鱉甲煎丸抗肝纖維化作用機(jī)制的研究進(jìn)展

孫悅，劉瑩，王磊，蔡嶸，董林毅

1.天津市第五中心醫(yī)院生態(tài)城醫(yī)院 藥劑科，天津 300467

2.天津醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，天津 300070

肝臟疾病已成為危及人類(lèi)健康的普遍疾病，全世界與肝硬化相關(guān)的死亡人數(shù)逐年增加，且造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。目前認(rèn)為，肝纖維化是肝臟對(duì)于各種病因（病毒性肝炎、酒精或藥物性肝損傷、代謝相關(guān)脂肪性肝病、自身免疫性肝病、膽汁淤積性肝病、肝內(nèi)寄生蟲(chóng)感染等）所致的慢性肝損傷而引發(fā)自身愈合修復(fù)的一種反應(yīng)，是慢性肝臟疾病向肝硬化進(jìn)展的共同病理過(guò)程。其主要病理機(jī)制是肝星狀細(xì)胞的激活，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的異常增生和沉積，造成膠原蛋白降解失衡，最終形成纖維性瘢痕。若不及時(shí)治療，則會(huì)發(fā)展為肝硬化，甚至肝癌。目前尚無(wú)治療肝纖維化、肝硬化的有效手段和藥物，仍需進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)。但已有部分中藥經(jīng)循證醫(yī)學(xué)證實(shí)具有減輕和改善肝纖維化的作用。鱉甲煎丸出自東漢著名醫(yī)家張仲景《金匱要略·瘧病脈癥并治第四》，為治療瘧病的經(jīng)典方劑，主要由鱉甲膠、射干、黃芩、柴胡、鼠婦蟲(chóng)、干姜、大黃、白芍（炒）、桂枝、葶藶子、石韋、姜厚樸、牡丹皮、瞿麥、凌霄花、姜半夏、黨參、土鱉蟲(chóng)（炒）、阿膠、蜂房（炒）、硝石（精制）、蜣螂、桃仁共23 味中藥組成，《中國(guó)藥典》1977 年版記載該方具有活血化瘀、軟堅(jiān)散結(jié)之功效，可用于治療腹部腫塊，肝脾腫大。2020 年《鱉甲煎丸治療肝纖維化臨床應(yīng)用專(zhuān)家共識(shí)》中推薦并給出病毒性肝炎后肝纖維化和代謝相關(guān)脂肪性肝病纖維化治療的用法用量[2]。鱉甲煎丸可調(diào)節(jié)免疫、調(diào)控相關(guān)因子、調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路、調(diào)控細(xì)胞周期，發(fā)揮抗肝纖維化作用。因此本文總結(jié)了鱉甲煎丸抗肝纖維化作用機(jī)制的研究進(jìn)展，以期為鱉甲煎丸今后的研究方向和臨床應(yīng)用提供參考。

1 調(diào)節(jié)免疫

1.1 巨噬細(xì)胞

各種病因?qū)е赂闻K損傷后，體內(nèi)的免疫細(xì)胞（巨噬細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞等）被激活并募集，產(chǎn)生免疫應(yīng)答，并釋放細(xì)胞因子、趨化因子等，調(diào)控肝纖維化進(jìn)展。巨噬細(xì)胞在肝內(nèi)微環(huán)境的刺激下，一般分為經(jīng)典的促炎表型（M1 型）和抗炎表型（M2型）[3-4]。促炎型巨噬細(xì)胞表達(dá)一系列促炎因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6 等，參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)和吞噬殺滅病原微生物?？寡仔途奘杉?xì)胞可分泌抗炎因子（如IL-10），促進(jìn)組織修復(fù)和免疫調(diào)節(jié)[5]。研究表明，調(diào)控肝臟巨噬細(xì)胞的極化有可能成為逆轉(zhuǎn)肝纖維化的潛在靶點(diǎn)[6]。劉洋等[7]采用CoCl2刺激建立小鼠巨噬細(xì)胞體外缺氧模型，將細(xì)胞隨機(jī)分為鱉甲煎丸0.55、1.1、2.2 g/kg 組培養(yǎng)24 h，采用Western blotting 和RTPCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，鱉甲煎丸可下調(diào)IL-1β、IL-6、TNFα 等促炎因子的表達(dá)，上調(diào)CD163、IL-10 抗炎因子的表達(dá)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞從M1 促炎型向M2 抗炎型轉(zhuǎn)化，起到消除炎癥、促進(jìn)組織修復(fù)、減輕肝纖維化的作用。

1.2 T 淋巴細(xì)胞

T 淋巴細(xì)胞中CD4+T 和CD8+T 細(xì)胞是最主要的兩類(lèi)T 細(xì)胞亞群。CD4+T 細(xì)胞可識(shí)別抗原，激活B 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，促進(jìn)免疫反應(yīng)。CD4+T 可分為不同亞型，并分泌不同細(xì)胞因子。其中Th17 亞型分泌的IL-17A 為強(qiáng)促纖維化因子[8]，可刺激TNFα、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）分泌，激活肝星狀細(xì)胞，進(jìn)一步上調(diào)Th17 表達(dá)形成正反饋，促進(jìn)纖維化持續(xù)進(jìn)展。陳松林等[9]對(duì)60 例瘀血阻絡(luò)型慢性乙肝患者的外周血中Th17 細(xì)胞水平進(jìn)行研究，治療組早晚服用鱉甲煎丸水煎劑（1 劑/d），對(duì)照組皮下注射IFN-α2a（600 萬(wàn)單位，3 次/周），連續(xù)治療24 周，結(jié)果采用鱉甲煎丸治療后，外周血中Th17細(xì)胞水平明顯降低，且優(yōu)于對(duì)照組，患者的癥狀體征、肝功能具有明顯改善。CD8+T 細(xì)胞是慢性肝病免疫激活的主要參與者，可以靶向受損的肝細(xì)胞釋放細(xì)胞毒，導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡，還可以直接激活肝星狀細(xì)胞[10]。孟晨鑫等[11]對(duì)110 名慢性乙肝肝纖維化患者進(jìn)行臨床研究，對(duì)照組肌肉注射重組人干擾素α-2b（500 萬(wàn)IU，1 次/d），觀察組給予重組人干擾素α-2b 聯(lián)合口服鱉甲煎丸（3 g/次，2 次/d），連續(xù)治療24 周，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，觀察組在改善肝功能、肝纖維化指標(biāo)方面明顯優(yōu)于對(duì)照組，聯(lián)合應(yīng)用鱉甲煎丸可明顯降低CD8+，升高CD4+，提高CD4+/CD8+水平，改善細(xì)胞免疫狀態(tài)，表明鱉甲煎丸可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫功能達(dá)到改善肝功能、減輕肝纖維化作用。

2 調(diào)控相關(guān)因子

2.1 基質(zhì)金屬蛋白酶-基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑（MMP/TIMP）

MMP 是參與細(xì)胞外基質(zhì)降解的主要蛋白酶，TIMP 可以抑制組織中MMP 的蛋白水解活性，MMP/TIMP 構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)降解的主要分子系統(tǒng)，成為治療肝臟疾病的重要靶點(diǎn)之一[12]。MMP 在正常肝臟組織通?；钚暂^低，當(dāng)組織受損或存在炎癥時(shí)表達(dá)升高。TIMP 的過(guò)度表達(dá)會(huì)抑制MMP-1、MMP-2、MMP-9 等多個(gè)MMP 的活性，阻礙纖維化基質(zhì)的降解，導(dǎo)致間質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)廣泛積累[13]。因此，選擇性的增加MMP 的表達(dá)和降低TIMP 的過(guò)度表達(dá)可能會(huì)改善肝纖維化程度[14]。李風(fēng)華[15]以CCl4橄欖油誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，分別ig 給予秋水仙堿（0.1 mg/kg）、鱉甲煎丸0.55、1.1、2.2 g/kg，連續(xù)11 周，通過(guò)RT-PCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)鱉甲煎丸可升高M(jìn)MP-9mRNA 表達(dá)，降低TIMP-1mRNA 表達(dá)，調(diào)節(jié)MMP-9/TIMP-1 比例，糾正細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解失衡，且2.2 g/kg 組優(yōu)于秋水仙堿組。程傳浩等[16]以豬血清誘導(dǎo)免疫損傷性肝纖維化大鼠作為模型，ig 給予鱉甲煎丸（1.6 g/kg）和秋水仙堿（0.3 mg/kg），觀察發(fā)現(xiàn)兩種藥物對(duì)MMP-1 的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但均可降低TIMP-1 表達(dá)，且鱉甲煎丸的效果明顯優(yōu)于秋水仙堿。臨床研究發(fā)現(xiàn)，在慢性乙型肝炎合并肝硬化患者的治療中，鱉甲煎丸與抗病毒藥聯(lián)用可更有效地降低患者血清中炎性因子IL-1β、TNF-α、MMP-2 水平，減輕肝纖維化進(jìn)展，促進(jìn)肝功能恢復(fù)[17-18]。

2.2 瘦素

瘦素是白色脂肪細(xì)胞分泌的一種激素，可促進(jìn)肝星狀細(xì)胞活化和肝纖維化進(jìn)展[19]。瘦素可影響肝星狀細(xì)胞活化的多條相關(guān)信號(hào)通路，如Janus 激酶2（JAK2）/信號(hào)傳導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）信號(hào)通路、磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路、刺猬蛋白（Hedgehog）信號(hào)通路、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）/Smads 信號(hào)通路、Wnt/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）信號(hào)通路[20]。文彬等[21]研究證實(shí)，在肝纖維化大鼠的肝臟組織中瘦素及其受體表達(dá)明顯增加，且與炎性細(xì)胞數(shù)量、纖維量呈正相關(guān)。給予鱉甲煎丸1.1、2.2 g/kg 治療6 周，采用免疫組化法測(cè)定瘦素及其受體的表達(dá)水平，結(jié)果顯示鱉甲煎丸可抑制瘦素表達(dá)，但對(duì)瘦素受體表達(dá)無(wú)明顯影響?？梢?jiàn)鱉甲煎丸對(duì)瘦素的抑制作用也可能是其抗肝纖維化的作用機(jī)制之一。

3 調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路

3.1 TGF-β/Smad 信號(hào)通路

TGF-β/Smad 信號(hào)通路在肝星狀細(xì)胞的激活和肝纖維化過(guò)程中起到十分重要的作用。TGF-β1 是最重要的促纖因子，可通過(guò)Smad 依賴(lài)和Smad 非依賴(lài)通路（如MARK、PI3K 等）介導(dǎo)基質(zhì)生成[22]。TGF-β/Smad 信號(hào)通路的激活會(huì)直接刺激α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）的表達(dá)，導(dǎo)致肝星狀細(xì)胞的增殖、分化和膠原合成。孫玉鳳等[23]將CCl4造模肝纖維化大鼠分別給予秋水仙堿（0.1 mg/kg）、鱉甲煎丸（0.55、1.1、2.2 g/kg）治療11 周。采用免疫組化法和RT-PCR 法測(cè)定肝組織中α-SMA 蛋白、TGF-β1、Smad3mRNA 的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鱉甲煎丸可以抑制α-SMA 蛋白表達(dá)，下調(diào)TGF-β1、Smad3mRNA 的表達(dá)水平，2.2 g/kg 組效果更顯著。由此可見(jiàn)鱉甲煎丸可通過(guò)抑制TGF-β1/Smad 信號(hào)通路傳導(dǎo)，抑制肝星狀細(xì)胞激活，發(fā)揮抗纖維化作用。張建偉等[24]研究同樣證實(shí)了該觀點(diǎn)，并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)鱉甲煎丸在抑制TGF-β1 和Smad3 表達(dá)的同時(shí)可提高Smad7 表達(dá)，調(diào)節(jié)Smad3 和Smad7 表達(dá)失衡，減慢肝纖維化進(jìn)展。結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）/CCN2 基因被認(rèn)為是TGF-β1 的下游分子，是一種強(qiáng)的促纖維化因子[25]。在肝星狀細(xì)胞中，CTGF/CCN2 在TGF-β1的介導(dǎo)下，轉(zhuǎn)錄表達(dá)增多，進(jìn)而促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的黏附、增殖、遷移和膠原沉積[26]。在CCl4造模的肝纖維化大鼠模型的研究中發(fā)現(xiàn)，在肝纖維化大鼠肝臟組織中CTGFmRNA 表達(dá)水平明顯增高，與肝纖維化程度呈正相關(guān)。鱉甲煎丸可抑制大鼠肝組織中TGF-β1、CTGF 等促纖維化因子的表達(dá)，減輕大鼠肝纖維化程度[15,27]。

3.2 核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路

NF-κB 信號(hào)通路是非常重要的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑，參與免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖和凋亡等多個(gè)生物過(guò)程。NF-κB 信號(hào)通路與肝星狀細(xì)胞的活化、增殖密切相關(guān)，參與肝纖維化的進(jìn)展過(guò)程[28]。因此，阻斷NF-κB 信號(hào)通路傳導(dǎo)可能具有抗肝纖維化作用。陳冠新等[29]以CCl4造模的肝纖維化大鼠為模型，分別給予0.55、1.1、2.2 g/kg 鱉甲煎丸治療8 周，通過(guò)免疫組化和Western blotting 分析發(fā)現(xiàn)，鱉甲煎丸可下調(diào)大鼠肝組織中p65 蛋白水平，提高NF-κB 抑制蛋白α（IκBa）表達(dá)，阻斷NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)而抑制下游靶基因TGF-β1 表達(dá)，發(fā)揮抗纖維化作用。此外，多種刺激均可導(dǎo)致NF-κB信號(hào)通路激活，如脂多糖（LPS）、氧化應(yīng)激、肝內(nèi)微環(huán)境改變等。龐杰等[30]進(jìn)行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，0.55、1.1、2.2 g/kg 鱉甲煎丸含藥血清作用于血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞培養(yǎng)24 h，采用MTT 和EdU 檢測(cè)肝星狀細(xì)胞增殖，結(jié)果表明鱉甲煎丸可顯著抑制肝星狀細(xì)胞增殖。通過(guò)Western blotting 測(cè)定TLR-4/NF-κB 信號(hào)通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鱉甲煎丸可降低TLR4、p-IKK 表達(dá)，升高p-IκBα 表達(dá)，對(duì)TLR4/NF-κB 信號(hào)通路產(chǎn)生抑制作用，且濃度與抑制作用呈正相關(guān)。該實(shí)驗(yàn)證實(shí)了鱉甲煎丸可通過(guò)影響TLR4/NF-κB 信號(hào)通路抑制肝星狀細(xì)胞增殖，產(chǎn)生抗肝纖維化作用。劉洋等[7]建立小鼠巨噬細(xì)胞體外缺氧模型，將0.55、1.1、2.2 g/kg 鱉甲煎丸含藥血清和0.56 g/kg 扶正化瘀膠囊含藥血清作用于巨噬細(xì)胞RAW264.7 培養(yǎng)24 h，采用Western blotting 法和細(xì)胞免疫熒光法測(cè)定HIF-1α/NF-κB 信號(hào)通路上相關(guān)蛋白的表達(dá)和分布發(fā)現(xiàn)，鱉甲煎丸可以減少缺氧導(dǎo)致的巨噬細(xì)胞中HIF-1α堆積，降低NF-κB p65 的富集和NF-κB p65、IKK、IκBα 的磷酸化，阻止HIF-1α/NF-κB 信號(hào)通路的激活，進(jìn)而抑制下游炎性因子的釋放。因此鱉甲煎丸對(duì)NF-κB 信號(hào)通路具有阻斷作用，產(chǎn)生抗肝纖維化作用。

3.3 Wnt/β-catenin 信號(hào)通路

Wnt/β-catenin 信號(hào)通路在維持肝臟生理功能、肝組織的修復(fù)和再生以及保持肝內(nèi)穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要作用[31]。在肝臟受到刺激或損傷后，Wnt 信號(hào)被激活，β-catenin 積聚入核，調(diào)控下游靶基因，促進(jìn)肝臟修復(fù)或?qū)е录膊∵M(jìn)展[32]。Wnt/β-catenin 激活可刺激肝星狀細(xì)胞活化和纖維化[33]。文彬等[34]證實(shí)了鱉甲煎丸通過(guò)抑制Wnt/β-catenin 信號(hào)通路傳導(dǎo)而發(fā)揮抗肝纖維化作用。將0.45、0.9、1.8 g/kg 鱉甲煎丸含藥血清作用于大鼠肝星狀細(xì)胞（HSC-T6）培養(yǎng)24 h 后，采用Western blotting 和ELISA 檢測(cè)Wnt/βcatenin 信號(hào)通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明鱉甲煎丸通過(guò)抑制β-catenin、p-GSK-3β 蛋白表達(dá)，阻斷Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的傳導(dǎo)，進(jìn)而抑制下游TIMP-1 表達(dá)，1.8 g/kg 組還可上調(diào)MMP-2、MMP-9 表達(dá)。孫海濤等[35]證實(shí)了鱉甲煎丸可通過(guò)下調(diào)βcatenin 表達(dá)調(diào)控NF-κB 信號(hào)通路。將0.45、0.9、1.8 g/kg 鱉甲煎丸含藥血清和0.2 mg/kg 秋水仙堿含藥血清作用于HSC-T6 培養(yǎng)24 h，采用qPCR 和免疫熒光檢測(cè)β-catenin 表達(dá)，發(fā)現(xiàn)鱉甲煎丸可降低βcatenin 表達(dá)水平。采用Western blotting 法測(cè)定p65、p50 表達(dá)，發(fā)現(xiàn)鱉甲煎丸抑制p65 表達(dá)，對(duì)p50 無(wú)明顯影響，推測(cè)鱉甲煎丸可通過(guò)下調(diào)β-catenin 表達(dá)而抑制NF-κB 信號(hào)通路活化。陳冠新[36]進(jìn)一步證實(shí)了在CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型中，Wnt/βcatenin 與NF-κB 兩條信號(hào)通路同時(shí)被激活，且存在交互串?dāng)_。鱉甲寡肽I-C-F-6 作為鱉甲煎丸中主要活性成分，0.12、0.24 mg/kg 經(jīng)皮下注射治療肝纖維化大鼠，共8 周。結(jié)果發(fā)現(xiàn)β-catenin 和p65 的表達(dá)均被抑制，說(shuō)明鱉甲寡肽I-C-F-6 可通過(guò)同時(shí)影響Wnt/β-catenin 和NF-κB 兩條信號(hào)通路而抑制肝星狀細(xì)胞的活化、增殖和下游靶基因的表達(dá)，發(fā)揮抗肝纖維化的作用。

3.4 Notch 信號(hào)通路

Notch 信號(hào)通路參與胚胎發(fā)育、組織形態(tài)建立、干細(xì)胞自我更新等多個(gè)生物過(guò)程，對(duì)維持機(jī)體正常再生和損傷修復(fù)的穩(wěn)態(tài)起到至關(guān)重要的作用。在肝臟再生過(guò)程中，Notch 信號(hào)可以誘導(dǎo)成熟細(xì)胞的分化和轉(zhuǎn)化，促進(jìn)損傷修復(fù)[37]。溫智稀等[38]探討了鱉甲煎丸對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的干預(yù)作用，通過(guò)提取大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并進(jìn)行體外培養(yǎng)，對(duì)比了肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子聯(lián)合成纖維生長(zhǎng)因子-4、鱉甲煎丸（1.1 g/kg）、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子加成纖維生長(zhǎng)因子-4 聯(lián)合鱉甲煎丸對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的干預(yù)作用，發(fā)現(xiàn)鱉甲煎丸可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化，合成白蛋白能力增加。采用免疫組化和RT-PCR 檢測(cè)證實(shí)鱉甲煎丸可上調(diào)Notch-1 蛋白和mRNA 表達(dá)，通過(guò)激活Notch 信號(hào)通路而促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為肝樣細(xì)胞，產(chǎn)生抗肝纖維化作用。黃晶晶等[39]研究證實(shí)鱉甲煎丸還可促進(jìn)干細(xì)胞歸巢，以CCl4誘導(dǎo)肝纖維化大鼠為模型，部分給予CXC 趨化因子受體4（CXCR4）拮抗劑，觀察干細(xì)胞移植組、鱉甲煎丸組（1.1 g/kg）、干細(xì)胞移植聯(lián)合鱉甲煎丸組對(duì)肝功能和病理組織的改善情況，結(jié)果表明鱉甲煎丸聯(lián)合干細(xì)胞移植改善肝纖維化效果最佳，可通過(guò)影響基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（SDF-1）/CXCR4 軸促進(jìn)干細(xì)胞歸巢，改善肝纖維化。因此，鱉甲煎丸聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療肝纖維化可能是通過(guò)激活Notch 信號(hào)通路和影響SDF-1/CXCR4 軸共同促進(jìn)干細(xì)胞遷移、歸巢、分化，發(fā)揮抗肝纖維化作用。

3.5 絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路

MAPK 信號(hào)通路是一種重要的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、凋亡等多個(gè)生物過(guò)程。MAPK 信號(hào)通路家族包括細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）、c-Jun 氨基末端激酶（JNK）、p38MAPK 等幾個(gè)主要分支。研究表明，TGF-β 受體通過(guò)激活下游ERK MAPK、p38 MAPK、PI3K 通路觸發(fā)上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化激活[40-41]。阻斷MAPK相關(guān)信號(hào)通路對(duì)于肝纖維化、肝癌的發(fā)展或許可能成為潛在的治療靶點(diǎn)。張藝凡等[42]對(duì)CCl4造模的肝纖維化大鼠給予0.55、1.1、2.2 g/kg 的鱉甲煎丸治療11 周，采用免疫組化和RT-PCR 法檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)鱉甲煎丸可降低PDGF、Ras、ERK1 蛋白的表達(dá)，且劑量越大抑制作用越明顯。該實(shí)驗(yàn)證實(shí)鱉甲煎丸可通過(guò)作用于PDGF 介導(dǎo)的Ras/ERK 信號(hào)通路發(fā)揮抗纖維化作用。p38 MAPK 具有激活肝星狀細(xì)胞、介導(dǎo)炎性反應(yīng)和影響膠原基因表達(dá)的作用。p38 MAPK 可調(diào)控α1（I）型膠原基因的表達(dá)，提高α1（I）型膠原mRNA 的穩(wěn)定性，增加I 型膠原的合成和沉積[43]。李風(fēng)華[15]以CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠為研究對(duì)象，分別給予鱉甲煎丸，連續(xù)11 周，采用免疫組化法測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鱉甲煎丸可降低p38 蛋白表達(dá)，且與劑量相關(guān)，提示其可通過(guò)抑制p38 MAPK 信號(hào)的傳導(dǎo)阻斷肝纖維化過(guò)程。

3.6 過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ（PPAR-γ）、核因子E2 相關(guān)因子（Nrf2）

PPAR-γ 是一種核受體，調(diào)控肝星狀細(xì)胞活化、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、脂肪代謝紊亂、衰老等導(dǎo)致的肝纖維化，具有保護(hù)肝臟作用[44-45]。Nrf2 是抗氧化、代謝和細(xì)胞保護(hù)基因的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，Nrf2的激活可促進(jìn)肝細(xì)胞增殖、抑制炎癥信號(hào)和改善代謝，促進(jìn)肝臟再生，減輕肝纖維化等作用[46-47]。卜夏威[48]以豬血清誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠為模型，分別給予維生素E（100 mg/kg）、依那普利（10 mg/kg）、鱉甲煎丸（10、20 g/kg）進(jìn)行預(yù)防和治療5 周，采用Western blotting 法測(cè)定，發(fā)現(xiàn)鱉甲煎丸可以上調(diào)PPAR-γ、IκBa、Nrf2 表達(dá)，抑制NF-κB、Kelch 樣ECH 相關(guān)蛋白1（Keap1）表達(dá)，且早期預(yù)防效果更佳。該實(shí)驗(yàn)揭示鱉甲煎丸通過(guò)抑制NF-κB 信號(hào)傳導(dǎo)提高PPAR-γ、Nrf2 信號(hào)表達(dá)，抑制肝星狀細(xì)胞活化和增殖，提高機(jī)體抗炎抗氧化能力而阻止肝纖維化進(jìn)展。王慧等[49]對(duì)CCl4造模的小鼠給予鱉甲煎丸（0.55、1.1、2.2 g/kg）治療4 周，采用Western blotting 法測(cè)定PPAR-γ 蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)鱉甲煎丸可升高PPAR-γ 蛋白水平，且呈劑量相關(guān)性。采用BSP法檢測(cè)小鼠肝臟PPAR-γ 啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)鱉甲煎丸可通過(guò)減少PPAR-γ 啟動(dòng)子甲基化，促進(jìn)PPAR-γ 表達(dá)，從而抑制肝星狀細(xì)胞活化、增殖，達(dá)到減輕肝纖維化作用。

3.7 腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）

RAAS 是一種主要調(diào)節(jié)體液平衡和血壓的激素系統(tǒng)，它通過(guò)一系列的反饋機(jī)制控制機(jī)體生理過(guò)程。當(dāng)肝臟受損時(shí)，RAAS 系統(tǒng)被激活，AngII 過(guò)度產(chǎn)生可直接刺激肝星狀細(xì)胞活化、TGF-β1 等促炎促纖因子的釋放、促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成、誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生，導(dǎo)致肝纖維化進(jìn)展。在肝臟纖維化過(guò)程中，RAAS 系統(tǒng)具有雙向調(diào)節(jié)的作用，ACE-AngII-AT1R促進(jìn)肝纖維化，ACE2-Ang（1-7）-Mas 抑制肝纖維化進(jìn)展[50]。因此，靶向RAAS 系統(tǒng)、恢復(fù)ACE-AngIIAT1R/ACE2-Ang（1-7）-Mas 軸平衡可作為肝纖維化治療的靶點(diǎn)。已有大量研究證實(shí)RAS 抑制劑在慢性肝臟疾病和肝細(xì)胞癌的治療作用和價(jià)值[51-52]。ACEI/ARB 類(lèi)藥物的使用可以顯著降低代償性肝硬化患者肝臟相關(guān)事件（肝癌、肝移植、腹水、肝性腦病、靜脈曲張出血等）發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[53]。Li 等[54]研究證實(shí)，對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠分別給予維生素E（100 mg/kg）、依那普利（10 mg/kg）、鱉甲煎丸（10、20 g/kg）治療6 周，采用ELISA、免疫組化、RT-PCR 法對(duì)RAAS 系統(tǒng)中各成分進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明鱉甲煎丸可以清除肝損傷大鼠體內(nèi)產(chǎn)生的過(guò)多的氧自由基，抑制ACE-AngII-AT1R 軸上各成分的表達(dá)，減少AngII 產(chǎn)生，促進(jìn)ACE2-Ang（1-7）-Mas 軸表達(dá)，逆轉(zhuǎn)軸失衡，改善肝纖維化進(jìn)展。馮振清等[17]將72 例慢性乙型肝炎合并肝硬化患者隨機(jī)分為兩組，分別給予阿德福韋酯以及阿德福韋酯聯(lián)合鱉甲煎丸治療2 個(gè)月，結(jié)果聯(lián)合鱉甲煎丸可有效改善肝功能，減少炎性因子釋放，降低患者血清AngII 水平，改善療效，阻止纖維化進(jìn)展。

4 調(diào)控細(xì)胞周期

細(xì)胞周期共分為4 個(gè)連續(xù)階段，分別為G1期（DNA 合成前期）、S 期（DNA 復(fù)制期）、G2期（有絲分裂前期）、M 期（有絲分裂期）。之后，細(xì)胞進(jìn)入了休眠狀態(tài)G0期，維持細(xì)胞的穩(wěn)定和功能，在某些刺激下會(huì)重新激活進(jìn)入G1期。細(xì)胞周期在G0/G1期和G2/M 期若發(fā)生改變，將影響有絲分裂的進(jìn)行，導(dǎo)致細(xì)胞增殖和分化異常。肝星狀細(xì)胞的活化、增殖、凋亡與細(xì)胞周期有密切關(guān)系[55]。樊爾艷等[56]將不同濃度的鱉甲煎丸含藥血清作用于HSC-T6 細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，采用CCK 法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HSC-T6的增殖、凋亡和各細(xì)胞周期細(xì)胞數(shù)變化。研究發(fā)現(xiàn)鱉甲煎丸可使HSC-T6 細(xì)胞停滯在G1期，阻止其進(jìn)入S 期而抑制HSC-T6 增殖，并誘導(dǎo)其凋亡，凋亡程度與劑量具有相關(guān)性。采用Western blotting 法測(cè)定凋亡蛋白表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鱉甲煎丸可上調(diào)促凋亡蛋白Bax 表達(dá)水平，對(duì)抗凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)無(wú)明顯影響。因此，鱉甲煎丸通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期抑制肝星狀細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)凋亡而發(fā)揮抗肝纖維化作用。

5 結(jié)語(yǔ)與展望

鱉甲煎丸是由23 味中藥組成的復(fù)方制劑，具有活血化瘀、軟堅(jiān)散結(jié)之功效，臨床上主要用于病毒性肝炎后肝纖維化和代謝相關(guān)脂肪性肝病纖維化的治療。大量臨床研究和薈萃分析證實(shí)，鱉甲煎丸可改善患者肝功能和肝纖維化指標(biāo)、減輕肝脾腫大、改善脾靜脈和門(mén)靜脈內(nèi)徑、聯(lián)合核苷（酸）類(lèi)藥物治療病毒性肝炎后肝纖維化可提高臨床治療的有效率等[57]。目前對(duì)于鱉甲煎丸治療肝纖維化的臨床研究仍存在局限性，對(duì)于其他病因（如膽汁淤積性、自身免疫性等）所致的肝纖維化、肝硬化的臨床療效，仍有待更多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究去驗(yàn)證。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突