布瓦西坦片在健康受試者中的生物等效性研究

徐滿，秦月雯，賴健明，曾潔萍，程玲*

1.江西青峰藥業(yè)有限公司，江西 贛州 341000

2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，四川 成都 610000

流行性病學(xué)調(diào)查顯示，我國約有900 萬以上的癲癇患者，并且每年有65～70 萬新發(fā)癲癇患者[1]。布瓦西坦是第2 代抗癲癇藥左乙拉西坦吡咯烷烴的4 位碳原子連接正丙基衍生物，由比利時(shí)優(yōu)時(shí)比制藥公司研發(fā)，用于治療成人、青少年和2 歲以上兒童部分性癲癇發(fā)作[2]。布瓦西坦對突觸囊泡蛋白2A具有高親和力，是左乙拉西坦的15～30 倍，且易透過血腦屏障，顯著提高了其抗癲癇活性[3]。布瓦西坦口服吸收迅速，絕對生物利用度約為100%，具有良好的安全性和藥動(dòng)學(xué)特征，特別是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的良好耐受性是其優(yōu)于其他抗癲癇藥物的主要原因[2]。空腹服用布瓦西坦片，達(dá)峰時(shí)間（tmax）0.25～3 h，中位數(shù)為1 h，進(jìn)食高脂餐后布瓦西坦的吸收減緩，tmax中位數(shù)為3 h，最大血漿濃度降低37%，但吸收總量不變[4]。布瓦西坦與血清蛋白質(zhì)結(jié)合率較低（≤20%）。布瓦西坦主要通過乙酰胺基團(tuán)的水解和丙基側(cè)鏈羥基化，在體外，布瓦西坦羥基化主要由CYP2C19 介導(dǎo)，代謝無藥理活性[5]。超過95%的劑量（包括代謝物）在72 h 內(nèi)通過腎臟排泄，終末血漿半衰期（t1/2）約為9 h[4]。瓦西坦尚未在我國批準(zhǔn)進(jìn)口，2019 年6 月國家衛(wèi)生健康委員會(huì)公布《關(guān)于第一批鼓勵(lì)仿制藥品目錄建議清單的公示》，涉及34 個(gè)品種，布立西坦名列其中，因此仿制該藥對于我國癲癇患者的治療具有重要意義。本研究建立了快速、靈敏、準(zhǔn)確的UPLC-MS/MS 法測定布瓦西坦的血藥濃度，評價(jià)自制布瓦西坦片與原研布瓦西坦片在健康受試者中的生物等效性。

1 材料與對象

1.1 儀器

LC-20ADXR 高效液相色譜儀（日本島津公司），包括CBM-20A Lite 系統(tǒng)控制器，LC-20ADXR液相泵，DGU-20A5R 脫氣機(jī)，CTO-20AC 柱溫箱；Turbo Spray 離子源（Applied Biosystems/Sciex）；API4000 質(zhì)譜儀（Applied Biosystems/Sciex）配有電噴霧離子化源（ESI）、Analyst 1.6.3 數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)。

1.2 藥品與試劑

布瓦西坦片受試制劑（T），規(guī)格50 mg/片，江西青峰藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號20 181114；布瓦西坦片參比制劑（R），規(guī)格50 mg/片，UCB Pharma S.A.公司生產(chǎn)，批號224103。布瓦西坦對照品，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%，TRC 公司，批號1-NYL-116-1；內(nèi)標(biāo)布瓦西坦-d7對照品，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%，TLC 公司，批號3263-001A5。甲醇、乙腈為色譜純（Merck KgaA 公司），醋酸銨、甲酸為ACS 級（Sigma-Aldrich 公司）。

1.3 研究對象

空腹試驗(yàn)共篩選58 例18 歲以上健康成年受試者，最終入組28 例，其中男性18 例，女性10 例，年齡（24.43±4.22）歲，身高（165.75±8.23）cm，體質(zhì)量（58.79±8.72）kg，身體質(zhì)量指數(shù)（21.26±1.93）kg/m2。餐后試驗(yàn)共篩選53 例受試者，最終入組28 例，其中男性19 例，女性9 例，年齡（25.93±5.29）歲，身高（165.04±8.43）cm，體質(zhì)量（59.45±8.09）kg，身體質(zhì)量指數(shù)（21.70±1.81）kg/m2。入組的受試者均完成試驗(yàn)，均納入全分析集、安全性分析集、藥動(dòng)學(xué)濃度集。所有受試者均自愿簽訂知情同意書。編號C003 受試者因方案違背，剔除參數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析；編號C005 受試者在第2周期發(fā)生嘔吐，剔除其數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。本研究經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的審查同意，倫理批件號2018ZL-016。

2 方法與結(jié)果

2.1 給藥方案

空腹和餐后試驗(yàn)均采用單中心、單劑量、隨機(jī)、開放、兩周期、交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)。采用區(qū)組隨機(jī)法將受試者分配至2 個(gè)給藥順序組，每組14 人。每個(gè)周期給藥1 次，清洗期為7 d。空腹試驗(yàn)給藥前禁食至少10 h，餐后試驗(yàn)服用高脂餐前禁食至少10 h，于給藥前30 min 依次進(jìn)食高脂高熱餐，隨后按照隨機(jī)表分別單次給予布瓦西坦片受試制劑或參比制劑50 mg 即1 片，用240 mL 溫水送服。服藥前后1 h 內(nèi)禁止飲水。

2.2 樣本采集

受試者于給藥當(dāng)天早晨埋留置針?？崭乖囼?yàn)時(shí)每個(gè)周期采集18 管靜脈血，分別在給藥0 min（給藥前60 min 內(nèi)）及給藥后10、20、30、45 min 以及1、1.25、1.5、2、2.5、3、4、6、8、12、24、36、48 h 由外周靜脈采血約4 mL；餐后試驗(yàn)時(shí)每個(gè)周期采集19 管靜脈血，分別在給藥0 min（給藥前60 min 內(nèi)）及給藥后0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、2.75、3、3.25、3.5、4、5、6、9、12、24、36、48 h 由外周靜脈采血約4 mL。各時(shí)間點(diǎn)采集的血樣置于K2EDTA 真空采血管中，4 ℃下2 500×g離心10 min，取上層血漿置凍存管中，置?20 ℃冰箱，備用。

2.3 LC-MS/MS 法測定布瓦西坦

2.3.1 色譜條件 Kinetex 2.6 μm XB-C18100? 色譜柱（50 mm×2.1 mm，2.6 μm）；流動(dòng)相：含0.1%甲酸和5 mmol/L 醋酸銨的水溶液（A）–100%甲醇（B），梯度洗脫（0～0.40 min 43% B，0.40～1.90 min 43%～50% B，1.90～3.00 min 100% B，3.00～4.00 min 100%～43% B）；體積流量：0.350 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣室溫度：8 ℃；進(jìn)樣量：5.00 μL。

2.3.2 質(zhì)譜條件 電離模式：ESI 電噴霧離子化源（正離子方式）；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測模式；離子源噴霧電壓：3 500 V；離子源溫度：600 ℃；氣簾氣：35 psi（1 psi＝6 895 Pa）；霧化氣：30 psi；輔助氣：50 psi；接口加熱：ON；碰撞氣：6 Unit；Q1、Q3 分辨率均為Unit。用于定量分析的反應(yīng)離子對：布瓦西坦m/z213.1→168.1，布瓦西坦-d7220.1→175.2，去簇電壓分別為50、60 V，射入電壓均為9 V，碰撞電壓分別為19、20 V，碰撞室射出電壓分別為15、14 V，掃描時(shí)間為0.2 s。

2.3.3 溶液的配制

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線儲備液的配制：取適量布瓦西坦對照品，質(zhì)量校正系數(shù)校正后溶于甲醇，制得1.00 mg/mL 儲備液，于透明玻璃瓶、?20 ℃條件下保存。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液的配制：用50%甲醇溶液稀釋儲備液配制成質(zhì)量濃度為5.00（LLOQ）、10.00、50.00、200.00、600.00、1 500.00、2 400.00、3 000.00 ng/mL（ULOQ）標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液，貯存于透明聚丙烯管中，于?20 ℃條件下保存。

（3）內(nèi)標(biāo)儲備液和工作溶液的配制：取1 支布瓦西坦-d7對照品，經(jīng)質(zhì)量校正系數(shù)校正后，將其溶于甲醇中，得到1.00 mg/mL 內(nèi)標(biāo)儲備液，于棕色玻璃瓶、?20 ℃條件下保存。用50%甲醇溶液稀釋內(nèi)標(biāo)儲備液以配制內(nèi)標(biāo)工作溶液，并將其貯存于透明聚丙烯管中，于?20 ℃條件下保存。

（4）質(zhì)控（QC）樣品的配制：以人血漿（以K2EDTA 作為抗凝劑）作為空白基質(zhì)配制質(zhì)控樣品，用50%甲醇溶液稀釋布瓦西坦儲備液，配制成12.00（LQC）、500.00（MQC）、2 250.00（HQC）、6 000.00（DQC）ng/mL 的質(zhì)控樣品溶液，并將其貯存于透明聚丙烯管中，于?20 ℃條件下保存。

2.3.4 血漿樣本處理 待測樣品（待測生物樣品、標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品、質(zhì)控樣品）室溫融化渦旋混勻后，向96 孔板中加入50.0 μL 樣品（待測生物樣品、標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品、質(zhì)控樣品）；對于雙空白樣品和零點(diǎn)樣品，加入50.0 μL 空白人血漿。向除雙空白樣品和不含內(nèi)標(biāo)的定量上限樣品外的所有樣品中加入30.0 μL 500 ng/mL 內(nèi)標(biāo)工作溶液；對于雙空白樣品和不含內(nèi)標(biāo)的定量上限樣品中，加30.0 μL 50%甲醇溶液。將96 孔板充分振搖1 min 后向所有樣品孔中加入400 μL 乙腈，密封振搖10 min 后將96 孔板在室溫條件下以4 000 r/min 離心10 min。轉(zhuǎn)移30.0 μL上清液至干凈的96 孔板中，將所有的樣品上清液用270 μL 50%甲醇溶液稀釋，充分振搖10 min 后置于自動(dòng)進(jìn)樣器中，進(jìn)行HPLC-MS/MS 分析。

2.3.5 選擇性試驗(yàn) 在6 個(gè)不同來源的單個(gè)空白基質(zhì)中，待測物、內(nèi)標(biāo)干擾峰的平均響應(yīng)（峰面積）不超出定量下限標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品平均響應(yīng)的0.0%。制備3 個(gè)重復(fù)的零點(diǎn)樣品以考察內(nèi)標(biāo)對分析物測定的干擾，在空白樣品中加入定量上限濃度的分析物而不加內(nèi)標(biāo)，配制不含內(nèi)標(biāo)的定量上限樣品考察分析物對內(nèi)標(biāo)測定的干擾，不加內(nèi)標(biāo)的定量上限樣品、零點(diǎn)樣品中待測物干擾峰的平均響應(yīng)均不超出定量下限標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品平均響應(yīng)的0.0%。取20.0 μL冷凍全血加入980 μL 空白血漿得溶血基質(zhì)，將20%英脫利匹特加入941 μL 空白血漿，制得高脂基質(zhì)，在高脂、溶血基質(zhì)配制的雙空白樣品中，在待測物或內(nèi)標(biāo)保留時(shí)間附近沒有顯著干擾。見圖1。

圖1 布瓦西坦的HPLC-MS/MS 典型色譜圖Fig.1 Typical HPLC-MS/MS chromatograms of brivaracetam

2.3.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量下限 根據(jù)2.3.3（1）項(xiàng)下加入到人空白血漿中配制5.00、10.00、50.00、200.00、600.00、1 500.00、2 400.00、3 000.00 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)曲線樣本溶液。通過使用權(quán)重因子1/x2，采用Watson LIMS 7.5 SP1 軟件回歸，線性回歸得到理論質(zhì)量濃度與響應(yīng)之間的線性關(guān)系進(jìn)行定量，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y＝5.614×10?3X－2.621×10?4（R2＝0.998 7），線性范圍為5.00～3 000.00 ng/mL。最低定量下限為5.00 ng/mL。

2.3.7 準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn) 5.00 ng/mL（LLOQ QC）、12.00 ng/mL（LQC）、500.00 ng/mL（MQC）、2 250.00 ng/mL（HQC）質(zhì)控樣每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)6次評估準(zhǔn)確度和精密度，4 個(gè)質(zhì)量濃度水平的質(zhì)控樣品檢測結(jié)果的批內(nèi)、批間精密度RSD 值均小于5.8%，準(zhǔn)確度偏差為?3.2%～12.8%。見表1。

表1 準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn)結(jié)果（，n=6）Table 1 Results of accuracy and precision tests (,n=6)

表1 準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn)結(jié)果（，n=6）Table 1 Results of accuracy and precision tests (,n=6)

2.3.8 稀釋可靠性試驗(yàn) 配制一個(gè)質(zhì)量濃度超過定量上限的稀釋質(zhì)控樣品DQC（6 000.00 ng/mL）和高質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品HQC（2 250.00 ng/mL），然后用空白人血漿將質(zhì)控樣品稀釋，使其質(zhì)量濃度落在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)。在2 250.00～6 000.00 ng/mL，質(zhì)控樣品待測物平均測定準(zhǔn)確度偏差為2.7%（HQC：2 250.00 ng/mL）、?5.2%（DQC：6 000.00 ng/mL），測定精密度RSD 值小于2.4%。因此，稀釋因子為1∶5 時(shí)具有良好的稀釋可靠性。

2.3.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 布瓦西坦血漿樣品在室溫下放置20.2 h 穩(wěn)定性良好，在?20、?70 ℃條件下5 次凍融循環(huán)穩(wěn)定性良好，在?20、?70 ℃條件下長期冰凍56 d 穩(wěn)定性良好，血漿樣品處理后的上清液在8 ℃自動(dòng)進(jìn)樣器中放置7 d 穩(wěn)定性良好，見表2。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（，n=3）Table 2 Results of stability test (,n=3)

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（，n=3）Table 2 Results of stability test (,n=3)

2.3.10 基質(zhì)效應(yīng) 以6 個(gè)不同來源的空白人血漿制備的雙空白樣品，提取之后加入待測物和內(nèi)標(biāo)，以使其最終質(zhì)量濃度分別與12.00、500.00、2 250.00 ng/mL 質(zhì)控樣品的進(jìn)樣質(zhì)量濃度一致，同時(shí)配制含有一定量待測物和內(nèi)標(biāo)的純?nèi)芤?，其最終質(zhì)量濃度分別與12.00、500.00、2 250.00 ng/mL 質(zhì)控樣品的進(jìn)樣質(zhì)量濃度一致。通過計(jì)算基質(zhì)存在下的峰面積與不含基質(zhì)的峰面積的比值，計(jì)算每一個(gè)待測物和內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)因子。進(jìn)一步通過待測物的基質(zhì)因子除以內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)因子，計(jì)算經(jīng)內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子（基質(zhì)效應(yīng)因子＝基質(zhì)樣品峰面積平均值/對照溶液峰面積平均值）。6 個(gè)不同來源的單個(gè)基質(zhì)在12.00、500.00、2 250.00 ng/mL 水平下，內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子均值為98.6%～101.9%，精密度RSD 值≤0.7%，3 個(gè)質(zhì)量濃度水平內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子平均值為100.6%，精密度RSD 值為1.7%。高脂基質(zhì)12.00、2 250.00 ng/mL 水平的質(zhì)控樣品準(zhǔn)確度偏差均值分別為3.3%、?2.8%，精密度≤4.8%。溶血基質(zhì)12.00、2 250.00 ng/mL 水平的質(zhì)控樣品準(zhǔn)確度偏差均值分別為1.7%、?4.1%，精密度RSD 值≤2.7%。上述結(jié)果表明，各類基質(zhì)對血漿中的布瓦西坦無顯著影響，不影響定量分析。

2.3.11 提取回收率試驗(yàn) 內(nèi)標(biāo)測定質(zhì)量濃度為500.00 ng/mL，待測物測定質(zhì)量濃度為定量范圍內(nèi)3個(gè)質(zhì)量濃度水平12.00、500.00、2 250.00 ng/mL。6個(gè)重復(fù)的12.00、500.00、2 250.00 ng/mL 質(zhì)控樣品（LQC、MQC、HQC）與18 個(gè)雙空白樣品一同處理。處理后，將含有待測物和內(nèi)標(biāo)的溶液加入空白人血漿制備的雙空白樣品中，以使其最終質(zhì)量濃度與12.00、500.00、2 250.00 ng/mL 質(zhì)控樣品的進(jìn)樣質(zhì)量濃度一致。通過比較單個(gè)質(zhì)控樣品中待測物或內(nèi)標(biāo)響應(yīng)值與提取后加入待測物、內(nèi)標(biāo)的雙空白樣品的響應(yīng)值，計(jì)算回收率（回收率＝提取后樣品峰面積/未經(jīng)提取峰面積平均值）。血漿樣品中布瓦西坦的提取回收率為96.3%～99.6%，在12.00、500.00、2 250.00 ng/mL 下的平均提取回收率分別為97.1%、96.3%、99.6%。內(nèi)標(biāo)布瓦西坦-d7的回收率為95.5%。

2.3.12 殘留 在批量樣品檢測過程中的殘留結(jié)果為待測物殘留0～6.8%，內(nèi)標(biāo)殘留0～0.1%，不影響定量分析。

殘留＝雙空白樣品中待測物或內(nèi)標(biāo)的最大峰面積/該分析批LLOQ（5.00 ng/mL）標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品最小峰面積值

2.4 藥動(dòng)和生物等效性研究

2.4.1 血藥濃度–時(shí)間曲線 根據(jù)測定的血藥濃度繪制血藥濃度–時(shí)間曲線，空腹和餐后試驗(yàn)中受試者口服受試試劑、參比制劑的血藥濃度–時(shí)間曲線見圖2。

圖2 空腹（A）和餐后（B）受試者口服受試制劑、參比制劑后布瓦西坦的平均血藥濃度-時(shí)間曲線Fig.2 Mean concentration-time curves of brivaracetam in subjects after po administered with test and reference preparation under fasting (A) and fed (B) condition

2.4.2 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)和統(tǒng)計(jì)分析 使用 Phoenix WinNonlin 8.1 軟件，按照非房室模型并基于實(shí)際采血時(shí)間點(diǎn)計(jì)算每位受試者的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，包括Cmax、AUC0-t、AUC0-∞、tmax、t1/2、λz和AUC%Extrap，主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)為Cmax、AUC0-t、AUC0-∞?？崭购筒秃鬆顟B(tài)下口服布瓦西坦片的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表3。

表3 空腹和餐后口服布瓦西坦片的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Table 3 Main pharmacokinetic parameters after po Brivaracetam Tablets under fasting or fed condition

2.4.3 生物等效性評價(jià) 基于生物等效性分析集（BES），采用SAS 9.4 軟件進(jìn)行兩個(gè)制劑藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的推斷性統(tǒng)計(jì)分析。對受試制劑、參比制劑的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Cmax、AUC0-t、AUC0-∞進(jìn)行自然對數(shù)轉(zhuǎn)換，進(jìn)行線性混合效應(yīng)模型分析，基于主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（AUC0-∞、AUC0-t和Cmax）的線性混合效應(yīng)模型分析，計(jì)算兩個(gè)制劑主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（AUC0-∞、AUC0-t和Cmax）幾何均數(shù)比值及其90%置信區(qū)間，并采用雙單側(cè)t檢驗(yàn)進(jìn)行生物等效性判定。受試制劑相對參比制劑的AUC0-∞、AUC0-t和Cmax幾何均數(shù)比值的90%置信區(qū)間在80.00%～125.00%則認(rèn)為兩制劑生物等效?？崭埂⒉秃笊锏刃栽u價(jià)結(jié)果見表4。結(jié)果表明，在空腹和餐后狀態(tài)下口服布瓦西坦受試制劑、參比制劑的幾何均值比、90%置信區(qū)間均在等效區(qū)間范圍內(nèi)，二者具有生物等效性。

表4 空腹和餐后狀態(tài)下布瓦西坦片主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的生物等效性分析Table 4 Bioequivalence analysis of main pharmacokinetic parameters of Brivaracetam Tablets under fasting condition and fed condition

3 討論

布瓦西坦作用機(jī)制獨(dú)特，主要通過突觸囊泡蛋白2A 高親和作用和鈉離子通道抑制作用，具有較好的抗癲癇活性。布瓦西坦在體內(nèi)吸收迅速，空腹給藥受試制劑在0.34 h 即可達(dá)峰，較參比制劑和既往文獻(xiàn)報(bào)道更迅速[6]，其半衰期約為9 h。

餐后試驗(yàn)中，受試試劑、參比制劑的吸收較空腹試驗(yàn)均延遲了約2 h，這可能與食物能降低胃排空速率有關(guān)[7]，進(jìn)食后吸收程度無顯著差異，這與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致[4]?？崭菇o藥相對餐后給藥的療效更快，生物利用度更高，在充分考慮藥物安全性的情況下為了提高藥物臨床療效，可優(yōu)先選擇空腹服藥。

本研究進(jìn)行的餐后和空腹試驗(yàn)中，布瓦西坦片的Cmax、AUC0-t、AUC0-∞、tmax和t1/2與既往試驗(yàn)中的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)基本一致，與原研進(jìn)行的試驗(yàn)中得到的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)無明顯差別[3,6,8]。

本研究建立了LC-MS/MS 法測定人血漿中布瓦西坦，方法快速、準(zhǔn)確、選擇性高、穩(wěn)定性好，適用于布瓦西坦的藥動(dòng)學(xué)研究。健康受試者空腹口服試驗(yàn)結(jié)果表明布瓦西坦受試制劑與參比制劑具有類似的藥動(dòng)學(xué)特性、生物等效。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突