HPLC 法測定鮭降鈣素鼻用噴霧劑中有關(guān)物質(zhì)

邢文靜，伏圣青，韓曉捷

天津市藥品檢驗研究院，天津 300070

鮭降鈣素是一種骨代謝調(diào)節(jié)藥，能調(diào)節(jié)成骨細胞活性，抑制體內(nèi)破骨細胞，還能改善患者骨吸收，適用于骨質(zhì)疏松癥、骨質(zhì)減少引起的骨痛、畸形性骨炎、高血鈣癥和神經(jīng)營養(yǎng)不良癥等[1-5]。鮭降鈣素制劑主要有鮭降鈣素注射液、鮭降鈣素鼻用噴霧劑，而鮭降鈣素鼻用噴霧劑比鮭降鈣素注射液更易被患者接受?！吨袊幍洹?020 年版二部收載了鮭降鈣素、鮭降鈣素注射液和注射用鮭降鈣素的質(zhì)量標準[6]。在已收載的制劑中有關(guān)物質(zhì)檢查項下，對降鈣素C 進行了限定，并未對其他具體雜質(zhì)做出要求?，F(xiàn)行版《歐洲藥典》（EP11）[7]、《美國藥典》（USP43）[8]和《日本藥典》（JP18）[9]收載了鮭降鈣素，并且EP11 中將N-乙酰半胱氨酰鮭降鈣素、9-D-亮氨酸鮭降鈣素、去-22-酪氨酸鮭降鈣素作為已知雜質(zhì)進行了控制，明確了其限度。鮭降鈣素作為人工合成多肽類藥物，具有不穩(wěn)定、易降解的特點，需對鮭降鈣素產(chǎn)品中雜質(zhì)進行嚴格控制[10]。本實驗采用高效液相色譜-加校正因子的主成分自身對照法測定了鮭降鈣素鼻用噴霧劑中雜質(zhì)，方法準確、可靠、專屬性強，為鮭降鈣素鼻用噴霧劑的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 儀器與試驗

Waters e2695 高效液相色譜儀，配備2489 紫外檢測器；梅特勒托利多XS205 十萬分之一電子天平。

鮭降鈣素對照品（批號140665-201804，質(zhì)量分數(shù)89.7%，中國食品藥品檢定研究院）；降鈣素C 對照品（批號140808-201802，質(zhì)量分數(shù)88.2%，中國食品藥品檢定研究院）；N-乙酰半胱氨酰鮭降鈣素（雜質(zhì)A，批號1086210-R06010，質(zhì)量分數(shù)100%，USP）；9-D-亮氨酸鮭降鈣素（雜質(zhì)B，批號4022-001A1，質(zhì)量分數(shù)96.8%，TLC）；去-22-酪氨酸鮭降鈣素（雜質(zhì)C，批號4022-061A1，質(zhì)量分數(shù)93.5%，TLC）；鮭降鈣素鼻用噴霧劑樣品來自瑞士Future Health Pharma GmbH 公司，規(guī)格2 mL∶4 400 IU，批號分別為DH100102、DH100103、DH 100108；四甲基氫氧化銨25%水溶液（分析純），磷酸（分析純），乙腈（色譜純），超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Macherey-Nagel Nucleosil 100-5 C18AB 色譜柱（250 mm×4.0 mm，5 μm）；以0.04 mol/L 四甲基氫氧化銨溶液（用磷酸調(diào)pH 2.5）–乙腈（9∶1）為流動相A，以0.04 mol/L 四甲基氫氧化銨溶液（用磷酸調(diào)pH 2.5）–乙腈（4∶6）為流動相B，梯度洗脫（0～30 min，流動相A 從72%降至50%；30～35 min，流動相A 從50%降至5%；35～45 min，流動相A 保持5%；45～49 min，流動相A 從5%增加至72%；49～60 min，流動相A 保持72%）；檢測波長為220 nm；體積流量為1.0 mL/min；進樣量為100 μL；柱溫為65 ℃；樣品室溫度：10 ℃。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品貯備液的制備 精密稱取鮭降鈣素、降鈣素C、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C 對照品各10 mg，分別置20 mL 量瓶中，加流動相A 溶解，分別制成0.5 mg/mL 的對照品貯備液。

2.2.2 雜質(zhì)定位溶液的制備 分別精密量取降鈣素C、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C 對照品貯備液適量，加流動相A 稀釋，均制成5 μg/mL 雜質(zhì)定位溶液。

2.2.3 系統(tǒng)適用性溶液的制備 分別精密量取鮭降鈣素、降鈣素C、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C 對照品貯備液各1 mL，置同一個100 mL 量瓶中，加流動相A 稀釋至刻度，即得。

2.2.4 混合對照品溶液的制備 分別精密量取降鈣素C、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C 對照品貯備液各1 mL，置于同一個100 mL 量瓶中，用流動相A 稀釋至刻度，制成含各雜質(zhì)對照品約5 μg/mL 的混合對照品溶液。

2.2.5 供試品溶液的制備 精密稱取鮭降鈣素鼻用噴霧劑5 mL，置10 mL 量瓶中，加流動相A 稀釋至刻度，即得。

2.2.6 自身對照溶液 精密量取鮭降鈣素鼻用噴霧劑5 mL，置200 mL 量瓶中，用流動相A 稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.7 空白輔料溶液 按鮭降鈣素鼻用噴霧劑的處方稱取各輔料適量，溶解，制備空白輔料溶液。

2.3 專屬性和系統(tǒng)適用性試驗

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗 分別取空白輔料溶液、降鈣素C、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C 雜質(zhì)定位溶液、系統(tǒng)適用性溶液、鮭降鈣素鼻用噴霧劑供試品溶液（批號DH100102）各100 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖1。結(jié)果顯示流動相A 和空白輔料對主峰和雜質(zhì)測定均無干擾；各成分分離良好，鮭降鈣素主峰與雜質(zhì)A 分離度為4.0，符合要求。降鈣素C、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C 相對保留時間分別為0.5～0.6、1.15、0.8、0.9。

圖1 空白輔料溶液（A）、系統(tǒng)適用性試驗溶液（B）和鮭降鈣素鼻用噴霧劑（C）HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of pharmaceutical excipients solution (A),system suitability solution (B),and Salmon Calcitonin Nasal Spray (C)

2.3.2 破壞實驗 分別取鮭降鈣素鼻用噴霧劑5 mL，置10 mL 量瓶中，進行高溫（60 ℃放置6 h）、強酸（1 mol/L 鹽酸溶液1 mL 放置1 h，中和）、強堿（1 mol/L 氫氧化鈉溶液1 mL 放置10 min，中和）、強光照（4 500 lx 下照射48 h）、強氧化（加入30%雙氧水1 mL 放置1 h）作用后，分別加流動相A 稀釋至刻度，進樣測定。結(jié)果鮭降鈣素鼻用噴霧在光照、強酸、氧化條件下相對穩(wěn)定；在高溫條件下，降鈣素C、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C 有明顯增加，雜質(zhì)A 略有增加；在強堿條件下，雜質(zhì)B、雜質(zhì)C 有明顯增加，各主要降解雜質(zhì)之間、雜質(zhì)與主峰之間均能有效分離，且物料平衡，說明此方法對雜質(zhì)能有效分離和檢測。

2.4 校正因子和線性范圍考察試驗

精密量取鮭降鈣素、降鈣素C、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C 對照品貯備液適量，加流動相A 分別均稀釋制成0.20、1.25、2.5、3.75、5、6.25、7.50 μg/mL對照品系列溶液，進樣測定，記錄色譜圖。以質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸，計算回歸方程，用標準曲線法計算雜質(zhì)的校正因子，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，鮭降鈣素及其雜質(zhì)均在0.20～7.50 μg/mL 線性關(guān)系良好，雜質(zhì)A、B、C的校正因子均超出0.90～1.10，因此有關(guān)物質(zhì)檢查項下已知雜質(zhì)可按加校正因子的主成分自身對照法計算。

表1 線性關(guān)系和校正因子Table 1 Linear relationship and correction factor

2.5 檢測限和定量限考察

取對照品貯備液，用流動相A 逐步稀釋，進樣測定，記錄色譜圖，以信噪比為3 時對應(yīng)的質(zhì)量濃度作為檢測限，以信噪比為10 時對應(yīng)的質(zhì)量濃度作為定量限，結(jié)果鮭降鈣素、降鈣素C、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C 的檢測限分別為25、26、23、29、25 ng，定量限分別為83、51、46、57、82 ng。

2.6 重復性試驗

取鮭降鈣素鼻用噴霧劑（批號DH100102），平行6 份，制備自身對照溶液和供試品溶液，進樣測定，記錄色譜圖，結(jié)果降鈣素C、雜質(zhì)A、雜質(zhì)C的平均質(zhì)量濃度分別為0.80%、0.67%、0.17%，RSD值分別為0.9%、1.1%、1.6%。雜質(zhì)B 低于定量限。

2.7 精密度試驗

2.7.1 儀器精密度試驗 取系統(tǒng)適用性溶液，連續(xù)進樣6 次，計算峰面積，結(jié)果鮭降鈣素、降鈣素C、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C 峰面積的RSD 值分別為0.6%、0.7%、1.3%、0.9%、0.8%。

2.7.2 中間精密度試驗 分別以不同人員（2 人）、不同時間、不同儀器按2.6 項下方法分析。結(jié)果降鈣素C、雜質(zhì)A、雜質(zhì)C 的平均質(zhì)量濃度的RSD 值分別為1.0%、1.3%、1.5%。雜質(zhì)B 低于定量限。

2.8 穩(wěn)定性試驗

取系統(tǒng)適用性溶液于10 ℃放置，分別于0、2、4、8、20 h 進樣測定，結(jié)果降鈣素C、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C 峰面積的RSD 值分別為0.5%、1.0%、1.3%、0.8%，表明供試品溶液于10 ℃放置時20 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 回收率試驗

精密取鮭降鈣素鼻用噴霧劑（批號DH100102）5 mL，置10 mL 量瓶中，分為3 組，分別加入混合對照品溶液80、100、120 μL，加入流動相A 至刻度，制成加標濃度相當于雜質(zhì)限度80%、100%、120%的溶液，每個質(zhì)量濃度制備3 份，進樣測定，計算回收率，結(jié)果降鈣素C、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C 平均回收率分別為98.1%、98.9%、100.5%、99.7%，RSD 值分別為1.6%、1.5%、1.0%、1.1%。

2.10 耐用性試驗

考察在流動相pH 值±0.2、體積流量變化±0.1 mL/min、柱溫變化±2 ℃、波長變化±2 nm、流動相比例變化±2%的條件下對測定結(jié)果的影響。結(jié)果在各條件下系統(tǒng)適用性均符合要求，各已知雜質(zhì)測定結(jié)果RSD 值均小于10%，未知雜質(zhì)總量測定結(jié)果的RSD 值小于10%，提示色譜系統(tǒng)參數(shù)耐用性良好。

2.11 樣品測定

取鮭降鈣素鼻用噴霧劑3 批，分別制備混合對照品溶液、供試品溶液和自身對照溶液，進樣測定，分別按加校正因子的主成分自身對照法（方法Ⅰ）和主成分外標法（方法Ⅱ）計算有關(guān)物質(zhì)的質(zhì)量濃度，結(jié)果見表2。參考《歐洲藥典》（EP11）、《美國藥典》（USP43）中對已知雜質(zhì)、單個未知雜質(zhì)和總雜質(zhì)的限度要求，對3 批鮭降鈣素鼻用噴霧劑樣品進行了檢測，結(jié)果均符合標準規(guī)定。

表2 鮭降鈣素鼻用噴霧劑中有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果（n=2）Table 2 Determination of related substances in in Salmon Calcitonin Nasal Spray (n=2)

3 討論

根據(jù)現(xiàn)行版《歐洲藥典》（EP11）、《美國藥典》（USP43）中鮭降鈣素、鮭降鈣素注射液和注射用鮭降鈣素中有關(guān)物質(zhì)檢查的色譜條件，色譜柱均采用C18柱，流動相均采用四甲基氫氧化銨溶液–乙腈體系，檢測波長均為220 nm，柱溫均為65 ℃。經(jīng)過色譜條件的篩選和優(yōu)化，調(diào)整流動相比例達到較好的雜質(zhì)分離效果，并排除輔料干擾，同時分別考察了Vydac C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Macherey-Nagel Nucleosil 100-5 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Macherey-Nagel Nucleosil 100-5 C18AB（250 mm×4.0 mm，5 μm）3 種不同品牌型號的C18色譜柱，所得圖譜顯示主峰與降鈣素C、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C 以及其他相鄰雜質(zhì)的分離度均符合要求，方法適用性較強。

《中國藥典》2020 年版二部、《歐洲藥典》（EP11）、《美國藥典》（USP43）中均采用峰面積歸一化法控制鮭降鈣素中有關(guān)物質(zhì)的限量，但由于各雜質(zhì)與主成分的響應(yīng)因子不同，采用峰面積歸一化法測定雜質(zhì)結(jié)果會產(chǎn)生誤差。本實驗以鮭降鈣素為對照，以主成分回歸直線斜率與雜質(zhì)回歸直線斜率的比計算校正因子，用于校正雜質(zhì)的實測峰面積。結(jié)果采用加校正因子的主成分自身對照法可更準確地測定鮭降鈣素鼻用噴霧劑中有關(guān)物質(zhì)。因此，在雜質(zhì)對照品較難獲得或造價過高的情況下，引入校正因子更便捷準確。

現(xiàn)行版各國藥典中均規(guī)定鮭降鈣素中有關(guān)物質(zhì)的限量，《歐洲藥典》（EP11）中明確了已知雜質(zhì)的限度，《美國藥典》（USP43）收錄了鮭降鈣素鼻用制劑，但并未規(guī)定制劑中有關(guān)物質(zhì)限度。本實驗規(guī)定了4 種已知雜質(zhì)，其中雜質(zhì)A、B、C 為鮭降鈣素固相合成中引入的雜質(zhì)，而降鈣素C 為鮭降鈣素鼻用噴霧劑中主要降解雜質(zhì)，降鈣素C 含量變化是表征該制劑穩(wěn)定性的重要指標。

綜上，本研究建立了鮭降鈣素鼻用噴霧劑中有關(guān)物質(zhì)檢查的HPLC 測定法，測定了已知雜質(zhì)降鈣素C 和雜質(zhì)A、B、C，并進行了方法學驗證，結(jié)果表明，該方法簡便、快速，可作為鮭降鈣素鼻用噴霧劑中有關(guān)物質(zhì)的檢測方法。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突