基于網絡藥理學和分子對接探討白藜蘆醇治療乙型病毒性肝炎相關性肝癌的作用機制

吳成憲，王益，劉賦斌

武漢科技大學附屬天佑醫(yī)院，湖北 武漢 430000

肝細胞癌已成為世界范圍內癌癥死亡的主要原因。乙型病毒性肝炎是由于乙型肝炎病毒（HBV）感染導致，可引起個體患肝細胞癌的風險增加[1-2]。既往研究表明，我國是全球乙肝患者數(shù)量最多的國家，乙型病毒性肝炎患者的肝臟疾病進展與病毒的活性復制密切相關，發(fā)展到一定程度會引發(fā)肝細胞癌變[3-5]。這對人類的生存造成了極大的威脅，目前治療肝癌的主要手段是肝切除術，此外，新輔助治療、輔助治療、靶向治療、免疫治療等近年來也逐漸興起。白藜蘆醇是一種非黃酮類多酚有機化合物，是許多植物受到刺激時產生的一種抗毒素。既往研究表明葡萄內含有較為豐富的白藜蘆醇[6]，而體外實驗及動物實驗結果顯示白藜蘆醇有抗氧化、抗炎、抗癌及心血管保護等作用[7-11]。研究表明，白藜蘆醇可能通過調節(jié)蛋白激酶B（Akt）信號通路來治療乙型病毒性肝炎相關性肝癌，但其內在機制仍不明確[12-13]。

網絡藥理學是一門綜合了藥理學和計算機科學的交叉學科，其基于生物網絡平衡原理，用以解釋疾病的病理生理過程[14]。通過對廣泛數(shù)據庫的深度挖掘，建立了一個復雜的“藥物–靶點–疾病”相互作用網絡，著重強調了多靶點和多信號通路的調控機制。這一領域為中西醫(yī)結合治療提供了深遠的理論指導。本研究運用網絡藥理學和分子對接技術對白藜蘆醇在治療乙型病毒性肝炎相關性肝癌中的潛在靶點和信號通路進行了預測，并揭示了其可能的作用機制。這些結果為未來的臨床應用和深入研究提供了重要的學術支持。

1 材料與方法

1.1 白藜蘆醇靶點的篩選

通過數(shù)據庫PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）得到化合物白藜蘆醇化學結構，并保存對應Canonical SMILES 號，將得到的白藜蘆醇的SMILES 號分別輸入到 Swiss Target Prediction（https://swisstargetprediction.ch）和Target Net 數(shù)據庫（https://targetnet.scbdd.com）中，種屬定義為“Homo sapiens”“probability＞0”，剔除重復靶點后篩選得到白藜蘆醇的潛在靶點。

1.2 乙型病毒性肝炎相關性肝癌的靶點篩選

通過GeneCards（https://www.genecards.org）、OMIM（https://www.omim.org）、DisGeNET（https://www.disgenet.org/）數(shù)據庫對關鍵詞“hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma”進行檢索，種屬定義為“Homo sapiens”“score＞0”，剔除重復靶點后篩選得到乙型病毒性肝炎相關性肝癌的潛在靶點。

1.3 “藥物–疾病–靶點”網絡分析

將數(shù)據庫預測的白藜蘆醇的靶點和乙型病毒性肝炎相關性肝癌的靶點分別上傳到Venny 2.1.0平臺（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），得到白藜蘆醇和乙型病毒性肝炎相關性肝癌的交集靶點，并繪制白藜蘆醇與乙型病毒性肝炎相關性肝癌的交集靶點韋恩圖。

1.4 蛋白相互作用（PPI）網絡構建與分析

將篩選出的白藜蘆醇與乙型病毒性肝炎相關性肝癌交集靶點，導入STRING 數(shù)據庫（https://string-db.org），種屬定義為“Homo sapiens”進行分析，構建交集靶點的PPI 網絡，其閾值取“medium confidence”得到靶蛋白相互作用的核心網絡關系，將結果導出為TSV 格式并導入Cytoscape 3.7.2 軟件包，進一步繪制藥物靶蛋白和疾病PPI 網絡圖。通過網絡拓撲分析插件（Cytohubba）進行拓撲分析和計算，得到各個靶點的degree 值，篩選得到排名前10 名的靶標蛋白為核心靶點。

1.5 基因本體（GO）和京都基因組百科全書（KEGG）富集分析

為了解釋核心靶點對基因功能的影響，將以上選取的白藜蘆醇和乙型病毒性肝炎相關性肝癌交集靶點導入Metascape 數(shù)據庫（https://metascape.org）中，以P＜0.05 為篩選條件，獲得了對應的GO和KEGG 通路富集的結果，進一步使用“微生信”平臺對GO 分析與KEGG 富集分析進行可視化。隨后進行“藥物–靶點–通路”互作網絡的建立。

1.6 分子對接

通過進一步在 PubChem 數(shù)據庫 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）檢索獲取白藜蘆醇的3D結構式。在PDB 數(shù)據庫（https://www.rcsb.org）將前10 位核心靶點的PDB 格式進行下載。使用Pymol軟件對核心靶點去水和去配體，并保存。利用Autodock 軟件將degree 值前10 位核心靶點分別與白藜蘆醇進行分子對接，將對接結果導入PyMOL進行可視化。

2 結果

2.1 白藜蘆醇藥物靶點及乙型病毒性肝炎相關性肝癌疾病靶點的獲取

從Swiss Target Prediction 與Target Net 數(shù)據庫得到白藜蘆醇相關基因496 個；從GeneCards、OMIM、DisGeNET 數(shù)據庫篩選得到乙型病毒性肝炎相關性肝癌的基因整合去重后得到1 018個基因。

2.2 白藜蘆醇藥物靶點及乙型病毒性肝炎相關性肝癌疾病交集靶點的獲取

將得到的白藜蘆醇與乙型病毒性肝炎相關性肝癌靶點取交集并繪制韋恩圖，得到交集靶點48個，見圖1。

圖1 白藜蘆醇與乙型病毒性肝炎相關性肝癌靶點Venn 圖Fig.1 Venn diagram of resveratrol and hepatitis B virusrelated liver cancer targets

2.3 PPI 網絡分析及關鍵靶點篩選

在STRING 網站中提交白藜蘆醇–乙型病毒性肝炎相關性肝癌交集靶點進行PPI 網絡構建，物種選擇為“Home Sapiens”和“P＜0.05”，隱藏在網絡圖中未連接的點，最低置信度為0.400，見圖2。導出為“tsv”格式文件，將其導入Cytoscape 3.7.2 軟件，對PPI 網絡進行可視化，然后使用Cytoscape 中的Cytohubba 進行拓撲參數(shù)分析，degree 值越高表示該節(jié)點在所有靶點中越重要，取degree 值前10位的靶點為關鍵靶點，依次為腫瘤壞死因子（TNF）、基質金屬蛋白酶9（MMP9）、表皮生長因子受體（EGFR）、B 細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、趨化因子C-XC-基元受體4（CXCR4）、熱休克蛋白90α 家族A類成員1（HSP90AA1）、熱休克蛋白90α 家族B 類成員1（HSP90AB1）、前列腺素內過氧化物合酶2（PTGS2）、激酶插入區(qū)受體（KDR）、雌激素受體α（ESR1），見圖3。

圖2 交集靶點的PPI 網絡Fig.2 PPI network of intersection targets

圖3 基于degree 算法排名前10 位的核心靶點Fig.3 Top 10 core targets based on degree algorithm

2.4 GO 和KEGG 通路富集分析

將白藜蘆醇藥物靶點及乙型病毒性肝炎相關性肝癌疾病交集靶點導入Metascape 數(shù)據庫，設定P＜0.01 為篩選條件，分別進行GO 分析與KEGG富集分析，得到446 個分子功能（MF）、3 148 個生物過程（BP）、285 個細胞組分（CC）和205 條信號通路，其中MF 前8 位的分別是C-C 趨化因子受體活性、一氧化氮合酶調節(jié)子活性、內肽酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白結構域特異性結合、泛素蛋白連接酶結合、病毒受體活性、轉錄共激活因子結合。BP 前8 位分別是磷代謝過程的正調控、細胞遷移的正向調控、對無機物的響應、對激素的反應、第二信使介導的信號、管的形態(tài)發(fā)生、細胞對脂質的反應、組織形態(tài)發(fā)生。CC 前8 位分別是質膜外側、膜筏、胞體、細胞投射膜、細胞外基質、黏著斑、核膜、內質網腔。

KEGG 富集分析以P值由小到大的順序排列，結果癌癥中的通路、脂質與動脈粥樣硬化、前列腺癌、癌癥中的蛋白聚糖、趨化因子信號通路、白細胞介素（IL）-17 信號通路、人巨細胞病毒感染、人類免疫缺陷病毒1 型感染、糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終末產物–晚期糖基化終末產物受體（AGERAGE）信號通路；缺氧誘導因子-1（HIF-1）信號通路等。使用“微生信”平臺對GO、KEGG 富集分析得到的結果繪制氣泡圖，見圖4。進一步繪制“藥物–靶點–通路”互作網絡，見圖5。

圖5 “藥物–靶點–通路”互作網絡Fig.5 “Drug– target -pathway”interaction network

2.5 分子對接分析

對Cytoscape 使用拓撲分析得到的10 個關鍵靶標TNF、MMP9、EGFR、Bcl-2、CXCR4、HSP90AA1、HSP90AB1、PTGS2、KDR、ESR1，分別和白藜蘆醇進行分子對接，對接結合能均小于0，結合能越小則越容易結合，結合能越小配體與靶點之間的結合越穩(wěn)定，對接結合能見表1。利用Autodock4 導出的對接化合物結果導入Pymol 中，利用Pymol 對化合物進行分子三維展示，見圖6。

表1 核心靶點的分子對接結合能Table 1 Molecular docking binding energy of core targets

圖6 白藜蘆醇與關鍵靶點的分子對接三維示意圖Fig.6 3D schematic diagram of molecular docking of resveratrol with key targets

3 討論

白藜蘆醇是多酚類型化合物的一種，其具有抗癌、抗菌、抗炎等藥理作用[15]，既往的研究表明，白藜蘆醇具備多種影響癌細胞生物學行為的特性，包括對癌細胞的增殖、凋亡和血管生成過程的干預，這些作用可顯著地抑制多種腫瘤的發(fā)展[16-17]。此外，白藜蘆醇還能夠逆轉癌細胞對多種藥物的耐藥性；當與臨床藥物聯(lián)合使用時，白藜蘆醇不僅能夠提高癌細胞對化療藥物的敏感性[18-19]，還以劑量相關性的方式刺激淋巴細胞減少、IL-2 的釋放，增加IL-4 的分泌，從而進一步增強抗癌治療效果[20]。本研究基于網絡藥理學研究白藜蘆醇對乙型病毒性肝炎相關性肝癌的潛在作用機制，完成了藥物及疾病的靶點篩選、PPI 分析、功能富集分析、藥物–疾病–靶點–通路分析、分子對接模型的構建。利用生物信息學數(shù)據庫，確定了48 個白藜蘆醇治療乙型病毒性肝炎相關性肝癌的靶基因，這表明白藜蘆醇對乙型病毒性肝炎相關性肝癌具有一定的抗癌作用。通過Cytoscape 的拓撲分析顯示，TNF、

MMP9、EGFR、Bcl-2、CXCR4、HSP90AA1、HSP90AB1、PTGS2、KDR、ESR1 為白藜蘆醇對乙型病毒性肝炎相關性肝癌作用的關鍵靶點。既往的研究表明白藜蘆醇通過調節(jié)TNF-β 信號通路，從而抑制MMP9、CXCR4 在腫瘤細胞中的激活[21-22]。此外，NK 細胞通過釋放TNF-α 等抗癌細胞因子來誘導腫瘤細胞凋亡[23]，而白藜蘆醇能增強NK 細胞的活性及抗癌能力[24]。EGFR 過度活化會引起磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt 信號通路的過度活化，從而引起腫瘤細胞的增殖[25]。在體外實驗中，白藜蘆醇處理人子宮癌細胞系（HeLa）細胞，發(fā)現(xiàn)HeLa 細胞中EGFR 顯著下調[26]，這表明白藜蘆醇能夠下調EGFR 從而抑制腫瘤細胞的增殖。有研究表明，白藜蘆醇能夠增加腫瘤蛋白p53 與p53 靶基因的表達，其中就包括了Bcl-2[27-28]，從而促進腫瘤細胞的凋亡[29]。既往的研究表明，白藜蘆醇具有抗腫瘤作用，而熱休克蛋白（HSP）的缺失，能夠增強白藜蘆醇對癌細胞的促凋亡作用[30]，相反HSP 的激活反而能夠抑制細胞凋亡[31]。Che 等[32]研究表明，白藜蘆醇通過降低PTGS2 從而抑制肝細胞癌的進展和促進細胞凋亡。Kiamehr 等[33]的研究表明低劑量的白藜蘆醇可促進血管生成，而高劑量的白藜蘆醇會抑制VEGFR-2 磷酸化、抑制腫瘤血管生成、誘導腫瘤細胞凋亡。有研究表明，在人肝癌樣本中ESR1 的表達上調，而在體外使用白藜蘆醇處理人肝癌細胞發(fā)現(xiàn)ESR1 表達下調，這提示ESR1可能作為白藜蘆醇發(fā)揮抗肝癌的藥物靶點[34]。

GO 功能富集分析顯示，交集靶點主要參與的BP 包括磷代謝過程的正調控、細胞遷移的正向調控、對無機物的響應；參與的MF 主要包括C-C 趨化因子受體活性、一氧化氮合酶調節(jié)子活性、內肽酶活性等；CC 主要包括質膜外側、膜筏、胞體、細胞投射膜、細胞外基質等。KEGG 富集通路分析顯示，白藜蘆醇治療乙型病毒性肝炎相關性肝癌的主要作用通路包括癌癥中的通路、脂質與動脈粥樣硬化、前列腺癌、癌癥中的蛋白聚糖、趨化因子信號通路、IL-17 信號通路等。蛋白聚糖在癌癥血管生成、增殖、侵襲和轉移中起著重要作用[35]，此外，蛋白聚糖通過影響細胞代謝、調節(jié)細胞生長和凋亡信號、促進細胞侵襲和參與免疫破壞的作用來促進肝癌的發(fā)生與發(fā)展[36]。趨化因子在先天性與適應性免疫中起積極作用，其由CXC、CC、C 或CX3C 亞型組成[37]，CXCR4 常常在惡性腫瘤中過度表達，CXCRL12/CXCR4 軸通過調節(jié)血管生成，誘導上皮間充質轉化，從而促進癌癥的進展與轉移[38]。近來越來越多的研究表明IL-17 在癌癥的形成中起重要作用[39]，其中的IL-17A 是一種促進腫瘤生長的細胞因子，有研究表明IL-17A 阻斷劑可預防高危患者發(fā)生肝細胞癌[40-41]。有學者提出，IL-17 同樣能通過促進組織慢性炎癥來加快腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[42]。在動物實驗中，人巨細胞病毒（CMV）能夠限制腫瘤細胞增殖并增強腫瘤細胞凋亡，此外，有很多的實驗模型發(fā)現(xiàn)，CMV 感染能夠減緩腫瘤細胞增殖并促進內在半胱天冬酶癌細胞凋亡[43]，1 項研究中同樣發(fā)現(xiàn)在肝癌患者接受肝移植后，CMV 感染能夠降低肝癌的復發(fā)風險[44]。在人類免疫缺陷病毒1型（HIV-1）感染患者中，常常伴隨著HBV 感染，是肝細胞癌發(fā)生的最重要危險因素[45]。AGE 與其受體RAGE 結合能增加氧化應激和炎癥反應，這共同促進腫瘤的發(fā)生[46]。此外，AGEs-RAGE 信號通路通過對細胞凋亡的負反饋調節(jié)和對自噬、壞死性凋亡等促生存機制介導的DAMPs 釋放來促進癌細胞的生長[47]。HIF-1 是在缺氧癌細胞中代謝重編程的關鍵調節(jié)劑，癌細胞在缺氧狀態(tài)下發(fā)生代謝重編程，進而促進腫瘤細胞的存活與增殖[48]。

分子對接結果顯示，白藜蘆醇與核心靶點（TNF、MMP9、EGFR、Bcl-2、CXCR4、HSP90AA1、HSP90AB1、PTGS2、KDR、ESR1）具有良好的對接活性，這表明白藜蘆醇可能是通過作用于TNF、BCL2、CXCR4、EGFR 等核心靶點來調節(jié)AGERAGEs 信號通路、IL-17 信號通路、HIF-1 信號通路、趨化因子通路等多條信號通路來發(fā)揮治療乙型病毒性肝炎相關性肝癌的作用。

綜上，通過網絡藥理學與分子對接的方式，預測了白藜蘆醇治療乙型病毒性肝炎相關性肝癌多靶點、多通路的機制，總結出白藜蘆醇可能通過TNF、BCL2、CXCR4、EGFR 等多個靶點，調節(jié)AGERAGE 信號通路、IL-17 信號通路、HIF-1 信號通路、趨化因子通路等多條信號通路，進而抑制腫瘤細胞增殖、抑制腫瘤血管生成、促進腫瘤細胞凋亡等來發(fā)揮治療乙型病毒性肝炎相關性肝癌的作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突