基因頻率明顯高于輕度PE 組[25]。由此說明，PAPP-A 與PE 病情程度相關(guān)，并與PE 患者不良妊娠結(jié)局有關(guān)。

趨化因子及其受體是調(diào)節(jié)細胞免疫和維持免疫穩(wěn)定的重要部分，CCL17 可通過CCL17/CCR4 軸廣泛參與免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)過程，同時CCL17 在母體和胎兒免疫調(diào)節(jié)中也發(fā)揮關(guān)鍵作用，有助于維持、建立母體和胎兒局部免疫耐受，保證兩者之間物質(zhì)交換和正常妊娠[26]。孫白云等[27]研究發(fā)現(xiàn)，CCL17 可通過CCL17/CCR4 軸促進Th17 細胞分化過程，進而參與Th17 細胞介導(dǎo)免疫失調(diào)和胎盤血管炎癥反應(yīng)，促進PE 發(fā)生、發(fā)展，同時該研究還發(fā)現(xiàn)CCL17 還與母嬰結(jié)局有關(guān)，低CCL17 水平是PE 患者妊娠結(jié)局不良的危險因素。TANABE 等[28]研究發(fā)現(xiàn)，CCL17 可同時趨化Th17 和調(diào)節(jié)性T 細胞，參與局部免疫調(diào)節(jié)。另一項研究結(jié)果顯示，CCL17 和CCR4 表達下降會破壞母-胎界面特殊免疫耐受狀態(tài)，致使母體對胎兒免疫耐受力降低，導(dǎo)致自然流產(chǎn)，而高水平的CCL17、CCR4 在維持胎兒正常發(fā)育中有著重要作用[29]。由此說明CCL17 缺失可促使Th17 細胞分泌炎癥因子IL-17，破壞母-胎免疫耐受平衡，導(dǎo)致胎兒發(fā)育不良或胎盤小血管炎癥，促進PE 病情進展，導(dǎo)致PE 患者不良妊娠結(jié)局。

circRNA 在血液中穩(wěn)定存在。近期有研究顯示，circRNA 0085296 可調(diào)控滋養(yǎng)細胞增殖、侵襲，影響血管形成，從而影響PE 進展[30-31]；而circRNA 0007121 在PE 患者胎盤組織中表達下調(diào)，其可調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細胞侵襲、遷移等，抑制PE 進展，說明circRNA 表達異常與PE 發(fā)病有關(guān)，而HIPK3 作為circRNA 成員之一，也可能參與PE 的發(fā)生、發(fā)展。ZHANG 等[32]研究發(fā)現(xiàn)，HIPK3 可通過調(diào)控miR-346表達，影響滋養(yǎng)層細胞遷移、侵襲，參與PE 的發(fā)生、發(fā)展。沈家慧等[33]研究發(fā)現(xiàn)，PE 患者血清HIPK3 異常表達，并且妊娠結(jié)局良好的PE 患者血清HIPK3 水平顯著高于結(jié)局不良患者，說明HIPK3 表達下降與PE 病理變化有關(guān)。推測其可能機制為HIPK3 與miRNA 靶向結(jié)合，調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細胞遷移、侵襲，抑制其浸潤，造成血管阻力增加和胎盤血管減少，從而調(diào)控PE 進展，影響妊娠結(jié)局，但其具體作用機制還需深入研究。FOXA1 是轉(zhuǎn)錄因子FOX 家族成員之一，可參與調(diào)控細胞周期，與激素依賴性癌癥發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。且有研究顯示，F(xiàn)OXA1 水平與PE 患者血壓呈負相關(guān)，與孕周和新生兒出生體重呈正相關(guān)，并參與滋養(yǎng)層細胞的遷移、侵襲和凋亡等過程[34]。沈敦雋等[35]研究發(fā)現(xiàn)，血清FOXA1 mRNA 在輕、重度PE 患者中逐漸降低，同時妊娠結(jié)局不良患者血清FOXA1 mRNA 低于結(jié)局良好患者，說明血清FOXA1參與PE 發(fā)生、發(fā)展，并與不良妊娠結(jié)局有關(guān)。ZHU等[36]研究也發(fā)現(xiàn)，PE 患者血清FOXA1 異常表達，并與患者病情程度、妊娠結(jié)局有關(guān)。但目前臨床研究多為FOXA1 表達與癌癥的關(guān)系，關(guān)于FOXA1 對PE患者妊娠結(jié)局的影響少見報道，因此FOXA1 參與PE發(fā)生、發(fā)展及影響妊娠結(jié)局的具體機制還尚需進一步研究。

Spearman 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，血清VEGF、CCL17、FOXA1 mRNA、HIPK3 與PE 患者病情程度、妊娠結(jié)局均呈負相關(guān)，這為臨床早期診治PE 患者提供了新方向。多因素逐步Logistic 回歸分析結(jié)果顯示，VEGF、PAPP-A、CCL17、FOXA1 mRNA、HIPK3 是影響PE 患者妊娠結(jié)局的獨立因素；ROC 曲線結(jié)果分析表明，血清VEGF、PAPP-A、CCL17、FOXA1 mRNA、HIPK3 預(yù)測PE 患者妊娠結(jié)局的敏感性和特異性均較高，這提示上述血清指標對PE 患者妊娠結(jié)局均有一定預(yù)測價值，同時CCL17、FOXA1 mRNA、HIPK3 或可成為評估PE 患者妊娠結(jié)局不良新的有效血清學(xué)標志物。

綜上所述，PE 患者血清VEGF、PAPP-A、CCL17、FOXA1 mRNA、HIPK3 異常表達，且均與病情程度、妊娠結(jié)局有關(guān)；同時也是PE 患者妊娠結(jié)局不良的影響因素，對PE 患者妊娠結(jié)局均有一定預(yù)測價值。因此，早期檢測血清VEGF、PAPP-A、CCL17、FOXA1 mRNA、HIPK3 有助于評估PE 患者病情和妊娠結(jié)局，及時實施干預(yù)措施，對改善母嬰結(jié)局有重要意義。但FOXA1 mRNA、HIPK3 在PE 發(fā)生、發(fā)展中的具體機制尚不明確，并且由于樣本量較少，未能深入分析FOXA1 mRNA、HIPK3 與PE 患者妊娠結(jié)局的關(guān)系，后續(xù)研究有待增加樣本量，進一步深入探究。